CC BY-ND
24
март №3 (264)
25
УДК 579.843.1:575.25:470.61 о ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕОДНОРОДНОСТЬ ПОПУЛЯЦИИ
сБ VIBRIO CHOLERAE NONO1/NONO139, ВЫДЕЛЕННЫХ В РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
-эт И.В. Архангельская, Н.Б. Непомнящая, Е.В. Монахова, А.С. Водопьянов,
^^ С.О. Водопьянов, В.Д. Кругликов
^ ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,
г-ь г. Ростов-на-Дону, Россия
При сравнительном анализе свойств холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп, выделенных на территории Ростовской области от госпитализированных больных с диагнозом диареи и из окружающей среды, коррелятивных связей между их серогрупповой принадлежностью, VNTR- и ПЦР-генотипами выявлено не было, однако вызванные ими заболевания характеризовались сходным клиническим течением. Возможно, генетическая неоднородность популяции способствует формированию наиболее жизнеспособных клонов, обладающих патогенетическим потенциалом.
Ключевые слова: холерные вибрионы неО1/неО139, серогруппа, генотип, факторы патоген-ности.
I.V. Arkhangelskaya, N.B. Nepomnyaschaya, E.V. Monakhova, A.S. Vodopyanov, S.O. Vodopyanov, V.D. Kruglikov □ GENETIC DIVERCITY OF THE POPULATION OF VIBRIO CHOLERAE NONO1/NONO139 CIRCULATING IN ROSTOV REGION □ FSHE «Rostov-on-Don Anti-Plague Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Rostov-on-Don, Russia.
Comparative analysis of characteristics of Vibrio cholerae nonO1/nonO139 strains isolated in Rostov region from hospitalized diarrheal patients and environment revealed none correlation between their serogroup affiliation, VNTR- and PCR-genotypes. However, the clinical picture of the caused diseases was similar. The genetic diversity of the population is likely to be conductive to the emergence of the most viable clones possessing pathogenic potential.
Key words: Vibrio cholerae nonO1/nonO139, serogroup, genotype, pathogenicity factors.
Холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп наряду с парагемолитическими и другими гало-фильными вибрионами играют значительную роль в этиологии острых кишечных инфекций (ОКИ) различной степени тяжести, которые постоянно регистрируются на территории России [3—5], в том числе и в Ростовской области, где только в 2014 г. от госпитализированных больных было выделено 11 штаммов. Спорадические случаи и даже вспышки ОКИ, вызванные Vibrio cholerae nonO1/nonO139, отмечались в регионе с 1968 г. [3]. Заболевшие проживали на берегах рек Ростовской области и на побережье Азовского моря (в г.г. Ростове, Таганроге, Новочеркасске, на хуторе Веселый), их возраст варьировался от 4 месяцев до 79 лет, симптоматика заболеваний укладывалась в рамки диагнозов ОКИ, гастроэнтерита и энтероколита. У детей в анамнезе чаще упоминалось купание в водоемах, взрослые же связывали развитие диареи с употреблением пищевых продуктов.
Клинические штаммы Vibrio cholerae nonO1/ nonO139, выделенные в Ростовской области с 2000 по 2010 гг., лишены генов холерного токсина, и их вирулентность связана, очевидно, с экспрессией детерминант других факторов патогенности, о «взаимозаменяемости» которых свидетельствовала крайняя генотипическая изменчивость популяции возбудителей [3]. Однако для выяснения причин сохранения возбудителей на данной территории на протяжении полувека необходимы данные о свойствах штаммов, вызывавших заболевания в предшествующие и последующие годы, а также данные о штаммах, выделенных из источников окружающей среды.
Целью настоящего исследования явилось ПЦР-и VNTR-типирование штаммов V. cholerae nonO1/ nonO139, выделенных на территории Ростовской области с 1968 по 2014 гг.
Материалы и методы. В работе использовано 127 клинических штаммов, выделенных с 1968 по 2014 гг., и 42 штамма, изолированных при мониторинговых исследованиях Таганрогского залива Азовского моря в 2011—2012 гг. Фенотипические свойства определяли общепринятыми методами, серотипи-рование проводили с помощью набора сывороток к 80 серогруппам, полученных в Ростовском-на-Дону научно-исследовательском противочумном институте, УОТЯ- и ПЦР-типирование [1—3] — с использованием специфических праймеров для детекции 65 генов и их аллелей.
Результаты и обсуждение. С помощью имеющихся в распоряжении сывороток принадлежность к той или иной серогруппе удалось установить у 77 % клинических штаммов, выделенных до 1999 г. (21 серогруппа), у 56,7 % штаммов, выделенных с 2000 по 2014 гг. (11 серогрупп), у 55 % штаммов — из воды Азовского моря (10 серогрупп) и у одного из 4-х штаммов — из рыбы (табл. 1). Среди штаммов, выделенных в текущем столетии, были выявлены представители четырех ранее не встречавшихся на данной территории серогрупп. От людей в последние годы чаще выделялись штаммы О39 серогруппы, из водных объектов — О24. Однако выделить какие-либо серогруппы, занимающие основную позицию в качестве возбудителей, не представлялось возможным.
Для выяснения родственных связей между исследуемыми штаммами было проведено УКТЯ-типирование, в результате которого выявили большое число генотипов в составе 7-и кластеров, причем не обнаруживалось никакой взаимосвязи с местом и временем выделения штаммов и их серогрупповой принадлежностью. Однако, штаммы из окружающей среды образовали отдельную ветвь.
Популяция оказалась крайне неоднородной и по наличию/отсутствию генов факторов патоген-
26 ЗНиСО
Таблица 1. Результаты серотипирования исследуемых штаммов
Годы выделения Объект выделения Количество штаммов / из них типируется, % (%) Серогруппы (число штаммов)
1968—2000 Больные 96 / 74 (77,08) О2(9), О4(2), О5(10), О6(7), О8(3), О13(4), О16, О17(2), О24(3), О34, О37, О39, О45, О46, О47(8), О49(2), О50(5), О51(6), О52(3), О53, О54, н/т(22)
2000—2014 Больные 30 / 17 (56,7) О2(3), О6, О8, О27, О34, О39(5), О47, О51, О71, О81, О82, н/т(7)
2011 Рыба 4 / 1 (25) О5(1), н/т(3)
2012 Морская вода 38 / 21 (55,3) О2(4), О5(2), О24(8), О32(1), О44(1), О48(1), О51(1), О67(1), О71(1), О76(1), н/т(17)
Примечание: н/т- не типируется; преобладающие серогруппы выделены жирным шрифтом.
ц
ности/персистенции, входящих в состав кластеров, мобильных элементов либо геномных островов. Сходство заключалось лишь в том, что все штаммы содержали гены гемагглютинин/протеазы, протеазы PrtV, коллагеназы, цитотонического фактора Cef, белка наружной мембраны OmpW, tol- и vps-кластеров (кодирующих факторы персистенции), регуляторных генов toxR, hapR и не содержали генов холерного токсина, профага RS1, термостабильного и шига-подобного токсинов и прямого термостабильного гемолизина. Всего у одного клинического штамма 1981 г. выделения были выявлены гены коровой области профага pre-CTX при отсутствии RS2-элемента. Он также содержал 4-е из 6-и использованных в качестве мишеней генов острова патогенности VPI (ген токсин-корегулируемых пилей tcpA классического типа), а также tagA, mop и acfB при отсутствии toxT и aldA. Еще один tcpA-позитивный штамм (О39 серогруппы), выделенный от больного ребенка в 2012 г., содержал также гены VPI tagA и mop. У остальных гены tcpA и toxT отсутствовали, но у 63 штаммов определялись от одного до трех других генов этого острова, что может свидетельствовать о присутствии неполного VPI, утратившего часть генов в результате делеции. У многих штаммов были выявлены гены острова патогенности VPI-2 и RTX-кластера (ответственного за синтез высокомолекулярного цитотоксина MARTX), которые у большинства штаммов содержали делеции в разных участках (табл. 2).
Ген сериновой протеазы, способной вызывать в кишечнике накопление геморрагической жидкости, деструкцию ворсин и повреждение всех слоев его слизистой, был выявлен у 68 клинических и 15 водных штаммов. Ген cholix-токсина — блокатора белкового синтеза, обладающего цитотоксичностью и обусловливающего коагуляционный некроз клеток и гибель животных, обнаружен у 18 клинических штаммов.
Клинические штаммы в 75,6 % случаев имели гены транслоконов системы секреции третьего типа (T3SS), что не всегда совпадало с наличием гена ее ключевого эффектора VopF. Однако его отсутствие не может однозначно свидетельствовать об утрате функциональности данной системы, поскольку через нее может транслоцироваться по меньшей мере 15 различных эффекторов. На возможное участие T3SS в проявлении патогенных свойств косвенно указывает факт обнаружения ее генетических детер-
минант преимущественно у клинических штаммов, тогда как у штаммов, выделенных из водны, они не были выявлены вовсе. Что касается ТбББ, то все исследованные нами штаммы содержали гены ее структурных компонентов, но лишь 24 % содержали последовательности, кодирующие актин-связывающий (асё-у§г01) и 34 % — пептидогликан-связывающий (рЪё-у§гО3) домены ее эффекторов. Ген белка наружной мембраны отри присутствовал у 38 штаммов. У некоторых штаммов выявлены отдельные гены островов пандемичности VSP-I (1) и VSP-II (от 1 до 4). Только водные штаммы в 43% случаев содержали ген маннозочувствительных пилей тБЪЛ, что подтверждает участие его продукта скорее в сохранении вибрионов в объектах окружающей среды, чем в патогенезе.
Все перечисленные гены практически не встречались в геноме одного штамма, а присутствовали в разных сочетаниях. По результатам ПЦР-типирования был проведен кластерный анализ распределения генов по методу ИРОМЛ с использованием геоинформационной системы «Холера. Штаммы-VNTR» [1], и была построена дендрограмма (рис. 1). Клинические штаммы вошли в состав 14 кластеров, а штаммы из внешней среды — только в 5, при этом каждый кластер практически не содержал полностью идентичных штаммов (за исключением нескольких случаев).
Заключение. Результаты проведенных исследований еще раз подтверждают чрезвычайную пластичность генома вибрионов неО1/неО139 серо-групп, циркулирующих на одной территории. При
Таблица 2. Результаты ПЦР-детекции генов VPI-2 и RTX-кластера
VPI-2 Число штаммов (клин/вс) RTX Число штаммов (клин/вс)
int+nanH+vce+ 6/1 rtxA+acd+rtxC+ 38/1
int+nanH+vce- 63/10 rtxA+acd+rtxC- 22/0
int+nanH-vce- 11/5 rtxA+acd- rtxC- 8/0
int-nanH-vce- 27/17 rtxA-acd-rtxC- 5/2
int-nanH-vce+ 1/4 rtxA-acd-rtxC+ 5/0
int-nanH+vce+ 1/0 rtxA-acd+rtxC+ 24/0
int-nanH+vce- 15/5 rtxA-acd+rtxC- 15/0
int+nanH-vce+ 3/0 rtxA+acd-rtxC+ 10/39
Примечание: int — ген интергазы; nanH — нейраминидазы; vce — 3'-концевая последовательность VPI-2; rtxA — 5'-концевая последовательность гена; acd-rtxA — последовательность, кодирующая актин-связывающий домен MARTX; rtxC — ген активатора MARTX
март №3 (264)
27
г-Ь
сравнительном анализе полученных данных нами не было выявлено существенных коррелятивных связей между их серогрупповой принадлежностью, УОТЯ- и ПЦР-генотипами. Однако вызванные ими заболевания характеризовались сходным клиническим течением. Продолжающаяся на протяжении нескольких десятилетий регистрация ОКИ, обусловленных вибрионами неО1/неО139 серогрупп, и постоянное выделение их из объектов окружающей среды позволяют сделать вывод о том, что на территории Ростовской области сложились благоприятные условия для циркуляции возбудителей и (в определенных случаях) проявления ими патогенных свойств. Не исключено, что этому способствует именно генетическая неоднородность популяции, в целом содержащей большой набор генов факторов патогенности и персистенции, многие из которых входят в состав мобильных элементов. Возможно, сохранение всех их в геноме одного штамма было бы невыгодно энергетически, тогда как «распределение» по геномам разных представителей данной группы допускает периодическое формирование наиболее жизнеспособных и обладающих выраженным патогенетическим потенциалом клонов за счет горизонтального переноса генов.
ЛИТЕРАТУРА
Водопьянов А.С. и др. Геоинформационная система «Холера. Штаммы—VNTR» (Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2007620389) / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.Ю. Сучков [и др.], 2007. Григоренко Л.В. и др. Холерные вибрионы неО1/неО139, выделенные в ходе мониторинга водоемов и стоков Ростова-на-Дону с 2009 по 2011 год / Л.В. Григоренко, В.Д. Кру-гликов, А.Б. Мазрухо [и др.] //Проблемы особо опасных инфекций. 2013. № 4. С. 48—50.
Кругликов В.Д. и др. Характеристика штаммов холерных вибрионов не О1/неО139 серогрупп, вызвавших заболевания людей в Ростовской области / В.Д. Кругликов, Е.В. Монахова, И.В. Архангельская [и др.] //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 5. С. 18—22. Семиотрочев В.Л и др. Классификация заболеваний, вызванных микроорганизмами рода Vibrio / В.Л. Семиотрочев, Ю.З. Ривкус //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 2. С. 32—36.
Шалу О.А.и др. Пандемичные штаммы Vibrio parahaemolyticus — этиологические агенты гастроэнтеритов на Дальнем Востоке Российской Федерации / О.А. Шалу, А.В. Алле-нов, Г.П. Мурначев [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2010. № 12. С. 42—45.
Контактная информация: Contact information:
Водопьянов Алексей Сергеевич, Vodopyanov Alexey, тел.: 8 (903) 402-07-02, phone: 8 (903) 402-07-02,
e-mail: [email protected] e-mail: [email protected]
+>-
УДК 621.384.8:612.017.4 ^
ИНДИКАЦИЯ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА С ПОМОЩЬЮ MALDI МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
В.Г. Германчук, Д.В. Уткин, А.Н. Спицын, М.Н. Киреев, Н.Е. Щербакова ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»», г. Саратов, Россия Определен масс-спектр холерного токсина с помощью времяпролетной MALDI масс-спектрометрии (MALDI-TOFMS), выявлены специфические пики масс-спектров, изучена возможность определения холерного токсина в объектах окружающей среды (водопроводной воде). Ключевые слова: токсины, холерный токсин, масс-спектр, MALDI-TOF MS. V.G. Germanchuk, D.V. Utkin, A.N. Spitsyn, M.N. Kireyev, N.E. Scherbakova □ INDICATION OF CHOLERA TOXIN FOR MALDI MASS SPECTROMETRY □ FSHE «Russian Scientific Research Anti-Plague Institute «Microbe»», Saratov, Russia.
The mass spectrum of cholera toxin is defined by MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization Time Of Flight Mass-Spectrometry), specific peaks of mass spectrums are revealed,
possibility of its definition in objects of environment (tap water) is studied. Key words: toxins, cholera toxin, mass spectrum, M iALDI-TOF MS.
В настоящее время угроза возникновения чрезвычайных ситуаций различного характера является актуальной проблемой для всех государств мирового сообщества, не исключая Россию. Сохраняется потенциальная опасность применения патогенных биологических агентов в целях биотерроризма [5]. Еще в 1988 г. Министерством здравоохранения СССР был утвержден перечень агентов, в отношении которых необходимо создавать средства защиты и проводить защитные мероприятия. К их числу относят биологические токсины растительного и животного происхождения: ботулинические, столбнячный, сибиреязвенный, шигеллезный, холерный токсины, стафилококковые энтеротоксины, рицин, нейротоксины и др. Холероген входит в список токсинов, подлежащих экспортному контролю и в перечень агентов, выявляемых в лабораториях специализированных противоэпидемических бригад. Для выявления штаммов холерного вибриона, продуцирующих холерный токсин, используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [1, 2]. Тем
не менее, молекулярно-генетические методы не позволяют провести индикацию холерного токсина в нативном материале. В настоящее время для выявления холерного токсина в объектах окружающей среды рядом зарубежных и отечественных производителей выпускаются наборы для иммунохромато-графического анализа (BADD — Osborn Scientific, США; SMART-II - New Horizons Diagnostic, Inc., США; Prime Alert - GenPrime, Inc., США; УИХЭ - ФГУП ГосНИИБП ФМБА, Россия).
Холерный токсин, продуцируемый Vibrio choleraе, относится к группе токсинов, генерирующих образование вторичных мессенджеров, способных в значительной степени усиливать и искажать клеточную реакцию на различные сигналы. Холерный токсин обладает АДФ-рибозилтрансферазной активностью по отношению к ГТФ-азе клеток млекопитающих. После АДФ-рибозилирования ГТФ-аза вызывает пролонгированную активацию аденилатциклазы и резкое увеличение цАМФ в энтероцитах. Увеличение концентрации цАМФ, в
