CC BY-ND
48
42
ЗНиСО ИЮЛЬ №7 (256)
6. Лукашев Д.В. Мониторинг загрязнения тяжёлыми металлами экосистемы Днепра в пределах г. Киева с помощью пресноводных моллюсков //Гидробиол. журн. 2006. Т. 42, № 1. С. 86—98.
7. Мудрый И.В. Тяжёлые металлы в системе почва—растение —человек (обзор) //Гигиена и санитария. 1997. № 1. С. 14—17.
8. Мур Дж. и др. Тяжелые металлы в природных водах / Дж. Мур, С. Рамамурти. М.: Мир, 1987. 285 с.
9. Нормативы ПДК примесей в воде хозяйственного, питьевого и бытового назначения использования: СаНПиН 2.1.4.1074—01 М., 2001. 99 с.
10. Экологические проблемы Верхней Волги: Коллективная монография / Под общ. ред. А.И. Копылова. Ярославль: Изд-во ЯГТУ, 2001. 427 с.
УДК616-036.22
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS И ДРУГИХ ГАЛОФИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БАЛЛАСТНЫХ ВОД СУДОВ, ПРИБЫВАЮЩИХ В МЕЖДУНАРОДНЫЕ ПОРТЫ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
О.С. Чемисова, О.А. Рыковская, Р.Р. Даликова, Н.Б. Непомнящая, И.А. Чайка, С.Ю. Водяницкая, А.В. Гавринева
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону
В балластных водах морских судов портов г.г. Азова и Таганрога обнаружены представители 13 видов галофильных вибрионов, 9 из которых являются патогенными для человека. Анализ свойств парагемолитических вибрионов выявил отсутствие генов tdh и trh, кодирующих основные факторы патогенности, при одновременном присутствии у всех изученных штаммов генов ompA, pmp и cefVp. Полученные результаты подтверждают необходимость контроля судового водяного балласта в России, разработки методологии исследования.
Ключевые слова: балластные воды, галофильные вибрионы, патогенные виды, биологический контроль.
O.S. Chemisova, O.A. Rykovskaya, R.R. Dalikova, N.B. Nepomnjashhaja, Chajka I.A., S.Ju. Vodjanickaja, A.V. Gavrineva □ CHARACTERIZATION OF VIBRIO HUMAN PATHOGENS ISOLATED FROM BALLAST WATERS OF SHIPS ARRIVING TO ROSTOV REGION INTERNATIONAL PORTS □ The Federal Government Health Institution «Rostovon-Don Plague Control Researsh Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare, Rostov-on-Don, Russia
In the ballast water of ships ports of Azov and Taganrog found representatives of 13 halophilic Vibrio species, 9 of which are pathogenic for humans. Analysis of properties V. parachaemolyticus revealed absence of genes tdh and trh, encoding the major pathogenicity factors, in the simultaneous presence all strains studied genes ompA, pmp and cefVp. These results confirm the necessity of control ballast water in Russia, the development of research methodology.
Key words: ballast water, halophilic vibrios, pathogenic species, biological control
11. J.J. Jaakkola [et al]. Drinking Water mutagenicity in Past Exposure Assessment of the Studies on Drinking Water and Cancer: Application and Evaluation in Finland //Environmental research. 1994. V.64. №1. P. 90.
Контактная информация: Д
Голинская Людмила Владимировна, —
тел.: 8 (3532)-77-48-67, Е e-mail: gol.lv@mail.ru
Contact information:
Golinskaya Lyudmila, phone: 8 (3532)-77-48-67, e-mail: gol.lv@mail.ru
Галофильные вибрионы являются аутох-тонными обитателями морских экосистем. В настоящее время известно около 80 видов вибрионов, 12 из которых отнесены к патогенным для человека видам, в том числе Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus. Не меньшее значение имеют и другие виды вибрионов, такие как V. anguillarum, V. salmonicida, V. rotiferianus, способные вызвать заболевания морских животных, рыб, моллюсков, ракообразных, нарушая, таким образом, экологическое равновесие морских си-
стем. Существенный вклад в распространение патогенных микроорганизмов вносят антропогенное загрязнение, развитие судоходства и перенос организмов в судовых балластных водах и осадках. Балластные воды следует рассматривать как техногенный резервуар микроорганизмов, многие из которых способны вызывать инфекции человека и животных [4—6].
Глобальная программа защиты окружающей среды (GEF — UNDP) идентифицирует интродукцию чужеродных морских разновидностей в
ИЮЛЬ №7 (2П)
43
другие экосистемы с балластной водой судов как одну из четырех самых больших угроз Мировому ^ океану наравне с антропогенным загрязнением, последствиями эксплуатации морских ресурсов и физическим разрушением морской сре-^^ ды обитания. Распространение холеры в портах Центральной и Южной Америки связывают со сбросом загрязненных холерным вибрионом балластных вод, которые транспортировались от портов Азии к Латиноамериканским прибрежным водам [9].
Наиболее частым этиологическим агентом диарейных заболеваний, вызванных га-лофильными вибрионами, являются штаммы V. parahaemolyticus. Основными факторами па-тогенности V. parahaemolyticus являются термостабильный прямой (TDH-thermostable direct hemolysin) и TDH-родственный (TDH-related hemolysin) гемолизины, а также две контакт-зависимые системы секреции третьего типа (T3SS), особенно T3SS2, ответственная за энтеро-токсичность [11]. В последнее время наблюдается стремительный рост заболеваемости, принявшей глобальный характер и сопровождающийся распространением так называемых «пандемичных» клонов, которые характеризуются присутствием в их геноме семи островов патогенности (VPaI 1-7) и обусловливают более тяжелые случаи, склонные к эпидемическому распространению.
Цель работы: изучение возможности заноса с балластными водами судов галофильных вибрионов и оценка патогенности, выделенных штаммов V. parahaemolyticus. В рамках данной цели были определены следующие задачи:
1. Исследование вод судов, прибывающих в международные порты Ростовской области из-за рубежа, с целью обнаружения галофильных патогенных для человека вибрионов.
2. Изучение свойств выделенных штаммов с помощью традиционных методов и подтверждение их видовой принадлежности методами ПЦР и MALDI-TOF масс-спектрометрии.
3. Оценка вирулентности выделенных из балластных вод судов культур парагемолитических вибрионов комплексным методом, в том числе ПЦР-скрининг штаммов V. parahaemolyticus по расширенному набору детерминант, сопряженных с патогенностью.
Материалы и методы. Исследования балластных вод судов, прибывающих в международные порты Ростовской области Таганрога и Азова из-за рубежа, с целью обнаружения галофильных патогенных для человека вибрионов проводились с 2011 по 2013 год в период с мая по сентябрь. Отбор проб балластной воды
проводился сотрудниками лаборатории санитарной охраны территорий ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора предложенными ими способами через специальные люки, смотровые крышки балластных емкостей, замерные отверстия балластных цистерн или при сбрасывании балластной воды в зависимости от конструкции судна [1]. Выделенные культуры микроорганизмов были идентифицированы традиционными биохимическими тестами [3]. Их видовая принадлежность была подтверждена методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Учет результатов проводили по шкале показателей Score в диапазоне от 0 до 3: значения 2.300—3.000 указывают на высокую вероятность идентификации вида, значения 2.000—2.2999 указывают на надежную идентификацию рода бактерий и возможную идентификацию вида, значения 1.700—1.999 указывают на возможную идентификацию рода, менее 1.700 — на отсутствие надежной идентификации.
Для подтверждения видовой принадлежности выделенных штаммов V. parahaemolyticus было проведено ПЦР-тестирование видоспецифиче-ских генов tlh (термолабильного гемолизина), gyrB (гиразы), toxR (регулятора транскрипции белков наружной мембраны), Vpfla (жгутикового антигена) и vppC (коллагеназы).
В качестве контрольного был использован типовой штамм V. parahaemolyticus 13580 (АТСС 17802). Вирулентность штаммов оценивали комплексным методом [4], включающим определение гемолитической, уреазной активностей и ПЦР-детекцию основных факторов патогенно-сти — генов термостабильного прямого гемоли-
Таблица 1. Данные о выделении галофильных вибрионов из балластных вод судов
Год выделения Количество исследуемых проб Число положительных проб Общее количество выделенных штаммов
Абсолютное значение %
2011 62 18 29 19
2012 62 22 35 32
2013 52 16 31 21
Таблица 2. Характеристика видовой принадлежности выделенных патогенных вибрионов, подтвержденная методом MALDI-TOF
№ п/п Вид микроорганизма Год выделения Среднее значение Score
2011 2012 2013
1 V. parahaemolyticus 1 3 9 2.398
2 V. alginolyticus - 2 6 2.268
3 V. vulnificus 5 11 3 2.439
4 V. mimicus 5 - - -
5 V. fluvialis 4 7 3 2.303
6 V. damsela 3 - - -
7 V. harvei 1 6 - 2.122
8 V. furnissii - 2 - 2.258
9 V. metchnikovii - 1 - 1.854
44
ЗНиСО ИЮЛЬ №7 (256)
Таблица 3. Анализ штаммов парагемолитических вибрионов, выделенные в ходе исследования
№ п/п Номер штамма Дата выделения Порт прибытия Страна убывания Присутствие/отсутствие генов
VPaI-1, 3, 4, 5, 6 VPaI-2 orf8 trhureC, TTSS2|3 pmp cefVp
1 19/2 22.07.2011 Таганрог Турция - + - + +
2 22/4 26.07.2012 Таганрог Болгария - + - + +
3 53/3 12.09.2012 Таганрог Румыния - + - + +
4 56/5 18.09.2012 Азов Турция - + - + +
5 7/3 14.06.2013 Таганрог Украина - + - + +
6 9/5 2.07.2013 Таганрог Нет данных - + - + +
7 11/1 4.07.2013 Таганрог Украина - + - + +
8 13/3 11.07.2013 Таганрог Турция - + - + +
9 22/1 8.08.2013 Таганрог Турция - + - + +
10 31/4 23.08.2013 Азов Турция - + - + +
11 39/1 6.09.2013 Азов Турция - + - + +
12 43/4 6.09.2013 Азов Украина - + - + +
13 52/2 26.09.2013 Таганрог Румыния - + - + +
зина (TDH-thermostable direct hemolysin) и TDH — родственного (TDH-related hemolysin), сокращенно TRH. Гемолитическую активность определяли в тесте Канагава (КР) на среде Вагатцума, а способность к гидролизу мочевины (Ure) — на среде Кристенсена. Кроме того, проведен ПЦР-скрининг по расширенному набору детерминант, сопряженных с патогенностью, включающему гены двух вариантов системы секреции третьего типа (T3SS2a, входящая наряду с tdh в состав VPaI -7 и T3SS2P), кластера генов уреазы (ureC, ureR), гена филаментозного профага orf8, кодирующего предполагаемый фактор адгезии, гены pmp и cefVp (предполагаемая металлопротеина-за и предполагаемая липаза), а также следующие маркерные гены шести островов патогенности (VPaI):
— ген интегразы intl и связанного с гемагглю-тинином белка hapVp, входящие в состав VPaI-1;
— ген белка наружной мембраны ompA — маркер VPaI-2;
— ген фагоподобной интегразы int3 — маркер VPaI-3;
— ген предполагаемой интегразы порообразу-ющго цитотоксина pfc — маркер VPaI-4;
— ген предполагаемого фагообразующего белка php — маркер VPaI-5;
— ген предполагаемой ДНКазы exoV — маркер VPaI-6.
Для определения указанных генов использовали праймеры, предложенные зарубежными авторами [7, 10, 12] и сконструированные нами, которые синтезированны в НПФ «Литех» (Москва). В качестве ДНК-матриц использовали супернатанты 1 млрд взвесей суточных агаровых культур, прогретых при 99 °С в течение 30 мин. Амплификацию проводили на программируемом термостате «Терцик» («ДНК-Технология», Москва).
Результаты и обсуждение. Трехлетние наблюдения (2011—2013 гг.) в течение которых были
исследованы 176 проб, свидетельствуют о неблагополучном состоянии балластной воды по наличию патогенных видов галофильных вибрионов. Количество положительных проб и выделенных культур представлены в табл. 1.
Таким образом, в балластных водах судов, поступающих в порты Ростовской области Таганрога и Азова в период с 2011 по 2013 гг., обнаружены 9 видов патогенных для человека гало-фильных вибрионов, среди которых доминируют виды V. vulnificus, V. fluvialis и V. parahaemolyticus (табл. 2). Также помимо патогенных для человека галофильных вибрионов было выделено еще 4 вида галофильных вибрионов, таких как V. navarrensis, V. rotiferianus, V. ponticus и V. brasiliensis.
По частоте встречаемости и по тяжести вызываемых ими заболеваний особую важность имеют представители вида V. parahaemolyticus, которые обусловливают до 20 % пищевых отравлений в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Латинской Америки [2, 8]. В результате наших исследований из проб балластных вод было выделено 13 штаммов парагемолитических вибрионов (табл. 3).
Большинство штаммов V. parahaemolyticus были выделены из балластных вод судов, прибывших из Турции и Украины (табл. 3). У всех культур парагемолитических вибрионов подтверждена видовая принадлежность традиционными таксономическими тестами, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (с показателем Score от 2.153 до 2.473) и ПЦР-детекцией с помощью видоспе-цифических генов tlh (термолабильного гемолизина), gyrB (гиразы), toxR (регулятора транскрипции белков наружной мембраны), Vpfla (жгутикового антигена) и vppC (коллагеназы).
При оценке вирулентности комплексным методом, включающим определение гемолитической, уреазной активностей и ПЦР-детекцию генов tdh и trh [3] показано, что все штаммы, вы-
ИЮЛЬ №7 (211)
45
деленные из проб балластной воды, были оценены как авирулентные. Кроме того, эти штаммы ^ были лишены также кластеров генов T3SS2a, sz T3SS2ß и уреазы (ureC, ureR), маркерных генов VPaI-1, 3, 4, 5, 6, однако обладали маркерным ге-^^ ном VPaI-2, генами pmp и cefVp и не содержали ген orf8 (табл. 3).
Таким образом, в результате проведенного мониторинга было выделено 72 штамма, принадлежащие к 9 видам патогенных для человека галофильных вибрионов. Штаммы парагемоли-тических вибрионов охарактеризованы по расширенному набору генетических детерминант вирулентности. Все штаммы V. parahaemolyticus были лишены основных факторов вирулентности, однако обладали генами ompA, pmp и cefVp. Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего мониторинга балластных вод судов, сброс которых может оказать влияние на состав популяции патогенной для человека ви-бриофлоры в прибрежных регионах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Водяницкая С.Ю. и др. Разработка способов отбора балластной воды на судах смешанного «река—море» плавания для исследования на холеру / С.Ю. Водяницкая, О.В. Лях, Ю.М. Ломов //Здоровье населения и среда обитания. 2014. № 1 (250). С. 37-40.
2. Водопьянов А.С. и др. Алгоритм компьютерного VNTR-типирования на основе неполных сиквенсов ДНК-штаммов vibrio cholerae, выделенных на Гаити в 2010 г. / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 3(240). С. 28-31.
3. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых па-рагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами: МУК 4.2.1793 — 03. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2003.
4. Осина Н.А. и др. Результаты мониторинга холерных вибрионов в водных экосистемах на территории Республики Калмыкия / Н.А. Осина, Т.Б. Каляева, Т.В. Бугоркова,
И.А. Касьян, Н.Ф. Оброткина //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 2 (239). С. 28—30.
5. Рыковская О.А. и др. Комплексный метод оценки вирулентности парагемолитических вибрионов / О.А. Рыковская, О.А. Шалу, Е.В. Монахова, Л.М. Смоликова, О.С. Чеми-сова, Е.Н. Голенищева, Е.М. Санамянц, Г.В. Гальцева, А.В. Алленов, Г.П. Мурначев, Т.В. Хоменко //Клиническая и лабораторная диагностика. 2013. № 2. С. 38—41.
6. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии (http://supotnitskiy.webspecialist.ru/book/book1 .htm. Дата обращения: 18.11.13).
7. Boyd E.F. at al. Molecular analysis of the emergence ofpan-demic Vibrio parahaemolyticus / E.F. Boyd, A.L. Cohen, L.M. Naughton, D.W. Ussery, T.T. Binnewies, O.C. Stine, M.A. Parent //BMC Genomics. 2008. V. 8. P. 110.
8. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). С^кгае and Other Vibrio Illness Surveillance Overview. Atlanta, Georgia: US Department of Health and Human Services, CDC, 2012.
9. Gollasch S. еt al. Life in BallastTanks Invasive Aquatic Species of Europe: Distribution, Impacts and Management / S. Gollasch, E. Macdonald, S. Belson, H. Botnen, J. Christensen, J. Hamer, G. Houvenaghel, A. Jelmert, I. Lucas, D. Masson, T. McCollin, A. Olenin, A. Persson, I. Wallentinus, L. Wetsteyn, T. Wittling; Eds. E. Leppakoski, S. Gollasch, S. Olenin. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Academic Publishers. 2002. P. 217—231.
10 Hayashi S. еt al. Soft-agar-coated filter method for earley detection of viable and thermostable direct hemolysin (TDH) — or TDH-related haemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in seafood / M. Okura, R. Osawa //Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72 (7). P. 4576—4582.
11. Nishibuchi M. еt al. Thermostable direct hemolysin gene and of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired by a marine bacterium / M. Nishibuchi, J.B. Kaper // Infect. Immun.1995. № 63. Р. 2093—2099.
12. Okada N. еt al. Identification and characterization of a novel type III secretion system in trh-positive Vibrio parahaemolyticus strain TH3996 reveal genetic lineage and diversity ofpathogenic machinery beyond the species level / N. Okada, T. Iida, K. Park, N. Goto, T. Yasunaga, H. Hiyoshi, S. Matsuda, T. Kodama, T. Honda //Infect. Immun. 2009. 77 (2). Р. 904—913.
Контактная информация:
Чемисова Ольга Сергеевна, тел.: 8 (928) 279-56-31, e-mail: chemisova@inbox.ru
Contact information: Chemisova Olga, phone: 8 (928) 279-56-31, e-mail: chemisova@inbox.ru
>
