CC BY
10
вая подробное описание (а в отдельной статье и подробные чертежи) устройства вытяжного горна. Особенно он подчеркивает важность правильно устроенной вентиляции при работе с ртутью.
Прошло 100 лет со дня появления книги А. Н. Никитина. За это время, в особенности же за 29 лет советского периода развития нашей науки, гигиена труда как наука и как отрасль практической работы достигла высокого развития. Тем более важно, чтобы современные гигиенисты представляли себе истоки гигиенической науки в нашей стране. Никитин жил и работал в мрачные годы царской России — в период крепостного права и жестокой эксплоатации подневольного труда. И хотя он явно не представлял себе зависимости тяжести условий труда от особенностей экономического уклада и политических условий жизни того времени, его заслуги перед русской гигиенической наукой должны быть признаны значительными.
К. И. ТУРЖЕЦКИЙ
Количественный учет токсигенности и применение мышей при диагностике стафилококковых пищевых отравлений
Из отдела профилактики пищевых отравлений Ленинградского научно-исследовательского санитарно-гигиенического института
При пищевых отравлениях находка стафилококка в пищевом продукте или выделениях пострадавших еще не является доказательством того, что отравление вызвано действительно стафилококком, ввиду широкого распространения его в природе и наличия, наряду с токсигенными, сапрофитных штаммов. Вопрос о диференциацик токсигенных, в частности, энтеротоксических стафилококков еще далеко не может считаться разрешенным. Американские авторы пользуются биологическими методами испытания их на людях-добровольцах, обезьянах и котятах. Первые две модели, по вполне понятным причинам, не могут иметь широкого применения; что же касается котят, то они могут быть использованы с большими ограничениями как животные сезонные. Поэтому такие методы практически мало применяются даже в Америке и при повседневной работе там ограничиваются количественным учетом обсемененности продукта стафилококком, считая, что если содержание его в 1 г подозреваемого продукта превышает 500 ООО микробных тел, то продукт этот может считаться источником отравления.
Совершенно естественно, что и официальная инструкция Нарком-здрава СССР по методике бактериологического исследования при пищевых отравлениях, изданная в 1943 г., в вопросе об исследовании на стафилококк дает неопределенные рекомендации.
Принимая во внимание такую неопределенность в вопросе лабораторного диагноза пищевых отравлений стафилококковой этиологии, мы считали вполне своевременным заняться изучением свойств стафилококков, выделяемых при пищевых отравлениях, параллельно со стафилококками другого происхождения.
Изучению было подвергнуто 224 штамма стафилококков, выделенных нами в течение 1943—1945 гг. в случаях пищевых отравлений из гнойного клинического материала и из объектов, не имеющих отношения к патологическим процессам.
Эти культуры были изучены в отношении их биохимических и биологических свойств по следующей программе: морфология, окраска по Гра-
му, рост на мясо-пептон-агаре и пигментообразование, рост на мясо-лептон-бульоне, ферментация глюкозы, лактозы, сахарозы и маннита, свертывание молока, разжижение мясо-пептон-желатины, рост на кровяном агаре, на специальных средах (фиолетовый агар Чепмена, голодная желатина Стона), реакция плазмокоагуляции. .
Не останавливаясь на описании результатов этих опытов (подробно •они изложены в другой работе), мы отметим лишь следующее. Из всех перечисленных методов испытания культур стафилококков диференциро-вать токсигенные штаммы от нетоксигенных позволяют лишь посев на кровяной агар и реакция плазмокоагуляции.
При посеве на мясо-пептон-агар с 5% кроличьей крови штаммы стафилококков, выделенные из гноя в чистой культуре или в преобладающем количестве всегда оказывались гемолитическими, так же как и штаммы, являвшиеся возбудителями пищевых отравлений. Среди же штаммов, выделенных из объектов, не имеющих Отношения к патологическим процессам, гемолитические стафилококки попадались по сравнению с негемолитическими нечасто.
Реакция плазмокоагуляции с человеческой плазмой была поставлена с 75 специально отобранными штаммами, из которых 54 были явно токсигенные и 21 заведомо нетоксигенные. Все 54 токсигенных штамма вызвали коагуляцию плазмы, а 21 контрольный не коагулировал ее в течение суток.
При испытании гемолитической активности стафилококков на кровяном агаре и постановке реакции плазмокоагуляции хотя и можно в известных пределах судить о степени гемолиза и коагуляции, но это суждение весьма относительно и не позволяет произвести точного количественного учета токсигенности испытуемых культур. Количественный же учет степени токсигенности стафилококков, выделяемых при пищевых отравлениях, имеет решающее значение.
Ряд наиболее токсигенных штаммов был испытан на мышах под кожным и внутрибрюшинным введением живых культур, а также кормлением ими. Кормление даже наиболее токсигенными культурами, в гом числе и выделенными в случаях пищевых отравлений, переносилось мышами совершенно безнаказанно. Введение культур под кожу вызывало обычно небольшую общую реакцию, но зато получались обширные некрозы кожи, мешавшие наблюдению за общетоксическим действием введенных культур. Введение культур внутрибрюшинно дало более показательные результаты. Всего было поставлено 30 опытов по внутри-брюшинному введению культур (в каждом опыте по две мыши). На введение негемолитических стафилококков мыши ничем не реагировали, при введении же гемолитических штаммов в большинстве случаев они гибли. Но все же введение культур даже в таких больших количествах, как 2 млрд. микробных тел, не давало такого постоянного эффекта, как введение токсинов.
Ниже, при изложении результатов введения мышам токсинов, приводится таблица (табл. 2), показывающая значительно большую эффективность токсинов перед введением культур. ■
Ряд теоретических соображений побудил нас перейти "к испытанию на мышах не культур стафилококков, а их токсинов. Первоначально мы пробовали получать токсины на бульоне как в обычной атмосфере, так и в атмосфере с 20,% С02, но токсины получались слабые и в срок не менее недели. Тогда мы перешли на метод Бернета. После ряда опытов по установлению условий, необходимых для получения наиболее сильных токсинов, мы остановились на следующей методике. Суточная культура стафилококка засевается по поверхности разлитого на чашках Петри ■0,75% мясо-пептон-агара с 0,25% глюкозы, рН = 7,0 и ставится на сутки в термостат в атмосфере с 20% ССЬ. Через сутки .чашки вынимаются, и на поверхность агара наливается 10 см3 физиологического
%
раствора, после чего агар раздавливается шпаделем до равномерной кашицеобразной консистенции. Через 2 часа экстракт отсасывается в центрифужные пробирки.
Для получения прозрачных экстрактов ¡мы применяем центрифугирование без фильтрования через бактерийные фильтры, так как центрифугирование при этом во много раз быстрее; кроме того, имеются указания Вульперта и Дэка на то, что при фильтровании токсин частично адсорбируется на фильтре. Для практической диагностики стерильность экстрактов не нужна, так как при дальнейшем испытании на содержание токсина титрованием их гемолитической активности опыт вообще производится в нестерильных условиях, а при испытании экстрактов на мышах последние при введении токсических экстрактов гибнут обычно в первые, реже .во вторые сутки; могущие же остаться в прозрачных экстрактах в ничтожном количестве живые стафилококки за такой короткий срок не оказывают на мышей заметного действия и ,на результат опыта не влияют.
После центрифугирования верхний прозрачный слой отсасывается. Он и является исходным токсином.
У полученных токсинов вытитровывалась их гемолитическая активность. 1 см3 разведений токсина в физиологическом растворе смешивался с 1 см3 21/« эмульсии троекратно отмытых кроличьих эритроцитов. Разведения брались от 1 : 10 до 1 : 2 560 или до 1 : 5 120. Пробирки ставились в термостат на два часа. После выемки из термостата они встряхивались и оставлялись при комнатной температуре до следующего утра. Всего было поставлено 223 опыта получения токсинов и титрования их гемолитической активности.
Стафилококки, являвшиеся возбудителями пищевых отравлений, вырабатывали сильные токсины с титром 1 : 1 280, 1 : 2 560 и даже 1 : 5 120. Аналогично им сильные токсины вырабатывало большинство штаммов, выделенных из гноя. Штаммы же, не имевшие отношения к патологическим процессам, или вовсе не образовывали гемолизина, или вырабатывали его в ничтожном количестве (табл. 1).
Таблица 1. Испытание гемолитической активности стафилококковых экстрактов
Экстракты неактивные или с титром меньше 1:80
Экстракты с титром 1:80 и выше
Штаммы, вызывавшие пищевые отравления Штаммы из объектов, присылавшихся по поводу пищевых отравлений, связь которых с
ними установлена не была........
Штаммы из гнойного материала . ... Штаммы из объектов, не имеющих отношения к патологии ...........
Титрованке гемолитической активности токсинов позволило нам произвести количественный учет токсигенности каждого штамма, чего один посев на кровяной агар сделать не позволяет. При пищевых отравлениях вопрос о степени токсигенности выделенного стафилококка имеет очень большое значение. Поскольку стафилококковые пищевые отравления вызываются находящимся в продукте токсином, естественно, представляется важным не только нахождение в продукте или в выделениях пострадавших токеигенного стафилококка, но и количественный учет его токсигенности. Понятно, что находка слабо токеигенного штамма с гемолитическим титром 1:10, 1 : 20 гораздо менее убедительна, чем находка штамма с титром 1 : 1 000 и выше.
При титровании гемолитической активности токсинов считаем необходимым всегда брать в опыт контрольный штамм с заведомо высоким гемолитическим титром, так как токсинообразование у стафилококков — процесс очень капризный и зависит в первую очередь от питательной среды. Поэтому отсутствие токсинообразования у испытуемого штамма при постановке опыта без контроля недоказательно. Контрольный штамм должен время от времени проверяться, так как при хранении токсиген-ность стафилококков ослабевает.
Полученные токсины были испытаны на мышах. По сравнению с действием на мышей культур стафилококков действие токсинов гораздо показательнее. При введении внутрибрюшинно 0,5—1 см3 сильных токсинов мыши обычно гибли в первые сутки, введение же экстрактов нетоксигенных штаммов переносилось мышами безнаказанно (табл. 2).
Таблица 2. Параллельное внутрибрюшинное введение мышам 21 токсинов и культур стафилококков
Результаты Введение токсина Введение
культуры
Обе мыши пали в петвые сутки....... 19 8
Обе мыши пали не позднее 3 суток..... 4 7
Обе мыши пали не позднее 5 суток..... — 1
Одна мышь пала, другая выжила...... 1 5
Обе мыши выжили............. 3
24 24
Опыты с кормлением мышей токсинами оказались не столь показательными. Кормление сильными токсинами, убивавшими мышей в первые сутки при внутрибрюшинном введении, переносилось ими в ряде случаев безнаказанно, но в некоторых случаях мыши болели и даже гибли (табл. 3).
Таблица 3
№ штамма
Результат кормления мышей токсином
30 41* 39* 73 38* 1* 8* 22* 146 21* 376
Одна мышь болела, другая здорова То же
Обе мыши болели
Одна мышь na,ja на 4-е сутки, другая здорова То же
Одна мышь пала на 5-е сутки, другая болела
. » . 2-е , .на 3-й сутки » * » » 1-е » w я 3-й , . 1-е . здорова
Обе мыши пали на 1-е сутки То же
В этих опытах прежде всего бросается в глаза неодинаковая индивидуальная чувствительность мышей к энтеральному введению токсинов. В ряде случаев из двух испытуемых мышей одна болеет и гибнет, другая же остается здоровой. По данным американских авторов, это наблюдается также и при кормлении стафилококковым токсином людей, обезьян и котят. То же самое наблюдается и при вспышках стафилококковых пищевых отравлений, когда обычно, наряду с заболевшими, имеется ряд лиц, оставшихся здоровыми несмотря на то, что они ели зараженный продукт наравне с пострадавшими.
4 Гигиена и санитария, № 3
25
Принимая во внимание указания ряда авторов на термоустойчивость стафилококкового энтеротоксина, нами было испытано внутрибрюшинное введение мышам прогретого токсина,в котором был предварительно разрушен гемолизин. Поскольку в литературе имеются противоречивые указания по вопросу о минимальных температуре и времени, необходимых для разрушения гемолизина, они были установлены нами в предварительных опытах. В наших опытах гемолизин полностью разрушался при 65° в течение 15 минут. Прогретый токсин вводился мышам внутри-брюшинно в количестве 1 см3. Хотя в большинстве случаев введение прогретого токсина переносилось мышами без всякого вреда, но иногда мыши на него реагировали, причем эта реакция была замедленной (если мыши гибли, то обычно лишь на 4—7-е сутки) и непостоянной (из двух мышей в ряде случаев гибла или болела только одна, а другая оставалась здоровой).
Очень слабая чувствительность мышей к внутрибрюшинному введению прогретых токсинов, медленная реакция и непостоянство результатов, в чем значительную роль, повидимому, играет различная индивидуальная восприимчивость мышей, не позволяют считать этот метод пригодным для практического применения.
Всего нами было поставлено 134 опыта на мышах (в каждом по две мыши). Эти опыты показывают, что мыши очень чувствительны к внутрибрюшинному введению стафилококковых токсинов. Испытание экстрактов стафилококковых культур внутрибрюшинным -введением мышам вполне пригодно для определения токсигенности стафилококков и вследствие быстроты реакции может быть рекомендовано для практического применения в лабораторной диагностике.
Что же касается методов кормления мышей токсином и внутрибрю-шинного введения им гретых токсинов, то для целей практической диагностики мы их рекомендовать не можем, во-первых, из-за непостоянства результатов, а во-вторых, из-за длительного срока наблюдения.
К сожалению, мы не могли поставить опыты на котятах, так как в Ленинграде в годы войны нам не удалось получить котят. Хотя отсутствие этих опытов заставляет нас оставить неразрешенным вопрос о существовании специфического энтеротоксина, но с практической точки зрения полученные результаты позволяют внести известные предложения по вопросу о методике производства исследования на стафилококк при пищевых отравлениях.
Исходя из положения, что при пищевых отравлениях, наряду с массивностью обсеменения продукта стафилококком, решающую роль играет степень токсигенности последнего, мы предлагаем собственную схему исследования, отличающуюся от официальной методики главным образом двумя основными моментами: 1) введением в анализ биологической пробы на мышах и 2) количественным учетом степени токсигенности выделенного штамма стафилококка (табл. 4).
Обведенные черным пункты включены в схему условно как необязательные. Такими пунктами являются: 1) опыты на котятах из-за невозможности использования их круглый год и 2) подсчет колоний стафилококков, который мы рекомендуем производить лишь тогда, когда для этого имеются известные предпосылки, например, в продукте, заведомо вызвавшем отравление. Что касается реакции плазмокоагуляции, то хотя она и помещена в схему лишь условно, чтобы не загромождать анализа, мы считаем производство ее весьма желательным.
В нашей схеме особое внимание уделяется количественному учету токсигенности выделенного штамма стафилококка. Естественно, что обоснованное заключение об отношении исследуемого продукта к отравлению можно давать, лишь принимая во внимание количественные соотношения. Находка лишь единичных даже сильно токсигенных стафилококков не дает права делать категорического заключения о токсичности
Таблиц! 4. Схема иссле^вания на стафилококк
День А В | С Б
1-й Посев исходного материала на чашки с простым или сахарным агаром Посев на сахарный бульон Бактерио-копня и посев )азведений исходного материала для счета колоний Кормление котят исходным материалом
'2-й Присмотр чашек, отбор и микроскопия колоний, количественный учет и откол подозрительных колоний на косой агар (каждую на -ве пробирки) В случае отсутствия роста стафилококка при непос едственно* посеве на чашки высев на чашки с агаром и дальнейший анализ по схеме А Пссчет колоний, е> ли рост достаточно интенсивный
3-й Микроскопия чашки с кровяным агаром отколотых культур и высев на: чашки с 0 75% агаром с помещением в эксикатор в атмосферу с ' 0% СОй для токси! ооб азования Молоко для кормления котят Кровяную плазму для реакции птаз-мокоагуляции То же, если рост на 2-й день не был достаточно интенсивный
4-й Просмотр кровяных чашек Получение экстрактов-токсинов и титро-зание гемолизина Введение токсинов внутрнб) ю-шинно мышам Введение гретых токсинов внутри брюшинно котятам и кормление их токсинами Ко-мление котят МОЛОЧНОЙ культурой Просмот реакции плазмокоа-гуляции
5-й Повторный П )<>СМО 1 р к О-вямых чашек Просмотр опытов титрования гемолизина Выдача результ На людение над животными ата анализа • Примечания: Обведенные пункты выполняются необязательно. Л Наблюдение над мышами производится дополнительно в течение 3—4 дней.
данного продукта; тем более не дает этого права находка даже большого количества нетоксигенных или слабо токсигенных стафилококков.
В заключение для иллюстрации приводим таблицу результатов испытания'токсинов 15 штаммов стафилококков, выделенных нами в 9 случаях пищевых отравлений, имевших место в Ленинграде з 1944—1945 гг. (табл. 5).
Таблица 5
№ штамма Гемолитический титр токсина Внутрибрюшинное введение токсина мышам № штамма Гемолитический титр токсина Внутрибрюшинное введение токсина мышам
30 1:2 560 Обе пали в 1-е сутки 72 1 6 40 Обе пали в 1-е сутки
31 1:1 280 То же 73 1 1 280 То же
82 1:2 ¿6U 146 1 1 280
92 1:2 560 238 1 2 560
376 1:320 Одна пала в 1-е сутки, 432 1 1 280 »
другая на 2-е сутки 435 1 1 280 я
626 1:5120 Обе пали в 1-е сутки 436 1 2 560 •
667 1:2 560 То же 437 1 320 Одна пала на 3-й сутки,
л ■ другая выжила
Эта таблица показывает убедительность предлагаемых нами проб: титрования гемолитической активности стафилококковых токсинов и внутрибрюшинного введения их мышам. »
Во всех случаях выделенные стафилококки вырабатывали сильные токсины, гемолитический титр которых у 2 мышей был равен 1 : 320, у одной — 1 : 640, у 5 — 1 : 1 280, у 6 — 1 : 2 560 и у одной —1:5 120, т. е. все достаточно высокие, чтобы считать эти штаммы резко токси-генными.
Токсины 13 штаммов убивали мышей при внутрибрюшинном введении в первые же сутки. Лишь два наиболее слабых токсина с титром 1 :320 действовали на мышей не столь энергично: один токсин убил одну мышь на 1-е сутки, другую — на 2-е; другой — убил одну мышь на 3-й сутки, вторая болела, но выжила.
Нам кажется, что эти примеры наглядно показывают целесообразность предлагаемой нами методики.
Выводы
1. Из биохимических и биологических методов испытания культур стафилококков дают возможность отличить токсигенные штаммы от нетоксигенных лишь посев на кровяной агар и реакция плазмокоагуля-ции, но и они не позволяют произвести точный количественный учет токсигенности.
2. При испытании культур и токсинов стафилококков на мышах практически пригодно лишь внутрибрюшинное введение, причем введение токсинов несравненно более эффективно, чем введение культур.
3. Из способов получения токсинов рекомендуется метод Бернета на агаре мягкой консистенции в атмосфере С02. Приводятся условия, соблюдение которых необходимо для получения сильных токсинов.
4. В лабораторной диагностике пищевых отравлений решающее значение имеет определение степени токсигенности выделенных стафилококков. Титрование гемолитической активности их токсинов дает возможность точно определить их силу.
5. Предлагается схема исследования на стафилококки при пищевых отравлениях, основанная главным образом на количественном учете их токсигенности.
6. Вопрос о существовании специфического энтеротоксина нуждается в дополнительном изучении.
Обзор статей, поступивших в редакцию, по вопросам о витаминах
Н. Н. Захаров и Л. Н. Э й н е р. Содержание витамина С в некоторых сырых и кулинарно обработанных овощах. (Из санитарной лаборатории Петроградского района Ленинграда.)
С конца 1943 г. по январь 1945 г. лабораторией Петроградского района Ленинграда было обследовано на содержание аскорбиновой кислоты 300 образцов овощей и других растительных продуктов в сыром и кулинарно обработанном виде. Эта работа была проведена в силу того, что в условиях длительной блокады Ленинграда в целях борьбы с цын-готными заболеваниями и для их предупреждения необходимо было иметь оценку различных продуктов как источников витамина С.
Методика определения содержания витамина и число исследованных образцов различных продуктов авторами не указываются.
Полученные результаты исследования частично приведены в таблице (в скобках авторами указаны числа содержания витамина С, согласно данным, опубликованным в издании НКЗдрава СССР «Нормы суточного потребления витаминов и таблицы содержания витаминов в основных продуктах», 1944).
Продукты свежие в сыром виде Количество витамина С в мг% Продукты квашеные и термически обработанные Количество витамина С в мг%
Капуста цветная .... Репа......... Капуста белокачанная Капуста китайская . . . Кабачки ........ Картофель...... 59 (70) 30 (30) 29 (20) 27 (30) 24 21 (25) 19 18 (15) . 8 (10) 14 (20) Капуста цветная отварная . . Капуста белокачанная квашеная ........... Капуста белокачанная свежая стварная ....... Капуста белокачанная свежая тушеная.......... Турнепс тушеный...... Кабачки отварные ...... , жареные...... Картофель вареный..... , пюре ....... Картофельные котлеты . . . 15 16 (20) 15 1,3 1.2 7 5 5 3 1 3,2
Среди исследованных овощей авторы отмечают цветную капусту как значительный источник витамина С; более слабыми источниками витамина являются брюква, репа, капуста белокачанная, капуста китайская и др.
На протяжении двух лет исследования авторы не могли установить каких-либо сезонных колебаний содержания витамина С в исследованных ими растительных продуктах 1.
■ 1 Непонятное утверждение, поскольку в таблицах авторов содержание витамина С, например, в картофеле указывается равным 8 мг°/о; известно, что после сбора урожая оно равняется 30—40 мг°/о (Н. Я.)- •
