CC BY
63
УДК 619:636.5.616.9 UDC 619:636.5.616.9
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА THE BIOLOGICAL CHARACTERISTIC OF
КЛЕБСИЕЛЛ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ KLEBSIELLA ALLOCATED FROM
БРОЙЛЕРОВ BROILERS
Ольховик Оксана Петровна Olkhovik Oksana Petrovna
научный сотрудник scientific employee
ГНУ Краснодарский НИВИ, Краснодар, Россия GNU Krasnodar NIVI, Krasnodar, Russia
Изучены морфологические, культуральные, био- Biochemical, morphological, cultural properties and
химические свойства и серологический профиль serologic profile of Klebsiella allocated from broilers
клебсиелл, выделенных от бройлеров. Приведены are studied. Data about serologic profile and factors
данные о серологическом профиле и факторах of virulence of 3 kinds of Klebsiella are cited. Hema-
вирулентности 3-х видов клебсиелл. Определена tolytic activity of Klebsiella to erythrocytes of vari-гемолитическая активность клебсиелл к эритро- ous kinds of animals is defined
цитам различных видов животных.
Ключевые слова: БИОЛОГИЧЕСКАЯ Keywords: BIOLOGICAL CHARACTERISTIC OF
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕБСИЕЛЛ, БРОЙЛЕР KLEBSIELLA, BROILER
В настоящее время серьёзной проблемой промышленного птицеводства являются массовые желудочно-кишечные и респираторные болезни, вызываемые различными ассоциациями бактериальных агентов.
Одним из ведущих агентов вызывающих такие заболевания у бройлеров, являются клебсиеллы. В настоящее время недостаточно сведений о биологических, культуральных характеристиках микроорганизма этого рода, выделяемых от бройлеров (Ковалёва Е.П., Рейзис А.П., 1993).
Материалы и методы исследований. Культуральные свойства выделенных микроорганизмов изучали в процессе выращивания на плотных и жидких питательных средах. Особое внимание обращали на форму, величину, структуру и консистенцию колоний. Серологическию типизацию изолятов проводили в РА, по общепринятой методике с типа специфическими сыворотками, изготовленными фирмой «Илья Мечников» НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской АМН. Гемолитическую активность определяли на МПА с добавлением 5% дефибринированной крови различных видов животных. Токсигенность выделенных культур проводили методом биотестирование на инфузориях рода стилонихии и по тесту отёка лапки белых мышей.
Результаты исследований. Морфокультуральные и биохимические свойства изучили у 257 выделенных от птиц культур клебсиелл. При микроскопии клебсиеллы представляли собой грамотрицательные палочки с закруглёнными концами, длина и толщина которых колебалась от 0,6 до 6 мкм и от 0,3 до 1,5 мкм, соответственно, располагающиеся единично, парами или короткими цепочками. Все выделенные культуры имели капсулу. Однако после длительного культивирования на питательных средах некоторые штаммы (15,2% или 39 культур) теряли способность к капсулообра-зованию, другие, наоборот, сохраняли капсулу в течение всего срока исследований. Восстановление капсул отмечали после пассирования клебсиелл через углеродсодержащие среды (МПБ с 2% содержанием сахаров: глюкозы, лактозы, сахарозы) или организм лабораторных животных (белые мыши).
Все выделенные от бройлеров культуры клебсиелл хорошо росли в аэробных условиях на обычных питательных средах при температуре от 200С до 430С, при рН от 5,5 до 8,2. Оптимальная температура роста 37 -380 С, оптимум рН - 7,2- 7,4.
При культивировании клебсиелл на МПБ наблюдалось интенсивное помутнение среды с одновременным образованием слизистого осадка. Некоторые штаммы (77% или 197 культур) образовывали пристеночное кольцо и плёнку, что свидетельствует о наличии у них фимбрий.
На МПА клебсиеллы формировали круглые, блестящие колонии беловато-серого цвета, диаметром 1, 0 - 3,0 мм, в слизистые в 54,9% случаев.
На висмут-сульфит агаре все изученные культуры клебсиелл формировали блестящие круглые колонии коричневые (у 89,1% - 228 культур), или прозрачные, как слизистые (57,6% - 148 культур), так и не слизистые (42,4 % или 109 изолятов), размерами от 0,3 до 2,5 мм. Штаммы К. гЫпо-вЫеготаЙБ и К. 07аепае формируют выпуклые, гладкие колонии Б формы, а К. оху1:оса - плоские и шероховатые - Я формы.
На агаре Эндо в большинстве случаев - 252 культуры (98,1%) росли колонии малинового цвета различной интенсивности - лактозапози-тивные штаммы и 7 культур (1,9%) образовывали колонии розового цвета - лактозанегативные штаммы. Все культуры К. оху1:оса формировали колонии бледно-розового цвета - то есть не ферментировали лактозу. Диаметр колоний 24 часовых культур на среде Эндо варьировал от 0,5 до 2 мм.
Все культуры клебсиелл, изолированные от бройлеров продуцировали 5-аминосалицилатдекарбоксилазу. На специализированной дифференциальной питательной среде «КЛЕБСИЕЛЛА 5-АСК-20», образовывали вокруг колоний широкую зону чёрно-коричневого цвета - в результате образования пара-аминофенола.
На 5% кровяном агаре с дефибринированной крови барана К. оху1:оса образовывала круглые блестящие неслизистые колонии серовато-белого и серовато-желтого цвета, диаметром 1,7 - 7,0 мм, а К. гЫповсЬготайБ, К. о7аепае - слизистые серого цвета, диаметром 0,8 - 4,5 мм.
Все колонии клебсиелл на скошенном агаре были прозрачны в проходящем свете и имели розово-дымчатый или оранжево-дымато-зеленоватый тип свечения.
Культуры клебсиелл выделенные от бройлеров обладали высокой биохимической активностью (таблица 1).
Как видно из данных таблицы 1, все культуры К. гЫповЫеготаЙБ сбраживали глюкозу, маннит, инозит, сорбит, арабинозу и мальтозу, 88,9% культур ферментировали сахарозу, 99,2% давали положительную реакцию с малонатом натрия и 100% культур - отрицательную с цитратом натрия. 91,7% культур К. гЫповсЬготайБ отрицательно реагировали с цитратом натрия с глюкозой, 100% - не продуцировали индол и сероводород, не обладали уреазной активностью.
К. о7аепае в 25% положительно реагировала с цитратом натрия и продуцировала лизиндекарбоксилазу, 75% культур обладали ферментативной активностью в отношении лактозы и сахарозы, 50% продуцировали в-галактидазу и сбраживали сорбит, 25% - инозит, с образованием кислоты.
Культура К. оху1:оса, выделенная от бройлеров, отрицательно реагировала в тесте с малонатом натрия, продуцировала индол, в - галактидазу и ацетилметилкарбинол, обладала уреазной активностью, активно ферментировала сахара.
Серологический профиль клебсиелл определяли по типу капсульного антигена.
Для стимуляции капсулообразования клебсиелл культивировали на агаровой среде Ворфеля - Фергюсона в течение 24 часов. Серологическую идентификацию проводили в реакции агглютинации на стекле, смешивая 10 мкл смыва агаровых культур в концентрации 1010 - 1011 кл/мл в физиологическом растворе рН - 7,2 с 30 мкл агглютинирующей капсульной сыворотки.
В результате проведенных исследований установили, что все 252 культуры К. гЫповЫеготайв (100%) относились к серогруппе К - 5, 75% культур К. о7аепае - к К - 68 и 25% - к К - 25. Культура К. оху1:оса - к сероварианту К - 70 (таблица 2).
Таблица 1
Ферментативная характеристика клебсиелл выделенных от бройлеров.
№ п/п тест или субстрат К.гЫповс1егоша-іїб п=252 К. 07аепае п=4 К. охуіоса п=1
количество позитивных % количество позитивных % количество позитивных %
1. цитрат натрия 0 0 1 25,0 1 100
2. малонат натрия 250 99,2 0 0 0 0
3. цитр.натрия с гл 21 8,3 0 0 1 100
4. лизин 0 0 1 25,0 1 100
5. аргинин 0 0 0 0 0 0
6. орнитин 0 0 0 0 0 0
7. фенилаланин 0 0 0 0 0 0
8. индол 0 0 0 0 1 100
9. ацетилметил- кар. 0 0 0 0 1 100
10. уреаза 0 0 0 0 1 100
11. сероводород 0 0 0 0 0 0
12. глюкоза 252 100 4 100 1 100
13. Р-галактидаза 0 0 2 50,0 1 100
14. лактоза 0 0 3 75,0 1 100
15. маннит 252 100 4 100 1 100
16. сахароза 224 88,9 3 75,0 1 100
17 инозит 252 100 1 25,0 1 100
18. сорбит 252 100 2 50,0 1 100
19. арабиноза 252 100 4 100 1 100
20. мальтоза 252 100 4 100 1 100
Наличия двух и более типов К-антигена у изученных клебсиелл не выявили.
Таблица 2
Антигенная структура клебсиелл, выделенных от бройлеров.
n=257
Виды рода Klebsiella Тип К- антигена Положительно реагировало:
культур %
K. rhinoscleromatis K5 252 100,0
K. ozaenae K68 3 75,0
K. ozaenae K25 1 25,0
K. oxytoca K70 1 100,0
Ферментативная активность клебсиелл различных сероваров одного вида различалась: Культуры K. ozaenae, отнесённые к серологическому варианту К - 68, в отличие от серологического типа К - 25, отрицательно реагировали с цитратом натрия, не продуцировали лизиндекарбоксила-http://ej .kubagro.ru/2009/05/pdf/11.pdf
зу и не сбраживали инозит, но активно ферментировали лактозу и сахарозу.
Таким образом, культуры клебсиелл, выделенные от бройлеров обладали значительной вариабельностью морфологических, культуральных и биохимических свойств, но имели узкий спектр сероваров.
Патогенность выделенных от птиц изолятов клебсиелл определяли на беспородных белых мышах, весом 18 - 20 грамм, при внутрибрюшин-ном заражении смывами агаровых суточных культур и бульонными 24часовыми культурами в объеме 0,5 мл/ мышь.
Установили, что все выделенные из инкубационных яиц, замерших эмбрионов, вынужденно убитых и павших цыплят бройлеров и взрослой птицы культуры клебсиелл патогенны для белых мышей. Гибель животных вызывали как суточные агаровые, так и бульонные культуры.
При внутрибрюшинном заражении смывами агаровых культур гибель мышей регистрировали через 18-24 часа. В более короткие сроки животные гибли после введения бульонной культуры (5 - 7 часов), что, по нашему мнению, свидетельствует о наличии экзотоксина. У большинства выделенных штаммов клебсиелл (241 культура или 93,8%) ЬВ50 находилась в пределах 400-600 млн. м. т./мышь, 16 культур или 6,2% были более вирулентны - ЬВ50 - 200-250 млн. м. т./мышь. Слизистые культуры К. гЫповЫеготайБ, К. о7аепае обладающие мощной капсулой, оказались более вирулентными по отношению к белым мышам, чем бескапсульные К. оху1:оса. При заражении минимальными дозами (50 млн. м. т./мышь), гибель мышей регистрировали через 10-14 дней. Оставшиеся в живых животные в течение 18-20 дней являлись бактерионосителями - при убое мышей по истечении указанного срока из крови, печени и селезёнки выделяли
2 3
исходные культуры клебсиелл в концентрации 10 - 10 КОЕ/мл.
Одним из факторов патогенности клебсиелл, является цитотоксичность (гемолитическая активность). Гемолизины состоят из полипептидов
и липополисахаридов, обладающих способностью лизировать эритроциты различных видов животных.
Изучение гемолитической активности 257 штаммов клебсиелл выделенных от бройлеров (таблица 3), проводили на 2% мясопептонном агаре с добавлением 1% глюкозы и 5% дефибринированной крови наиболее часто применяемых в лабораторной практике видов животных: барана, кролика, морской свинки. Предварительно культуры клебсиелл различных видов в течение 18-20 часов культивировали на бульоне Хоттингера.
Как свидетельствуют данные, приведенные в таблице 3, при использовании дефибринированной крови барана 100% культур клебсиелл проявляли гемолитическую активность, 79 культур (30,7%) продуцировали в- гемолизины, а 178 культур (69,3%) - а - гемолизины.
Гемолитической активностью по отношению к эритроцитам кролика обладали 184 культуры или 71,5%, формируя вокруг колоний зону а - гемолиза, а 73 культуры или 28,5% не проявляли гемолитической активности к эритроцитам этого животного. Не одна из изучаемых культур клебсиелл не гемолизировала эритроциты морской свинки.
Таблица 3
Гемолитическая активность рода Klebsiella, выделенных от бройлеров.
культуры МПА+ 1% глюкоза + 5% дефибринированной крови
барана кролика морс. свинки
тип гемолиза тип гемолиза тип гемолиза
в а Y в а Y в а Y
X Klebsiella n = 257 79/ 30,7 178/ 69,3 - 184/ 71,5 73/ 28,5 - - 257/ 100
В том числе:
K. rhinoscleromatis n = 252 79/ 31,3 173/ 68,7 - - 184/ 73,0 68 27,0 - - 252/ 100
К. 07аепае - 4/ - - - 4 - - 4
п = 4 - 100 100 100
К. оху1:оса - 1/ - - - 1 - - 1
п = 1 - 100 100 100
Примечание: в числителе - количество культур; в знаменателе - % соотношения.
Исходя из результатов, полученных при изучении гемолитической активности культур клебсиелл выделенных от птиц, можно сделать вывод, что на агаре с использованием 5% дефибринированной крови барана гемолитическая способность клебсиелл выражена более интенсивно (в и а гемолиз). При использовании агара с добавлением 5% дефибринирован-ной крови кролика гемолитическуя активность у клебсиелл менее выражена (а и у гемолиз), а в отношении эритроцитов морской свинки гемолитическая активность не проявлялась у гемолиз.
Способность к токсинообразованию, по мнению ряда исследователей (Бондаренко В.М. и др., 1986; Лагуее А., Авпаш Р., 1982; КаШсИ К е! а1., 1982; Ivanof А. е! а1., 1983), является одним из основных факторов патогенности клебсиелл.
Продукцию экзотоксинов у изучаемых культур определяли по тесту отека лапки на белых беспородных мышках.
Установили, что при введении фильтрата 12,4% (32 культуры) клеб-сиелл масса лапы мыши вследствие её отёка увеличилась на 20 - 34 мг -слаботоксичные штаммы. Количество умеренно токсичных возбудителей было больше - 36,2% или 93 культуры, при введении фильтратов которых масса лапы мышки увеличивалась на 38 - 62 мг и 8,6% - 22 культуры -высокотоксичные штаммы, масса лапки мышки увеличивалась на 66 - 97 мг; Экзотоксигенная активность отсутствовала у 110 протестированных культур, или 42,8%, при введении фильтратов этих культур клебсиелл увеличение массы лапы мышки было менее 12 мг.
Таким образом, установили, что экзотоксины продуцировало 57,2% или 147 культур выделенных от бройлеров клебсиелл.
Максимальное накопление токсинов в фильтратах культур клебсиелл отмечали на 3-5 сутки культивирования.
Биотестирование общей токсигенности выделенных клебсиелл проводили на инфузориях стилонихиях.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что 64,6% или 166 культур Klebsiella способны продуцировать токсины, то есть 7,4% или 19 культур кроме экзотоксина продуцировали токсины других типов.
Процент погибших стилонихий после контакта со средой культивирования Klebsiella, продуцирующих гемолизины и токсины - 41,7. Количество лизированных инфузорий после контакта со средой культивирования Klebsiella, продуцирующие только гемолизины было в 1, 76 раз ниже и равнялось 23,7%.
Антилизоцимный признак у клебсиелл способствует подавлению фагоцитоза, а также сохранению и возможно, размножению обладающих им штаммов в фаголизосоме. Установлено, что антилизоцимный фактор участвует в инфекционном процессе и с полным основанием, может быть причислен к факторам патогенности. При наличии штаммов такого типа у больных наблюдается более тяжёлое течение заболевания и более длительное выделение возбудителя (Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Пота-туркина-Нестарова Н.И., 1996).
При изучении антилизоцимной активности клебсиелл экспресс - методом на плотной питательной среде установили, что все 257 (100%) выделенные от птиц культуры клебсиелл обладали антилизоцимной активностью. Средняя величина АЛА клебсиелл составила - 4,9 ± 0,2 мкг (концентрация лизоцима мкг/мл).
Анализируя полученные результаты можно констатировать, что 64,6% выделенных от бройлеров культур клебсиелл обладали токсиген-ной и 100% - антилизоцимной и гемолитической активностью.
УДК 619:636.5.616.9 UDC 619:636.5.616.9
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА THE BIOLOGICAL CHARACTERISTIC OF
КЛЕБСИЕЛЛ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ KLEBSIELLA ALLOCATED FROM
БРОЙЛЕРОВ BROILERS
Ольховик Оксана Петровна Olkhovik Oksana Petrovna
научный сотрудник scientific employee
ГНУ Краснодарский НИВИ, Краснодар, Россия GNU Krasnodar NIVI, Krasnodar, Russia
Изучены морфологические, культуральные, био- Biochemical, morphological, cultural properties and
химические свойства и серологический профиль serologic profile of Klebsiella allocated from broilers
клебсиелл, выделенных от бройлеров. Приведены are studied. Data about serologic profile and factors
данные о серологическом профиле и факторах of virulence of 3 kinds of Klebsiella are cited. Hema-
вирулентности 3-х видов клебсиелл. Определена tolytic activity of Klebsiella to erythrocytes of vari-
гемолитическая активность клебсиелл к эритро- ous kinds of animals is defined
цитам различных видов животных.
Ключевые слова: БИОЛОГИЧЕСКАЯ Keywords: BIOLOGICAL CHARACTERISTIC OF
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕБСИЕЛЛ, БРОЙЛЕР KLEBSIELLA, BROILER
В настоящее время серьёзной проблемой промышленного птицеводства являются массовые желудочно-кишечные и респираторные болезни, вызываемые различными ассоциациями бактериальных агентов.
Одним из ведущих агентов вызывающих такие заболевания у бройлеров, являются клебсиеллы. В настоящее время недостаточно сведений о биологических, культуральных характеристиках микроорганизма этого рода, выделяемых от бройлеров (Ковалёва Е.П., Рейзис А.П., 1993).
Материалы и методы исследований. Культуральные свойства выделенных микроорганизмов изучали в процессе выращивания на плотных и жидких питательных средах. Особое внимание обращали на форму, величину, структуру и консистенцию колоний. Серологическию типизацию изолятов проводили в РА, по общепринятой методике с типа специфическими сыворотками, изготовленными фирмой «Илья Мечников» НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской АМН. Гемолитическую активность определяли на МПА с добавлением 5% дефибринированной крови различных видов животных. Токсигенность выделенных культур проводили методом биотестирование на инфузориях рода стилонихии и по тесту отёка лапки белых мышей.
Результаты исследований. Морфокультуральные и биохимические свойства изучили у 257 выделенных от птиц культур клебсиелл. При микроскопии клебсиеллы представляли собой грамотрицательные палочки с закруглёнными концами, длина и толщина которых колебалась от 0,6 до 6 мкм и от 0,3 до 1,5 мкм, соответственно, располагающиеся единично, парами или короткими цепочками. Все выделенные культуры имели капсулу. Однако после длительного культивирования на питательных средах некоторые штаммы (15,2% или 39 культур) теряли способность к капсулообра-зованию, другие, наоборот, сохраняли капсулу в течение всего срока исследований. Восстановление капсул отмечали после пассирования клебси-елл через углеродсодержащие среды (МПБ с 2% содержанием сахаров: глюкозы, лактозы, сахарозы) или организм лабораторных животных (белые мыши).
Все выделенные от бройлеров культуры клебсиелл хорошо росли в аэробных условиях на обычных питательных средах при температуре от 200С до 430С, при рН от 5,5 до 8,2. Оптимальная температура роста 37 -380 С, оптимум рН - 7,2- 7,4.
При культивировании клебсиелл на МПБ наблюдалось интенсивное помутнение среды с одновременным образованием слизистого осадка. Некоторые штаммы (77% или 197 культур) образовывали пристеночное кольцо и плёнку, что свидетельствует о наличии у них фимбрий.
На МПА клебсиеллы формировали круглые, блестящие колонии беловато-серого цвета, диаметром 1, 0 - 3,0 мм, в слизистые в 54,9% случаев.
На висмут-сульфит агаре все изученные культуры клебсиелл формировали блестящие круглые колонии коричневые (у 89,1% - 228 культур), или прозрачные, как слизистые (57,6% - 148 культур), так и не слизистые (42,4 % или 109 изолятов), размерами от 0,3 до 2,5 мм. Штаммы К. гЫпо-вЫегошайв и К. 07аепае формируют выпуклые, гладкие колонии Б формы, а К. оху1:оса - плоские и шероховатые - Я формы.
На агаре Эндо в большинстве случаев - 252 культуры (98,1%) росли колонии малинового цвета различной интенсивности - лактозапози-тивные штаммы и 7 культур (1,9%) образовывали колонии розового цвета - лактозанегативные штаммы. Все культуры К. охуоса формировали колонии бледно-розового цвета - то есть не ферментировали лактозу. Диаметр колоний 24 часовых культур на среде Эндо варьировал от 0,5 до 2 мм.
Все культуры клебсиелл, изолированные от бройлеров продуцировали 5-аминосалицилатдекарбоксилазу. На специализированной дифференциальной питательной среде «КЛЕБСИЕЛЛА 5-АСК-20», образовывали вокруг колоний широкую зону чёрно-коричневого цвета - в результате образования пара-аминофенола.
На 5% кровяном агаре с дефибринированной крови барана К. оху1:оса образовывала круглые блестящие неслизистые колонии серовато-белого и серовато-желтого цвета, диаметром 1,7 - 7,0 мм, а К. гЫповс1егота118, К. о7аепае - слизистые серого цвета, диаметром 0,8 - 4,5 мм.
Все колонии клебсиелл на скошенном агаре были прозрачны в проходящем свете и имели розово-дымчатый или оранжево-дымато-зеленоватый тип свечения.
Культуры клебсиелл выделенные от бройлеров обладали высокой биохимической активностью (таблица 1).
Как видно из данных таблицы 1, все культуры К. гЫповЫеготаЙБ сбраживали глюкозу, маннит, инозит, сорбит, арабинозу и мальтозу, 88,9% культур ферментировали сахарозу, 99,2% давали положительную реакцию с малонатом натрия и 100% культур - отрицательную с цитратом натрия. 91,7% культур К. гЫповсЬготайБ отрицательно реагировали с цитратом натрия с глюкозой, 100% - не продуцировали индол и сероводород, не обладали уреазной активностью.
К. о7аепае в 25% положительно реагировала с цитратом натрия и продуцировала лизиндекарбоксилазу, 75% культур обладали ферментативной активностью в отношении лактозы и сахарозы, 50% продуцировали в-галактидазу и сбраживали сорбит, 25% - инозит, с образованием кислоты.
Культура К. охуоса, выделенная от бройлеров, отрицательно реагировала в тесте с малонатом натрия, продуцировала индол, в - галактидазу и ацетилметилкарбинол, обладала уреазной активностью, активно ферментировала сахара.
Серологический профиль клебсиелл определяли по типу капсульного антигена.
Для стимуляции капсулообразования клебсиелл культивировали на агаровой среде Ворфеля - Фергюсона в течение 24 часов. Серологическую идентификацию проводили в реакции агглютинации на стекле, смешивая 10 мкл смыва агаровых культур в концентрации 1010 - 1011 кл/мл в физиологическом растворе рН - 7,2 с 30 мкл агглютинирующей капсульной сыворотки.
В результате проведенных исследований установили, что все 252 культуры К. ЛтовЫештайв (100%) относились к серогруппе К - 5, 75% культур К. о7аепае - к К - 68 и 25% - к К - 25. Культура К. оху!оса - к сероварианту К - 70 (таблица 2).
Таблица 1
Ферментативная характеристика клебсиелл выделенных от бройлеров.
№ п/п тест или субстрат К.гЫповс1егоша-іїб п=252 К. 07аепае п=4 К. охуіоса п=1
количество позитивных % количество позитивных % количество позитивных %
1. цитрат натрия 0 0 1 25,0 1 100
2. малонат натрия 250 99,2 0 0 0 0
3. цитр.натрия с гл 21 S,3 0 0 1 100
4. лизин 0 0 1 25,0 1 100
5. аргинин 0 0 0 0 0 0
6. орнитин 0 0 0 0 0 0
7. фенилаланин 0 0 0 0 0 0
S. индол 0 0 0 0 1 100
9. ацетилметил- кар. 0 0 0 0 1 100
10. уреаза 0 0 0 0 1 100
11. сероводород 0 0 0 0 0 0
12. глюкоза 252 100 4 100 1 100
13. Р-галактидаза 0 0 2 50,0 1 100
14. лактоза 0 0 3 75,0 1 100
15. маннит 252 100 4 100 1 100
16. сахароза 224 SS,9 3 75,0 1 100
17 инозит 252 100 1 25,0 1 100
1S. сорбит 252 100 2 50,0 1 100
19. арабиноза 252 100 4 100 1 100
20. мальтоза 252 100 4 100 1 100
Наличия двух и более типов К-антигена у изученных клебсиелл не выявили.
Таблица 2
Антигенная структура клебсиелл, выделенных от бройлеров.
n=257
Виды рода Klebsiella Тип К- антигена Положительно реагировало:
культур %
K. rhinoscleromatis K5 252 100,0
K. ozaenae K6S 3 75,0
K. ozaenae K25 1 25,0
K. oxytoca K70 1 100,0
Ферментативная активность клебсиелл различных сероваров одного вида различалась: Культуры К. о7аепае, отнесённые к серологическому варианту К - 68, в отличие от серологического типа К - 25, отрицательно реагировали с цитратом натрия, не продуцировали лизиндекарбоксила-http://ej .kubagro.ru/2009/05/pdf/11.pdf
зу и не сбраживали инозит, но активно ферментировали лактозу и сахарозу.
Таким образом, культуры клебсиелл, выделенные от бройлеров обладали значительной вариабельностью морфологических, культуральных и биохимических свойств, но имели узкий спектр сероваров.
Патогенность выделенных от птиц изолятов клебсиелл определяли на беспородных белых мышах, весом 18 - 20 грамм, при внутрибрюшин-ном заражении смывами агаровых суточных культур и бульонными 24часовыми культурами в объеме 0,5 мл/ мышь.
Установили, что все выделенные из инкубационных яиц, замерших эмбрионов, вынужденно убитых и павших цыплят бройлеров и взрослой птицы культуры клебсиелл патогенны для белых мышей. Гибель животных вызывали как суточные агаровые, так и бульонные культуры.
При внутрибрюшинном заражении смывами агаровых культур гибель мышей регистрировали через 18-24 часа. В более короткие сроки животные гибли после введения бульонной культуры (5 - 7 часов), что, по нашему мнению, свидетельствует о наличии экзотоксина. У большинства выделенных штаммов клебсиелл (241 культура или 93,8%) ЬВ50 находилась в пределах 400-600 млн. м. т./мышь, 16 культур или 6,2% были более вирулентны - ЬВ50 - 200-250 млн. м. т./мышь. Слизистые культуры К. ЛтовЫештаЙБ, К. о7аепае обладающие мощной капсулой, оказались более вирулентными по отношению к белым мышам, чем бескапсульные К. охуоса. При заражении минимальными дозами (50 млн. м. т./мышь), гибель мышей регистрировали через 10-14 дней. Оставшиеся в живых животные в течение 18-20 дней являлись бактерионосителями - при убое мышей по истечении указанного срока из крови, печени и селезёнки выделяли
2 3
исходные культуры клебсиелл в концентрации 10 - 10 КОЕ/мл.
Одним из факторов патогенности клебсиелл, является цитотоксичность (гемолитическая активность). Гемолизины состоят из полипептидов
и липополисахаридов, обладающих способностью лизировать эритроциты различных видов животных.
Изучение гемолитической активности 257 штаммов клебсиелл выделенных от бройлеров (таблица 3), проводили на 2% мясопептонном агаре с добавлением 1% глюкозы и 5% дефибринированной крови наиболее часто применяемых в лабораторной практике видов животных: барана, кролика, морской свинки. Предварительно культуры клебсиелл различных видов в течение 18-20 часов культивировали на бульоне Хоттингера.
Как свидетельствуют данные, приведенные в таблице 3, при использовании дефибринированной крови барана 100% культур клебсиелл проявляли гемолитическую активность, 79 культур (30,7%) продуцировали в- гемолизины, а 178 культур (69,3%) - а - гемолизины.
Гемолитической активностью по отношению к эритроцитам кролика обладали 184 культуры или 71,5%, формируя вокруг колоний зону а - гемолиза, а 73 культуры или 28,5% не проявляли гемолитической активности к эритроцитам этого животного. Не одна из изучаемых культур клебсиелл не гемолизировала эритроциты морской свинки.
Таблица 3
Гемолитическая активность рода Klebsiella, выделенных от бройлеров.
культуры МПА+ 1% глюкоза + 5% дефибринированной крови
барана кролика морс. свинки
тип гемолиза тип гемолиза тип гемолиза
в а Y в а Y в а Y
X Klebsiella n = 257 79/ 30,7 17S/ 69,3 - 1S4/ 71,5 73/ 2S,5 - - 257/ 100
В том числе:
K. rhinoscleromatis n = 252 79/ 31,3 173/ 6S,7 - - 1S4/ 73,0 6S 27,0 - - 252/ 100
К. 07аепае - 4/ - - - 4 - - 4
п = 4 - 100 100 100
К. оху1:оса - 1/ - - - 1 - - 1
п = 1 - 100 100 100
Примечание: в числителе - количество культур; в знаменателе - % соотношения.
Исходя из результатов, полученных при изучении гемолитической активности культур клебсиелл выделенных от птиц, можно сделать вывод, что на агаре с использованием 5% дефибринированной крови барана гемолитическая способность клебсиелл выражена более интенсивно (в и а гемолиз). При использовании агара с добавлением 5% дефибринирован-ной крови кролика гемолитическуя активность у клебсиелл менее выражена (а и у гемолиз), а в отношении эритроцитов морской свинки гемолитическая активность не проявлялась у гемолиз.
Способность к токсинообразованию, по мнению ряда исследователей (Бондаренко В.М. и др., 1986; Лагуее А., Авпаш Р., 1982; КаШсИ К е! а1., 1982; Ivanof А. е! а1., 1983), является одним из основных факторов патогенности клебсиелл.
Продукцию экзотоксинов у изучаемых культур определяли по тесту отека лапки на белых беспородных мышках.
Установили, что при введении фильтрата 12,4% (32 культуры) клеб-сиелл масса лапы мыши вследствие её отёка увеличилась на 20 - 34 мг -слаботоксичные штаммы. Количество умеренно токсичных возбудителей было больше - 36,2% или 93 культуры, при введении фильтратов которых масса лапы мышки увеличивалась на 38 - 62 мг и 8,6% - 22 культуры -высокотоксичные штаммы, масса лапки мышки увеличивалась на 66 - 97 мг; Экзотоксигенная активность отсутствовала у 110 протестированных культур, или 42,8%, при введении фильтратов этих культур клебсиелл увеличение массы лапы мышки было менее 12 мг.
Таким образом, установили, что экзотоксины продуцировало 57,2% или 147 культур выделенных от бройлеров клебсиелл.
Максимальное накопление токсинов в фильтратах культур клебсиелл отмечали на 3-5 сутки культивирования.
Биотестирование общей токсигенности выделенных клебсиелл проводили на инфузориях стилонихиях.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что 64,6% или 166 культур Klebsiella способны продуцировать токсины, то есть 7,4% или 19 культур кроме экзотоксина продуцировали токсины других типов.
Процент погибших стилонихий после контакта со средой культивирования Klebsiella, продуцирующих гемолизины и токсины - 41,7. Количество лизированных инфузорий после контакта со средой культивирования Klebsiella, продуцирующие только гемолизины было в 1, 76 раз ниже и равнялось 23,7%.
Антилизоцимный признак у клебсиелл способствует подавлению фагоцитоза, а также сохранению и возможно, размножению обладающих им штаммов в фаголизосоме. Установлено, что антилизоцимный фактор участвует в инфекционном процессе и с полным основанием, может быть причислен к факторам патогенности. При наличии штаммов такого типа у больных наблюдается более тяжёлое течение заболевания и более длительное выделение возбудителя (Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Пота-туркина-Нестарова Н.И., 1996).
При изучении антилизоцимной активности клебсиелл экспресс - методом на плотной питательной среде установили, что все 257 (100%) выделенные от птиц культуры клебсиелл обладали антилизоцимной активностью. Средняя величина АЛА клебсиелл составила - 4,9 ± 0,2 мкг (концентрация лизоцима мкг/мл).
Анализируя полученные результаты можно констатировать, что 64,6% выделенных от бройлеров культур клебсиелл обладали токсиген-ной и 100% - антилизоцимной и гемолитической активностью.
