CC BY
149
126
Химия
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2014, № 1 (1), с. 126-129
УДК 612.461.251
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЛАТОНИНА В МОЧЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
© 2014 г. М.А. Шаленкова,1 З.Д. Михайлова/ Т.А. Басалгина,2 А.П. Шишкина3
Городская клиническая больница № 38, Н. Новгород 2Клинический диагностический центр, Н. Новгород 3«Химаналитсервис», Дзержинск
zinaida .mihailowa@yandex.ru
Поступила в редакцию 31.10.2012
Количественное определение метаболита мелатонина в моче в клинической лаборатории проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием твердофазной экстракции на концентрирующих патронах Диапак П. Разделение образцов проводили на колонке Eurospher 100-5 С 18 с УФ-детекцией при 223 нм. Элюент ацетонитрил-вода-изопропиловый спирт (объемное соотношение 30:70:0.1), скорость потока 1000 мкл/мин, давление 100 атм, температура комнатная. Простота, воспроизводимость и достаточная чувствительность метода в сочетании с возможностью его реализации на стандартном хроматографическом оборудовании (изократический насос высокого давления и УФ-детектор) делают его пригодным для клинического применения.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, мелатонин, моча, сверхсшитый полистирол, ишемическая болезнь сердца.
Введение
В настоящее время большой интерес проявляется к изучению физиологических свойств мелатонина (МТ) и путей его взаимодействия с различными системами организма. Для количественного определения МТ в различных биологических жидкостях могут быть использованы такие методы, как радиоиммунологический, биоопределение, флуориметрия, газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), определение с помощью ядерного магнитного резонанса или атомного силового микроскопа, спектрометрия (УФ), масс-спектрометрия, иммуноферментный анализ. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки [1]. Существующие методы ВЭЖХ-анализа реализуются, в основном, с использованием электрохимической детекции. В то же время можно определять МТ (его метаболит) в моче твердофазной экстракцией (ТФЭ) на сверхсшитом полистироле и быстрым разделением на колонках в обращенно-фазном варианте и детектированием МТ на УФ-детекторе [2-6].
Цель данной работы - использование метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения метаболита МТ в клинической практике.
Материалы и методы. Биоматериал. Реактивы
Пробы мочи для определения уровня секреции МТ по экскреции его основного метаболита
6-гидроксимелатонина (6-ГОМТ) собирали в отдельные емкости в период с 23.00 до 08.00 и с 08.00 до 23.00 часов. Пациенты информировались о недопустимости включения источников света в течение времени сбора проб. Замерялся общий объем мочи в пробах. Моча взбалтывалась, и из середины емкости отбиралось по 5 мл в полипропиленовую пробирку «Deltalab» (Испания). Пробы замораживались и хранились при температуре -20С до момента проведения анализа. Каждая проба использовалась в рабочем процессе только один раз и повторному замораживанию не подвергалась.
Стандарт 6-гидроксимелатонина («Sigma») готовили в день исследования (метанолиз), проводили ТФЭ одновременно и аналогично с исследуемыми пробами: стандарт известной
концентрации готовили в растворе фосфатного буфера, 5 мл этого раствора брали для ТФЭ аналогично пробам мочи. Ацетонитрил - HPLC, «Криохром», Санкт-Петербург; метанол - «х. ч.», «Вектон», Санкт-Петербург; хлороформ -стабилизированный 1% этанола, «х. ч.», ЗАО «ЭКОС-1», Москва.
Аппаратура и оборудование
Хроматограф жидкостный «Хромос-ЖХ-301» (ООО «Хромос», Дзержинск, 2011 г.). Спектрофотометрический детектор «Sapphire-600» («Ecom», Чехия), насос высокого давления «Alpha-10» («Ecom», Чехия), ручной инжектор Д-4 («Ecom», Чехия) с петлей на 20 мкл, ком-
Таблица
Воспроизводимость результатов анализов по времени удержания и площади хроматографического пика (п = 7)
№ Время удержания, мин Площадь хроматографического пика, мВ/мин Концентрация, нг/мл
t1 ¿2 А S1 S2 А K1 K2 А
1 9.21 9.32 0.11 0.21 0.20 0.01 0.20 0.22 0.02
2 8.93 8.63 0.30 2,04 2,81 0.77 1.21 1.З1 0.30
3 8.2З 8.24 0.01 0.76 0.71 0.0З 0.49 0.4З 0.04
4 8.29 8.7З 0.46 0.67 0.37 0.30 0.39 0.38 0.01
З 8.47 8.17 0.30 0.З3 0.З4 0.01 0.З1 0.З2 0.01
6 8.81 8.31 0.З0 0.29 0.21 0.08 0.04 0.0З 0.01
7 8.27 8.16 0.11 0.14 0.12 0.02 0.16 0.17 0.01
M±SD 8.6± 0.38 8.З1± 0.42 - 0.81± 1.01 0.8З± 1.32 - 0.43± 0.39 0.47± 0.49 -
í-критерий Стьюдента 0.23 - 0.37 - 0.18 -
пьютерная хроматографическая программа «Хромос», версия 2-12-29 (ООО «Хромое», Дзержинск). Колонка Eurospher 100-5 С 18, размер зерна 5 мкм, диаметр 4 мм, длина 150 мм («Knauer», Германия). УФ-детекция при 223 нм. Элюент: ацетонитрил-вода-изопропиловый спирт (объемные соотношения 30:70:0.1). Скорость потока 1000 мкл/мин. Картриджи «Диапак-П» объемом 3 см3, содержащие 30 мг сверхсши-того полистирола (Purosep-200).
ТФЭ осуществляли с помощью манифолда на 12 картриджей и вакуумного микронасоса DAP-6D (Япония). Упаривание производили на водяной бане при температуре 60-65°С.
Экспериментальная часть
Метод измерений основан на определении 6-ГОМТ в моче на аналитической колонке в обра-щенно-фазном варианте с последующим детектированием на спектрофотометрическом детекторе. Результат анализа получали по методу абсолютной градуировки, используя в качестве параметра для расчета высоту хроматографического пика.
Стандарты без экстракции (без обработки). Для проведения градуировки готовили раствор стандарта с концентрацией 0.4 нг/мл. Для этого предварительно готовили раствор стандарта в метаноле с концентрацией 40 нг/мл. Затем полученный раствор разбавляли фосфатным буфером до концентрации 0.4 нг/мл. 20 мкл стандарта с концентрацией 0.4 нг/мл растворяли в 100 мкл элю-ента и вводили в петлю инжектора.
Гидролиз и экстракция. К 5 мл мочи добавляли равный объем 1% раствора серной кислоты. Нагревали на водяной бане при температуре 60°С в течение 30 мин. Затем выдерживали пробы ~ 2 часа при температуре 20±5°С. Доводили до рН ~ 12.5-13 2.5М раствором NaOH и центрифугировали.
После гидролиза 5 мл пробы вводили самотеком в картридж, предварительно промытый последовательно 2 мл метанола и 2 мл воды.
Скорость загрузки не превышала ~ 0.З мл/мин. После окончания загрузки промывали сорбент 3 мл дистиллированной воды. Высушивали 3-4 мин под небольшим вакуумом (-З InHg) и элюировали З мл смеси хлороформ-метанол (3:1). Элюат упаривали досуха на водяной бане при температуре 60-6З°С. Остаток растворяли в 100 мкл элюента и вводили в петлю инжектора.
Хpcмamcкpaфoя. Перед проведением анализа колонку уравновешивали в течение 30 мин путем непрерывного прокачивания элюента. Затем в петлю инжектора вводили градуировочный раствор и регистрировали пик стандарта. Определение градуировочного коэффициента проводили ежедневно перед началом измерений с помощью программы {^ромос».
Условия построения градуировки и проведения анализа: длина волны 223 нм; элюент - аце-тонитрил-вода-изопропиловый спирт (объемное соотношение 30:70:0.1); скорость потока 1000 мкл/мин.
Ориентировочное время удерживания 6-ГОMT 8-10 минут. Предел обнаружения для 6-ГОMT
0.001нг/мл. Xроматограммы стандарта и исследуемого образца приведены на рис. 1 (а, б).
Статистическая обработка осуществлялась с помощью специализированного пакета прикладных программ «Statistica v.6» для Windows. Количественные данные представлены в виде M±SD, где М - среднее арифметическое, SD -стандартное отклонение. Статистическую значимость различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали статистически значимыми при p < 0.0З.
Результаты и их обсуждение
Исследовали пробы мочи пациентов с разными формами ишемической болезни сердца.
Результаты анализов проб мочи представлены в таблице.
Как видно из таблицы, при проведении парных исследований 7 образцов средние значения
Время, мин
Рис. 1. Xроматограммы стандарта 0.4 нг/мл, разб. элюентом 100 мкл (а) и экстракта мочи пациента со стабильной стенокардией (б). Колонка Eurospher 100-З С 18, размер зерна З мкм, диаметр 4 мм, длина 1З0 мм. УФ-детекция при 223 нм. Элюент: ацетонитрил-вода-изопропиловый спирт (30:70:0,1 v/v/v), 1000 мкл/мин, 100 бар. Концентрация 6-roMT 0,1З7 нг/мл (б)
Н. мВ
1.6
1.4
1.2
1
0.S
0.6
0.4
0.2
0
С (6-ГОМТ), -1- нг/мп
о 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Рис. 2. График градуировочной зависимости между высотой хроматографического пика и концентрацией 6-ГОМТ в моче
и индивидуальные данные по времени удерживания, площади хроматографического пика, концентрации были сопоставимы, достоверных различий не выявлено (р > 0.05).
На рис. 2 представлен график градуировочной зависимости. Полученные данные свидетельствуют о линейной зависимости между высотой хроматографического пика и концентрацией 6-ГОМТ.
Полнота гидролиза исследуемого 6-ГОМТ устанавливалась эмпирическим путем и составляла
85%. Потери при осуществлении процессов сорбции и десорбции исследованного вещества - 20%.
Заключение
Простота, воспроизводимость и достаточная чувствительность метода в сочетании с возможностью его реализации на стандартном хроматографическом оборудовании (изократи-ческом насосе и УФ-детекторе) делают его пригодным для клинического применения.
Авторы статьи выражают благодарность д.м.н. А.А. Дутову за методическую помощь.
Список литературы
1. Мелатонин: теория и практика / Под ред. С.И. Рапопорта, В.А. Голиченкова. М.: Медпрактика-М, 2009. 100 с.
2. Anderson GM. Signal-to-noise optimization of HPLC-fluorometric systems and their application to the analysis of indoles // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. № 294. Р. 51-61.
3. Harumi T, Matsushima S. Separation and assay methods for melatonin and its precursors // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 2000. № 747 (1-2). P. 95-110.
4. Middleton B. Measurement of melatonin and 6-sulphatoxymelatonin // Methods Mol. Biol. 2006. № 324. P. 235-254.
5. Minami M., Takahashi H., Inagaki H. et al. Novel tryptamine-related substances, 5-sulphatoxydiacetyltryp-tamine, 5-hydroxydiacetyltryp-tamine, and reduced melatonin in human urine and the determination of those compounds, 6-sulphato-xymelatonin, and melatonin with fluorometric HPLC // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2009. № 877 (8-9). P. 814-822.
6. Vieira R., Miguez J., Lema M., Aldegunde M. Pineal and plasma melatonin as determined by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Anal. Biochem. 1992. № 205 (2). P. 300-305.
QUANTITATIVE DETERMINATION OF MELATONIN IN URINE BY HPLC M.A Shalenkova, Z.D. Mikhailova, Т.А Basalgina, A.P. Shishkina
The quantitative determination of a urinary melatonin metabolite by HPLC in the clinical laboratory has been carried out using Diapak P solid-phase extraction cartridges. The samples were separated on a Eurospher 100-5-C18 column with ultraviolet detection at 223 nm. Eluent composition was acetonitrile-water-isopropyl alcohol (30:70:0.1) (v/v/v), flow rate was 1000 ^L/min, pressure was 100 bar, the procedure was performed at room temperature. Simplicity, reproducibility and sufficient sensitivity of this method combined with a possibility of its implementation on standard chromatography equipment (an isocratic high-pressure pump and a UV detector) makes it suitable for clinical applications.
Keywords: high-performance liquid chromatography (HPLC), melatonin, urine, ultra cross-linked polystyrene, ischemic heart disease.
References
1. Melatonin: teorija i praktika / Pod red. S.I. Rapo-porta, V.A. Golichenkova. M.: Medpraktika-M, 2009. 100 s.
2. Anderson GM. Signal-to-noise optimization of HPLC-fluorometric systems and their application to the analysis of indoles // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. № 294. P. 51-61.
3. Harumi T, Matsushima S. Separation and assay methods for melatonin and its precursors // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 2000. № 747 (1-2). P. 95-110.
4. Middleton B. Measurement of melatonin and 6-
sulphatoxymelatonin // Methods Mol. Biol. 2006. № 324. P. 235-254.
5. Minami M., Takahashi H., Inagaki H. et al. Novel tryptamine-related substances, 5-sulphatoxydiacetyltryp-tamine, 5-hydroxydiacetyltryp-tamine, and reduced melatonin in human urine and the determination of those compounds, 6-sulphato-xymelatonin, and melatonin with fluorometric HPLC // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2009. № 877 (8-9). P. 814-822.
6. Vieira R., Miguez J., Lema M., Aldegunde M. Pineal and plasma melatonin as determined by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // Anal. Biochem. 1992. № 205 (2). P. 300-305.
