CC BY
54
А. О. Руденко, Л. А. Карцова, К. А. Краснов
НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СВЕРХСШИТОГО ПОЛИСТИРОЛЬНОГО СОРБЕНТА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЭРГОТАМИНА В КРОВИ КРЫС МЕТОДОМ ОБРАЩЁННО-ФАЗОВОЙ ВЭЖХ С ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ*
Введение. Токсичность и биологическая активность алкалоидов спорыньи достаточно хорошо изучены [1—3]. В основе её химического состава 3,4-индолзамещенные алкалоиды двух типов: лизергиновая кислота (эрготамин) и амиды изолизергиновой кислоты (эргокристины). Отравление эрготамином (эрготизм) чаще всего вызывается употреблением зерна, заражённого головками спорыньи рода С1ау1еерв [4-6]. При щелочном гидролизе алкалоидов в зависимости от их конкретного вида могут образовываться фенилаланин, лейцин, изолейцин или валин, а также а-кетокарбоновые кислоты (пировиноградная, диметилпировиноградная, а-кетомасляная кислота) и аммиак.
Описаны различные процедуры, позволяющие извлекать алкалоиды спорыньи из растительных объектов [7, 8]. Они включают жидкостную экстракцию водными растворами винной или молочной кислоты; твердофазную экстракцию с использованием различных сорбционных материалов (силикагель, оксид алюминия, ионообменные смолы) с последующим ВЭЖХ-анализом с УФ-, флуоресцентным или масс-спектрометрическим детектированием [9]. Для снижения расщепления и эпимеризации эрготаминов [10] рекомендуется проводить работу при жёлтом свете и концентрировать экстракты в вакууме при температуре ниже 25 °С либо в токе азота [11, 12].
С использованием жидкостной и твердофазной экстракции удалось выделить фракцию, содержащую более 95 % эрговалина [13].
Метод ВЭЖХ с УФ- или флуоресцентным детектированием является основным для рутинного скрининга и анализа алкалоидов спорыньи в инфицированных продуктах [14-17]. Методика, включающая экстракцию токсинов щелочным метанолом с последующей фильтрацией и прямым ВЭЖХ-анализом с флуоресцентным детектированием, позволила с высокой селективностью разделить эрговалин, эрговалинин, амид лизер-гиновой кислоты и эргинин [18, 19].
Экспрессным методом разделения и выделения эрготаминов является и вариант ТСХ с УФ-детектированием (254 и 366 нм) или обработкой пластин п-Ж,Ж-диметил-аминобензальдегидом [20-22]. В качестве неподвижной фазы использовался силикагель, подвижной — смесь хлористого метилена и изопропилового спирта (92:8, об.).
В основе масс-спектрометрического определения эрготаминов используется ионизация электронным ударом [23] и химическая ионизация [24], а также вариант тандемной ЖХ-масс-спектрометрии [25, 26]. Последний для решения задачи наиболее перспективен [27, 28]. При этом в значительной степени остаётся плохо разработанной проблема очистки и концентрирования полученных экстрактов методом ТФЭ.
В представляемой работе предложен новый способ эффективной очистки и концентрирования экстрактов алкалоида спорыньи — эрготамина — на сверхсшитом полисти-рольном сорбенте с привитыми сульфогруппами [29, 30].
Экспериментальная часть. В работе использовали бидистиллированную воду, ацетонитрил (о.с.ч.) («Криохром», Россия), КН2Р04 («Вектон», Россия), Н3Р04
* Работа поддержана грантом РФФИ 10-03-00902-а.
© А. О. Руденко, Л. А. Карцова, К. А. Краснов, 2011
(«Вектон», Россия), CuSÜ4 («Вектон», Россия), водный раствор аммиака 10 %, а также стандарт эрготамина («Sigma», США) (1), сорбент для твердофазной экстракции: сверхсшитый полистирол с привитыми сульфогруппами (MN 502)1.
H
(1)
Время, Компоненты, %
мин А В
0 95 5
15 50 50
20 95 5
25 95 5
Определение эрготамина проводили на жидкостном хроматографе “Shimadzu LC-20 Prominence”, (Япония) с флуориметрическим детектированием (337 нм; 421 нм).
Хроматографическая колонка 250 X 4,6 мм2 Условия градиентного элюирования “Phenomenex С18” зернением 5 мкм (США); градиентный режим, расход элюента 1 мл/мин (таблица). После серии предварительных экспериментов в качестве подвижной фазы была взята смесь 11,0 ммоль фосфатного буферного раствора с рН = 2,5 (компонент А) и ацетонитрил (компонент В).
Готовили исходный концентрированный раствор эрготамина. Для этого навеску 10 мг сухого порошка эрготамина растворяли в 100 мл фосфатного буфера (рН = 5,0). Для лучшего растворения препарата колбу интенсивно встряхивали в течение 10 мин. Получали раствор с концентрацией эрготамина 100 мг/л.
Для приготовления калибровочных растворов заданные объёмы исходного вещества 100, 50, 25, 25 и 10 мкл растворяли соответственно в 0,9; 0,95; 1,0; 2,0 и 2,0 мл крови крыс. Получали растворы с содержанием эрготамина 10; 5; 2,5; 1,25 и 0,5 мг/л. Далее отбирали по 50 мкл каждого из них и наносили на фильтровальную бумагу. После этого кровь с эрготамином высушивали при комнатной температуре и полученные сухие пятна крови, вырезанные и мелко измельченные, помещали в небольшие флаконы, добавляя в каждый по 0,5 мл фосфатного буфера (рН = 5,0).
Содержимое флаконов встряхивали и помещали в ультразвуковую ванну на 10 мин. Затем остатки фильтровальной бумаги удаляли из флаконов, а содержимое — центрифугировали в течение 3 мин при 8000 об/мин. Отбирали 300 мкл полученного раствора, разбавляя 2 мл фосфатного буфера (рН = 2,5).
Очистку от белков и удаление сопутствующих примесей, мешающих определению эрготамина, проводили методом ТФЭ на сульфированном сверхсшитом полистироле (MN 502) с использованием принципа лигандного обмена.
Сорбент предварительно измельчали в мельнице и затем седиментацией удаляли наиболее мелкие и крупные частицы. Полученный сорбционный материал имел размеры зёрен 50-200 мкм. Далее около 100 мг сорбента помещали в стеклянную трубку,
1 Сульфированный сверхсшитый полистирол был любезно предоставлен нам доктором химических
наук профессором В. А. Даванковым.
мин
Рис. 1. Хроматограмма стандартного раствора: прибор — “Shimadzu LC-20AD Prominence”, флуориметрический детектор; колонка — “Phenomenex C18” 250 X 4,6 мм2, 5 мкм; элюент — фосфатный буфер (рН = 2,5) — ацетонитрил, ФЛ — ^экс. = 337 нм, ^эм. = 421 нм
промывали сорбент 10 мл бидистиллированной воды, а затем высушивали струёй азота. После этого через сорбент пропускали раствор сульфата меди до полного насыщения сорбента катионами Cu2+. Насыщение сорбента ионами меди определяли визуально по цвету пропускаемого раствора. После насыщения сорбент промывали 5 мл бидистил-лированной воды.
В подготовленную таким образом колонку для ТФЭ помещали 1,5 мл центрифугированного разбавленного стандартного раствора эрготамина и пропускали его через сорбент. Сорбент промывали 2 мл дистиллированной воды. Пропущенный через сорбент раствор и промывные воды сохраняли для последующего анализа. Эрготамин элюировали 3 мл 10 %-го водного раствора аммиака. Аммиачный элюат собирали и подкисляли раствором соляной кислоты до рН = 2 + 3. Далее раствор упаривали досуха в вакууме. Сухой остаток растворяли в 300 мкл фосфатного буфера.
Процедуру проводили для каждого стандартного раствора. Таким образом получали растворы для калибровки с концентрацией эрготамина ~ 1,0; 0,5; 0,25; 0,125; и 0,05 мг/л, которые последовательно вводили в хроматографическую колонку.
Пример хроматограммы приведён на рис. 1. Предел обнаружения эрготамина составил 0,01 мг/л.
Рис. 2. Хроматограмма пробы крови:
прибор — “Shimadzu LC-20AD Prominence”, флуориметрический детектор; колонка — “Phenomenex C18” 250 X 4,6 мм2, 5 мкм; элюент — фосфатный буфер (рН = 2,5) — ацетонитрил, ФЛ — ^экс. = 337 нм, ^эм. = 421 нм
В качестве объектов анализа использовали кровь крыс, «затравленных» эргота-мином. Кровь высушивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Процедуру подготовки проб проводили, как и при приготовлении растворов для калибровки. Пример хроматограммы реального объекта представлен на рис. 2.
Обсуждение результатов. Основной проблемой при анализе эрготамина в сложной биологической матрице — крови — явилось достаточно низкое (~ 0,1 мг/л) содержание определяемого компонента и сложный хроматографический профиль, вызванный спецификой объекта анализа.
Проблему чувствительности анализа удалось решить благодаря использованию флуориметрического детектирования, которое на четыре порядка превосходит УФ-детектирование (рис. 3), а также применению очистки и концентрирования методом ТФЭ на сульфированном сверхсшитом полистирольном сорбенте с применением принципа лигандного обмена (в качестве металла-комплексообразователя ионы Cu(II); элюент — 10 %-й водный раствор аммиака). Был испытан также и другой металл-комплексообразователь — Co(II). Установлено, что лучшие результаты достигаются в случае ионов Cu(II). Одной из интересных особенностей этих полимерных сорбентов является их способность набухать в полярных и в неполярных растворителях. Тенденция к набуханию и особый вид пористости позволяют сверхсшитому полистиролу проявлять превосходные адсорбционные характеристики при анализе полярных и неполярных органических веществ. Кроме характерных для сверхсшитого полистирола нанопор размером 20-40 A этот материал имеет ещё и широкие транспортные
Рис. 3. Хроматограмма стандартного раствора при УФ-детектировании: прибор — “Shimadzu LC-20AD Prominence”, детектор диодная матрица; колонка — “Phenomenex C18” 250 X 4,6 мм2, 5 мкм; элюент — фосфатный буфер (рН = 2,5) — ацетонитрил, X = 306 нм
поры размером в несколько сотен ангстрем [31]. Степень извлечения для эрготамина на данном сорбенте составила 98 ± 2 %.
Применение ТФЭ на сверхсшитом полистирольном сорбенте с привитыми сульфо-группами с использованием принципа лигандного обмена явилось ключевой стадией работы. Данный способ пробоподготовки превосходит ранее известные варианты, в частности, ТФЭ на обращённо-фазовых сорбентах и силикагеле. Использование принципа лигандного обмена позволило существенно разгрузить хроматографический профиль, провести эффективную очистку и получить коэффициенты извлечения эрготамина выше, чем на традиционных сорбционных материалах (например, для силикагеля — 88 % [9]). К тому же данный метод прост в исполнении и не требует частой замены патронов для ТФЭ (сорбент легко регенерируется промывкой раствором аммиака и бидистилли-рованной водой).
На рис. 4 представлены хроматограммы пробы крови до и после очистки и концентрирования методом ТФЭ.
Существенной проблемой, с которой пришлось столкнуться в ходе разработки методики, явилась термическая лабильность эрготамина, а также нестабильность под действием УФ-излучения. Поэтому все эксперименты проводились с высушенной кровью в отсутствии прямых солнечных лучей. Подготовка проб и хроматографический анализ осуществлялись в один и тот же день.
В результате была определена массовая концентрация эрготамина в крови крыс (N = 10, P = 0,95): X = 0,093 ± 0,003 мг/л.
б
Рис. 4. Хроматограммы пробы крови до (а) и после (б) очистки и концентрирования методом ТФЭ: прибор — “Shimadzu LC-20AD Prominence”, флуориметрический детектор; колонка — “Phenomenex C18” 250 х 4,6 мм2, 5 мкм; элюент — фосфатный буфер (рН = 2,5) — ацетонитрил, ФЛ — Хэкс. = 337 нм, Хэм. = 421 нм
1. BerdeB., SchildH. О. Ergot Alkaloids and Related Contpounds // Handbook ES- P. Pharmacology. 1978. Vol. 49.
2. Porter J. K., Bacon C. W., KuldauG. et al. Alkaloids and other mycotoxins associated with ergot damaged sorghum // Proc. National Conference on Sorgltum Ergot. Corpus Christi. 1998. T. X.
3. Porter J. K. Chemical constituents of grass endophytes // Bio- technology of Endophytic Fungi of Grasses / Ed. by C. W. Bacon, J. F. White. Jr. CRC Press, Boca Raton, FL. 1994. Ch. 8. P. 103-123.
4. Waller J. A forgotten plague making sense of dancing mania // Lancet. 2009. Vol. 373. (9664). P. 624, 625.
5. Robbins J. D., Porter J. K., Bacon C. W. Occurrence and clinical manifestation of ergot and fescue toxicoses in diagnosis of mycotoxicoses / ed. by J. L. Richards, J. R. Thurston. Martinus Ni-jhoff Publishers, Dordrecht, Netherlands. 1986. Ch. 6. P. 61-74.
6. Bacon C. W., Lyons P. C., Porter J. K., Robbins J. D. Ergot toxicities from endophyte-infected grasses // J. Agron. 1986. Vol. 78. P. 106-116.
7. Perellino N. C., Malyszko J., Ballabio M. et al. Identification of Ergobine, a New Natural Peptide Ergot Alkaloid // J. Nat. Prod. 1993. Vol. 56. P. 489-493.
8. Flieger M., WurstM., Stuchlik J., RehacekZ. Isolation and separation of new natural lactam alkaloids of ergot by high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1981. Vol. 207. P. 139-144.
9. Testereci H., Garner G. B., Rottinghaus G. E. et al. Method for large scale isolation of ergo-valine from endophyte-infected tall fescue seed (Festuca arzrndinacea) // Proc. Int. Sym- P. on Acremoniuml Grass Interactions / ed. by S. S. Quisenbeny, R. E. Joost. New Orleans, LA, USA, 1990. Vol. 3. P. 100.
10. Garner G. B., Rottinghaus G. E., Cornell C. N., Testereci H. Chemistry of compounds associated with endophyte/grass interaction: ergovaline- and ergopeptine-related alkaloids // J. Agric. Ecosyst. Erniron. 1993. Vol. 44. P. 65-80.
11. Rottinghaus G. E., Garner G. B., Cornell C. N., Ellis J. L. HPLC method for quantitating
ergovaline in endophyte-infested tall fescue: seasonal variation of ergovaline levels in stems with leaf sheaths, leaf blades, and seed heads // J. Agric. Food Chem. 1991. Vol. 39. P. 112-115.
12. Rottinghaus G. E., SchultzL. M., Ross P. F., HillN.S. An HPLC method for the detection
of ergot in ground and pelleted feeds // J. Vet. Diagn. Intvst. 1993. Vol. 5. P. 242.
13. Moubarak A. S., Piper E. L., West C.-P., Johnson Z. B. Interaction of purified ergovaline from endophyte-infected tall fescue with synaptosomal ATPase enzyme system // J. Agric. Food Chem. 1993. Vol. 41. P. 407-409.
14. Shelby R. A., FleigerM. Analysis of ergot alkaloids in plants and seeds of endophyte-infected tall fescue by gradient HPLC // Proc. of the Third International Symposium on Acrernoniun Grass Interactions / ed. by C. W. Bacon, N. S. Hill. N.-Y., 1997. Ch. 50. P. 271-273.
15. HillN.S., Parrott W. A., PopeD.D. Ergopeptine alkaloid production by endophytes in a
common tall fescue genotype // J. Cro- P. Sci. 1991. Vol. 31. P. 1545-1547.
16. HillN. S., Rottinghaus G. E., Agee C. S., SchultzL. M. Simplified sample preparation for HPLC analysis and ergovaline in tall fescue // J. Crop Sci. 1993. Vol. 33. P. 331-333.
17. Zhang Q., Spiers D. E., Rottinghaus G. E., Garner G.B. Thermoregulatory Effects of Ergo-valine Isolated from Endophyte-Infected Tall Fescue Seed on Rats // J. Agric. Food Chem. 1994. Vol. 42. P. 954-958.
18. Scott P. M., Lombaert G. A., Pellaers P. et al. Ergot alkaloids in grain foods sold in Canada // J. AOAC Int. 1992. Vol. 75.773. 207. P. 139-144.
19. Christensen M. J., Lane G. A., Simpson W. R., Tapper B. A. Leaf blade colonization by two Neotyphodium endophytes, and ergovaline distribution within leaves of tall fescue and meadow fescue // GI-nss Interactions / ed. by C. W. Bacon, N. S. Hill. N.-Y., 1997. Ch. 23. P. 149-151.
20. Perellino N. C., Malyszko J., Ballabio M. et al. Identification of Ergobine, a New Natural Peptide Ergot Alkaloid // J. Nat. Prod. 1993. Vol. 56. P. 489-493.
21. StahlE. Thin Layer Chromatography //A Laboratory Handbook. N.-Y., 1969. N 73. P. 127, 869.
22. SprinceH. A modified Ehrlich benzaldehyde reagent for detection of indoles on paper chromatograms // J. Chromatogr. 1960. Vol. 3. P. 97-98.
23. Porter J. K., Bacon C. W., Robbins J. D. Laboratory production of ergot alkaloids by species
of balansia // J. Agric. Food Chem. 1979. Vol. 27. P. 595-598.
24. Porter J. K., Betowski D. Ergot alkaloid identification in Clavicipitaceae systemic fimgi of pasture grasses // J. Agric. Food Chem. 1981. Vol. 29. P. 650-653.
25. Yates S. G., Plattner R. D., Garner G. B. Detection of ergopeptine alkaloids in endophyte-infected, toxic Ky-31 tall fescue by mass spectrometry/mass spectrometry // J. Agric. Food Chem. 1985. Vol. 33. P. 719-722.
26. Porter J. K., Bacon C. W., Plattner R. D., Arrendale R. F. Ergot peptide alkaloid spectra of claviceps-infected tall fescue, wheat, and barley // J. Agric Food Chem. 1987. Vol. 35. P. 359-361.
27. Yates S. G., Powell R. G. Analysis of ergopeptine alkaloids in endophyte-infected tall fes-
cue // J. Agric. Food Chem. 1988. Vol. 36. P. 337-340.
28. Rowan D. D., Shaw G. J. Detection of ergopeptine alkaloids in endophyte-infected perennial ryegrass by tandem mass spectrometry // J. NZ Vet. 1987. Vol. 35. P. 197-198.
29. Sychov C. S., Ilyin M. M., Davankov V.A., SochilinaK. O. Elucidation of retention mechanisms on hypercrosslinked polystyrene used as column packing material for high-performance liquid chromatography // J. Chrom. (A). 2004. Vol. 1030. P. 17-24.
30. Davankov V.A., Sychov C. S., Ilyin M. M., SochilinaK. O. Hypercrosslinked polystyrene as a novel type of high-performance liquid chromatography column packing material: Mechanisms of retention // J. Chrom. (A). 2003. Vol. 987. P. 67-75.
31. Tsyurupa M. P., Davankov V. A. Hypercrosslinked polymers: basic principle of preparing the new class of polymeric materials // J. React. Funct. Polym. 2002. Vol. 53. P. 193-203.
Статья поступила в редакцию 14 января 2011 г.
