CC BY
32
Химия растительного сырья. 2015. №2. С. 59-68.
DOI: 10.14258/jcprm.201502542
УДК 543.544.5.068.7, 543.054
СЕЛЕКТИВНОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ ФИТОЭКДИСТЕРОИДОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА МОЛЕКУЛЯРНО-ИМПРИНТИРОВАННЫМ СОРБЕНТОМ НА ОСНОВЕ ДИОКСИДА ТИТАНА
1 * 13 2 2 2 2
© Д.А. Севко , С.С. Абрамчук ', A.A. Ихалайнен , A.M. Антохин , В.Ф. Таранченко , В.М. Гончаров , A.B. Аксенов2, Д.А. Митрофанов2, М.Ю. Синицын2, М.К. Беклемишев1
1 Московский государственныйуниверситет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Ленинские горы, 1, стр. 3, 119991 ГСП, Москва (Россия), e-mail: dasha.polyanina@gmail.com
2Федеральное государственное унитарное предприятие «Научный центр "Сигнал"», ул. Большая Оленья, 8, Москва, 107014 (Россия) 3Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, ул. Вавилова, 28, Москва, 119991 (Россия)
Методом молекулярного импринтинга получен сорбент на основе диоксида титана для группового извлечения фитоэкдистероидов. Селективный импринтированный слой получали на поверхности наночастиц TiO2 путем гидролиза к-бутоксида титана. В качестве темплата при молекулярном импринтинге использовали экдистен, самый распространенный фитоэкдистероид, а также его комплекс с 3-аминофенилборной кислотой (АФБК). Полученные сорбенты в форме патронов для твердофазной экстракции (ТФЭ) использовали для групповой сорбции шести фитоэкдистероидов из экстракта серпухи венценосной (Serratula coronata), при этом целевые соединения удалось отделить от основных матричных компонентов растительного экстракта. По сравнению с кремнеземом-С18, извлечение фитоэкдистероидов предлагаемым сорбентом выше, а матричных компонентов - ниже. Фитостероиды десорбировали смесью ацетон -ацетонитрил - пропанол-2 - муравьиная кислота (10 : 45 : 45 : 1 об.) и определяли методом обращено-фазовой ВЭЖХ-МС/МС (колонка «Thermo» HypersilGold aQ, 150 х 2.1 мм, размер зерна 3 мкм). Наиболее эффективен сорбент, полученный импринтингом комплекса экдистена с АФБК. Степени извлечения фитостероидов импринтированными сорбентами в 2-3 раза выше, чем неимпринтированными. Полученные сорбенты сохраняют свои сорбционные свойства при хранении, что подтверждает стабильность полученных молекулярных отпечатков.
Ключевые слова: молекулярный импринтинг, импрингированные сорбенты, поверхностный золь-гель синтез, твердофазная экстракция, высокоэффективная жидкостная хроматография, фитоэкдистероиды, растительные экстракты.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект
№13-03-00441-а).
Введение
Растительные фитоэкдистероиды, к которым относится более 300 производных экдизона [1-3], обладают адаптогенным и антидепрессивным действием, а также противомикробной активностью. Выделение фитостероидов из растительных экстрактов довольно трудоемко и длительно [2, 4, 5]. Для определения фитоэкдистероидов чаще всего используют хроматографические методы. Применение газовой хроматографии ограничено сложностями дериватизации целевых соединений [6]. Один из самых чувствительных методов определения экдистероидов - радиоиммунный (предел обнаружения - 1 нг), он позволяет определить экдизон-подобную активность, но не индивидуальные соединения [7, 8].
Для определения фитоэкдистероидов наиболее широко используют методы высокоэффективной
СевкоДарья Анатольевна - аспирант кафедры жидкостной (ВЭЖХ) и тонкослойной хроматогра-
аналитической химии, e-mail: dasha.polyanina@gmail.com фии (ТСХ), при этом основной для аналитических
Окончание наС. 60 целей является первая [3]. Описано определение
* Автор, с которым следует вести переписку.
фитоэкдистероидов на уровне нанограммов при масс-спектрометрическом детектировании (ВЭЖХ-МС или МС/МС) [1, 7-10]. Определению данного класса соединений, прежде всего минорных (например, ма-кистеронов), методом ВЭЖХ могут мешать компоненты матрицы растительного экстракта, например фла-воноиды [1]. В связи с этим актуальна разработка сорбентов, которые позволяли бы относительно селективно выделять фитоэкдистероиды для решения как препаративных, так и аналитических задач.
Общий подход к созданию селективных сорбентов для концентрирования органических соединений - молекулярный импринтинг [11]. Метод основан на формировании органического или неорганического (SiO2, TiO2) полимера вокруг молекул целевого соединения (темплата) с последующей отмывкой темплата, после чего в матрице полимера остаются селективные сайты связывания темплата. Подобные сорбенты получены для извлечения сотен соединений [12], в частности, стероидных гормонов [13, 14]. Однако для фитоэкдистероидов молекулярно-импринтированные сорбенты до сих пор не были получены.
Цель данной работы - получение молекулярно-импринтированного сорбента для селективного извлечения фитоэкдистероидов из сложной матрицы растительного экстракта. С этой целью мы провели молекулярный импринтинг экдистена - самого распространенного фитоэкдистероида - на поверхности нано-частиц диоксида титана, на которые наносили дополнительный тонкий слой TiO2 путем гидролиза н-бутоксида титана по методу Кунитаке [15]. После десорбции экдистена получили селективный сорбент. Выяснили также возможность повышения эффективности получаемого сорбента при использовании в качестве темплата не самого экдистена, а его соединения с 3-аминофенилборной кислотой (АФБК). Контроль сорбции и элюирования фитоэкдистероидов с сорбента осуществляли методом ВЭЖХ-МС/МС.
Экспериментальная часть
1. Используемые вещества
Использовали диоксид титана Sigma-Aldrich (нанопорошок со средним диаметром частиц 21 нм), толуол Acros Organics (для ВЭЖХ, 99,99%), этанол Merck (99,9%), гидроксид калия (ч.д.а.), гидрохлорид 3-аминофенилборной кислоты Aldrich (98%), бутоксид титана (IV) Aldrich (97%), экдистен Sigma-Aldrich.
Для получения ИК-спектров образцов TiO2 в таблетках KBr использовали ИК-спектрометр Varian 680-IR.
Микрофотографии TiO2 получали в просвечивающем электронном микроскопе LEO 912 AB OMEGA (Carl Zeiss, Германия).
Надземные части (стебли и листья) серпухи венценосной (Serratula coronata, Архангельская область, время сбора июль-август) высушивали, измельчали и экстрагировали 40%-ным этанолом (1 : 100, 2 ч), экстракт сгущали на роторном испарителе и подвергали лиофильной сушке (72 ч, ступенчато при температуре от -55 до +24 °С), в результате чего получали сухой экстракт. Его навеску растворяли в ДМСО (23 мг на
- 10 мл) и разбавляли в 10 раз 96%-ным этанолом.
Абрамчук Сергей Савельевич - доцент (МГУ), старший научный сотрудник (ИНЭОС), кандидат технических
Структуры фитостероидов серпухи венценосной
наук, e-mail: abr@polly.phys.msu.ru приведены на схеме 1.
ИхалайненАндрейАлександрович - ведущий научный 2. Получение материалов с молекулярными
сотрудник, доктор биологических наук, доцент,
.. 'i: . . J ' отпечатками e-mail: inio@ncsignal.ru
Антохин АндрейМихайлович - заместительдиректора по В колбу на 250 мл помещали 50-Ш0 мг
научной работе, доцент, кандидат технических наук, нанопорошка оксида титана (IV) и 65 мл 0,03%
e-mail: info@ncsignal.ru Таранченко Виктор Федорович - начальник отдела,
(об./об.) раствора воды в толуоле (для этого в указанный объем толуола вводили 20 мкл воды при
доцент, кандидат химических наук,
e-mail: info@ncsignal.ru перемешивании) и перемешивали содержимое кол-
ГончаровВалерий Михаилович - ведущий научный бы 2,5 ч при 300 об/мин. Далее 5 мг темплата рас-
сотрудник, доцент, кандидат химических наук, ^ в 6,5 мл абсолютного этанола, добавляли e-mail: info@ncsignal.ru
Аксенов Алексей Вадимович - заведующий лабораторией, 315 мкл бутоксида титана, перемешивали, помеща-
доцент, кандидат технических наук, ли на ультразвуковую баню на 5 мин и оставляли на
e-mail: info@ncsignalru 30-40 мин. Для приготовления неимпринтирован-
МитрофановДмитрий Александрович - ведущий г ,г .
I ного сорбента (без отпечатков экдистена) темплат
научный сотрудник, доцент, кандидат химических наук, г \ >
e-mail: info@ncsignal.ru не добавляли, а аликвоту бутоксида титана сразу
СиницынМихаилЮрьевич - младптий научный растворяли в 6,5 мл этанола. Если в качестве тем-
сотрудник, e-mail: info@ncsignal.ru БеклемишевМихаил Константинович - ведущий научный сотрудник кафедры аналитической химии, доктор
плата использовали соединение экдистена с 3-аминофенилборной кислотой (АФБК), то отдельно рас-
химическихнаук, e-mail: mkb@analyt.chem.msu.ru творяли 5 мг экдистена и 18,1 мг АФБК (мольное
соотношение эвдистен : АФБК = 1 : 10) в 1 мл абсолютного этанола каждый, объединяли эти растворы, доводили общий объем до 6,5 мл абсолютным этанолом и добавляли 270 мкл бутоксида титана. После перемешивания и сонирования (5 мин) оставляли на 30-40 мин.
К полученной суспензии TiO2 в толуоле добавляли раствор смеси темплата с бутоксидом, перемешивали в течение 5 ч и затем выдерживали 1 сутки при 5±2 °С. Полученный продукт (мелкодисперсный осадок бежевого цвета) фильтровали через бумажный фильтр (синяя лента), промывали с помощью 10 мл 0,03% (об./об.) раствора воды в толуоле и сушили на фильтре в сушильном шкафу при 55 °С в течение 12 ч. Для отмывки темплата к осадку добавляли 2 мл 1%-го раствора гидроксида калия в 96%-ном этаноле и сонировали 1 ч при 50 °С, после чего дозатором отбирали надосадочный слой и снова добавляли 2 мл 1%-ного этанольного раствора гидроксида калия; такую отмывку повторяли еще 3 раза. Осадок сушили в токе азота и оставляли на воздухе до полного высыхания.
3. Изучение сорбционных свойств полученныхматериалов
Для изучения повторного связывания темплата навеску (около 10 мг) отмытого и высушенного сорбента помещали в стеклянную виалу вместимостью 1,8 мл, добавляли 0,5 мл 110-5 М раствора экдистена в этаноле, перемешивали 30 мин, центрифугировали при 2000 об/мин, надосадочный слой отбирали дозатором, переносили в виалу и анализировали методом ВЭЖХ-МС. Хроматографическое определение целевых аналитов проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ-МС на хроматографе Dionex Ultimate 3000 с термо-статируемой колонкой («Thermo» HypersilGold aQ, 150 х 2,1 мм, размер зерна 3 мкм) и масс-спектрометром Thermo QExactive, оснащенным источником ионизации электроспреем при атмосферном давлении. В работе использовали два элюента: А - смесь ацетонитрил - вода (5 / 95 об.) с добавкой 0,1% (об.) НСООН; В - аце-тонитрил с добавкой 0,1% (об.) НСООН. Разделение проводили в режиме градиентного элюирования: 0-1 мин: 10% В; 1-9 мин: 10 - 90% В; 9-12 мин: 90% В; 12-12,5 мин: 90 - 10% В; 12,5-15 мин: 10% В. Объем вводимой пробы составлял 3 мкл. Температура термостата колонки: 30 °С, скорость подачи элюента: 0,5 мл/мин. Измерения проводили в режиме регистрации положительных ионов по полному ионному току в диапазоне масс 100,00 - 1000,00 а.е.м. с разрешением 35000. Температура источника ионизации: 320 °С, температура фокусирующего капилляра: 270 °С, напряжение источника ионизации: 4 кВ.
Количество сорбированного экдистена рассчитывали по разности его содержания в растворе до и после сорбции, нормируя на точную массу навески.
Исследования методом нормально-фазовой ВЭЖХ проводили на хроматографе с УФ-детектором Dionex Ultimate 3000 с термостатируемой колонкой (Waters Viridis Silica 4.6 x 150 мм, размер зерна 5 мкм). Разделение проводили в изократическом режиме с использованием изопропанола в качестве элюента. Температура автосамплера составляла 17 °С, температура колонки 25 °С, время анализа 20 мин, объем вводимой пробы 10 мкл. Детектирование проводили при 220 нм.
Oh Oh
OH
HO
HO
O
O
O
Экдистен (эвдистерон, 20-гидроксиэвдизон, 20Е, 20НЕ)
Эвдизон
Туркестерон
HO,
HO'
O
Дакрихайнанстерон
Макистерон А
Макистерон С
Схема 1. Структурные формулы рассматриваемых фитоэкдистероидов
Получение картриджей для твердофазной экстракции. За основу были взяты коммерчески доступные картриджи HyperSep C8 (100 мг, 1 мл) фирмы Thermo, из которых удаляли сорбент и использовали корпус картриджа и две септы, удерживающие сорбент. В пустой картридж помещали септу, затем навеску (50 мг) полученного нами сорбента и вторую септу. Растворы прокачивали через картриджи с помощью манифолда Agilent для ТФЭ (Vacuum manifold processing station) и вакуумного насоса Millipore (Vacuum pump XF54 230 50). Прежде чем проводить сорбцию, полученные картриджи кондиционировали (1 млдеионизованной воды, затем 1 мл 96% этанола), далее пропускали 0,5 мл пробы, промывали картридж 1 мл деионизованной воды и элюировали 2 мл смеси растворителей (для сорбента с отпечатками экдистена: ацетон - ацетонитрил - про-панол-2 (10 : 45 : 45 об.) + 0,1% об. безводной НСООН; для сорбента с отпечатками комплекса экдистен -АФБК: ацетон - ацетонитрил - пропанол-2 (10 : 45 : 45 об.)). Элюат переносили в виалы вместимостью 1,8 мл и анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС. В качестве стандарта в нашем распоряжении имелся только экдистен, который и использовали при оценке количества фитоэвдистероидов. Как известно [16, 17], использование экдистена как общего стандарта для всей группы фитоэкдистероидов оправдано.
Сорбционные свойства импринтированного сорбента сравнивали со свойствами кремнезема с при -витыми группами Ci8. Для этого использовали картриджи Zorbax C18, которые также кондиционировали (4 мл метанола, затем 4 мл деионизованной воды), далее пропускали пробу (5 мл), промывали картридж (4 мл деионизованной воды) и элюировали метанолом (4 раза по 1 мл). Элюат собирали в виалу, выпаривали в токе азота, перерастворяли в 100 мкл метанола и анализировали методом ВЭЖХ-МС.
Результаты и обсуждение
Получение и характеристики сорбентов на основе TiO2. Один из надежных способов получения молекулярных отпечатков органических веществ заключается в использовании неорганических матриц, чаще всего кремнезема или диоксида титана. В отличие от органических полимеров, неорганические оксиды обладают жесткостью, достаточной для формирования молекулярного отпечатка, сохраняющего заданную форму. Кунитаке [15] разработал подход к получению таких отпечатков на поверхности TiO2, основанный на формировании дополнительного тонкого слоя диоксида титана золь-гель методом. Золь-гель процесс основан на гидролизе алкоксида титана (мы использовали н-бутоксид Ti(OBu)4) в органическом растворителе, содержащем небольшое количество воды (схема 2). В слой TiO2-xH2O, формируемый на поверхности частиц диоксида титана, встраиваются молекулы принтуемого вещества (темплата). Общая схема молекулярного импринтинга показана на схеме 3.
Для повышения качества молекулярных отпечатков темплат иногда вводят в виде комплексов. Мы предположили, что добавление к структуре фитостероида ионизующейся группы способствовало бы более сильному взаимодействию темплата с матрицей за счет образования более прочных водородных связей. С этой целью мы изучили возможность импринтинга экдистена в форме соединений с 3-амино-фенилборной кислотой (АФБК), содержащей катионогенную группу (аминогруппу), а также с 3-карбокси-5-нитрофенилборной кислотой (КНФБК), образующей, наоборот, анион. Как показал экперимент, отпечатки экдистена в TiO2 образуются только при использовании самого экдистена или его соединения с АФБК (схема 4). Возможно, отсутствие импринтинга в присутствии КНФБК вызвано тем, что последняя, как кислота, частично разрушает бутоксид титана, переводя его в бутанол. Методом нормально-фазовой ВЭЖХ исследовано комплексообразование экдистена с АФБК (табл. 1). Времена удерживания экдистена в присутствии и в отсутствие АФБК различаются, что подтверждает образование комплекса экдистен - АФБК в среде изопропанола. Добавление к этой смеси н-бутоксида титана не приводит к изменению времен удерживания, то есть комплекс экдистена с бутоксидом неустойчив или вовсе не образуется.
Для синтезированных сорбентов получены ИК-спектры (рис. 1) и фотографии в просвечивающем электронном микроскопе (рис. 2). Отличия ИК-спектра диоксида титана, модифицированного золь-гель методом, от немодифицированного носителя вызваны сохранением остаточных бутокси-групп в глубине этого слоя [18]. На микрофотографии (рис. 2) видно, что модификация TiO2 практически не увеличивает размер частиц (средние диаметры частиц исходного и модифицированного TiO2 составляют 23+7 и 20+8 нм, соответственно), т.е. толщина импринтированной пленки геля невелика.
Выбор условий получения импринтированных сорбентов. Качество получаемых сорбентов, имприн-тированных экдистеном, оценивали по количеству сорбированного экдистена (разность его содержания в растворе до и после сорбции, нормируемого на точную массу навески) и по величине импринтинг-
факторов (ИФ), которые определяли как отношение сорбированного количества экдистена импринтиро-ванным и неимпринтированным сорбентами в одних и тех же условиях (методику изучения сорбции см. в п. 3 Экспериментальной части). Существенный фактор, влияющий на величины ИФ, - концентрация бутоксида титана в реакционной смеси (табл. 2). Импринтинг экдистена (ИФ > 1) наблюдается в относительно узком диапазоне концентраций бутоксида титана; при импринтинге самого экдистена использовали 315 мкл бутоксида, а экдистена в присутствии АФБК - 270 мкл.
Для получения отпечатков необходима достаточная концентрация темплата, вводимого при импринтинге: для сорбентов, полученных в присутствии 1; 2,5 и 5,0 мг экдистена импринтинг-факторы равны 0,3; 0,8 и 3,8, соответственно. В дальнейшей работе использовали 5 мг темплата; последующее увеличение количества темплата могло бы затруднить его дальнейшее удаление.
Схема 2. Поверхностная модификация диоксида титана золь-гель методом по Кунитаке [15]. В ее основе лежит гидролиз Т1(ОЯ)4 на поверхности частиц ТЮ2 (Я - алкил). После гидролиза алкокси-группы ОЯ переходят в гидрокси-группы ОН, кроме тех, которые расположены в глубине слоя
Схема 3. Импринтинг экдистена в гель ТЮ2
Схема 4. Комплекс экдистена с 3-амино фенил-борной кислотой
Таблица 1. Исследование взаимодействия
экдистена с бутоксидом титана (IV) и 3-аминофенилборной нормально-фазовой ВЭЖХ, концентрация каждого из компонентов - 5 -10-4 М
Состав раствора, вводимого в колонку Времена удерживания наблюдаемых пиков, мин
Экдистен 2,88
Экдистен + АФБК 3,16
Бутоксид титана (IV) 2,43
Экдистен + бутоксид 2,87; 2,44
[Экдистен + бутоксид] + АФБК 2,45; 3,16
[Экдистен + АФБК] + бутоксид 2,45; 3,16
Рис. 1. ИК-спектры образцов ТЮ2 в таблетках КВг: 1 - немодифицированного, 2 - модифицированного золь-гель нанесением Т1(ОВи)4. ИК-спектр импринтированного сорбента не приведен, так как он идентичен спектру неимпринтированного сорбента
100 пт
Рис. 2. Микрофотографии ТЮ2 в просвечивающем электронном микроскопе: а - импринтированного экдистеном, б - немодифицированного ТЮ2
Таблица 2. Зависимость импринтинг-фактора полученных сорбентов (ИФ) от количества вводимого
бутоксида титана (IV) (50 мг исходного ТЮ2, 5 мг темплата, содержание воды в толуоле 0,03%)
Объем Т1(ОВи)4, мл
0,230 0,270 0,315 0,360
ИФ
Темплат: экдистен - 3-аминофенилборная кислота
2,2 1,2
Еще один фактор, влияющий на качество получаемых отпечатков фитоэкдистероидов, - концентрация воды в реакционной смеси при импринтинге, поскольку от нее зависит скорость гидролиза алкоксида титана и формирования геля, в котором и образуются отпечатки темплата. Обнаружено, что как в отсутствие воды, так и при ее избытке (количество воды выше ее растворимости в толуоле) качество молекулярных отпечатков снижается (импринтинг-факторы уменьшаются) (табл. 3). Далее в работе для гидролиза алкоксида титана использовали 0,03% (об.) раствор воды в толуоле, что соответствует почти насыщенному раствору.
Полученные сорбенты сохраняют свои свойства при хранении (ИФ, измеренные через 5 дней и 2 мес. после синтеза сорбента, различались не более чем на 6%), что подтверждает стабильность молекулярных отпечатков, полученных в матрице оксида титана(1'У).
Сорбция экдистена полученными сорбентами. Для изучения свойств импринтированных экдистеном сорбентов их помещали в картриджи для твердофазной экстракции и пропускали через них раствор экдистена в этаноле. Затем картридж промывали водой и десорбировали экдистен. В случае сорбента с отпечатками экдистена с АФБК десорбцию проводили 1%-ным раствором муравьиной кислоты в смеси ацетон - ацетонитрил - изопропанол (10 : 45 : 45). Такую смесь растворителей применяют для десорбции сильноудерживаемых соединений с колонок для ВЭЖХ. (Муравьиную или уксусную кислоту используют
в смеси с ацетонитрилом в качестве подвижной фазы при ВЭЖХ фитоэкдистероидов [3, 8].) В случае же картриджей с отпечатками комплекса экдистена без АФБК десорбция аналитов проходит полнее без добавления муравьиной кислоты к смеси растворителей.
Как следует из таблицы 4, степень извлечения экдистена импринтированными сорбентами (МИП) значительно выше, чем неимпринтированными (НИП) (ИФ = 2,3-3,3), что согласуется с образованием молекулярных отпечатков экдистена на поверхности ТЮ2.
Групповая сорбция фитоэкдистероидов полученными сорбентами. Фитоэкдистероиды извлекали из экстракта серпухи венценосной, приготовленного, как описано в Экспериментальной части. Без дополнительной пробоподготовки экстракт (0,5 мл этанольного раствора, см. п. 1 Экспериментальной части) пропускали через картридж с исследуемым сорбентом. Десорбцию проводили так же, как и при индивидуальной сорбции экдистена. Элюаты анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС (рис. 3).
Предполагали, что из-за сходства структур все фитостероиды будут связываться отпечатками экдистена. Как следует из таблицы 5, это действительно имеет место: все обнаруженные в экстракте фитоэкдистероиды извлекаются сорбентом, импринтированным экдистеном, причем даже в большей степени, чем сам экдистен. Существенно, что компоненты матрицы экстракта, дающие наиболее интенсивные пики на хроматограмме, отделяются в ходе проводимой сорбции (табл. 5), что свидетельствует о селективности полученных сорбентов.
Таблица 3. Влияние количества воды при синтезе сорбентов на их сорбционные свойства при статической сорбции экдистена из его этанольного раствора (содержание бутоксида титана (IV) 0,315 и 0,270 мкл соответственно для экдистена и его комплекса с АФБК в качестве темплатов)
Содержание воды в толуоле, % (об./об) ИФ
Темплат: экдистен Темплат: экдистен - 3-аминофенилборная кислота
0 1,0 1,5
0,030 3,8 2,2
0,045 1,2 1,4
Таблица 4. Степень извлечения экдистена после его сорбции из этанольного раствора на картриджах для
ТФЭ, заполненных полученными МИП сорбентами
Концентрация экдистена, мкг/мл Темплат: экдистен Темплат: экдистен - 3-аминофенилборная кислота
Степень извлечения, % ИФ** Степень извлечения, % ИФ**
0 (НИИ*) 28+3 - 28+2 -
1 65 2,3 79 2,8
5 74 2,6 85 3,1
10 76 2,7 92 3,3
25 74 2,7 88 3,1
50 80 2,9 87 3,1
* Неимпринтированный сорбент; ** ИФ = степень извлечения (МИП) / степень извлечения (НИП).
Рис. 3. Хроматограммы по полному ионному току элюатов экстракта серпухи венценосной после твердофазной экстракции на картриджах с импринтированным (1, темплат - экдистен) и неимпринтированным сорбентом (2): экдистен ^ = 4,8 мин); туркестерон ^ = 5,0 мин); макистерон А ^ = 5,3 мин); экдизон (% = 5,5 мин); дакрихайнанстерон (% = 5,8 мин); макистерон С ^ = 6,0 мин), компоненты матрицы (1-3): 6,5, 6,7, 7,2 мин
Таблица 5. Степени извлечения фитоэкдистероидов (%) из этанольного экстракта серпухи венценосной
после твердофазной экстракции на картриджах с сорбентами, импринтированными экдистеном или его комплексом с 3-аминофенилборной кислотой (МИП), и неимпринтированными сорбентами (НИП)
Темплат
Аналит Экдистен Экдистен - 3-аминофенилборная кислота
НИП МИП ИФ* НИП МИП ИФ*
Экдистен 23±3** 41±4 1,8 7,3±0,5 80±4 11
Экдизон 39±3 73±2 1,9 0,9±0,3 78±3 83
Туркестерон 37±2 68±7 1,9 1,1±0,3 70±3 62
Дакрихайнанстерон 33±2 93±3 2,8 1,6±0,3 75±3 48
Макистерон А 15±3 46±4 3,0 0,13±0,06 76±3 ##
Макистерон С 58±3 111±8 1,9 0,3±0,1 85±3 ##
Компонент матрицы 1* 0,07±0,01 0,24±0,06 3,4 0,12±0,04 0,34±0,08 2,8
Компонент матрицы 2* 0,10±0,01 0,14±0,03 1,4 0,16±0,03 0,46±0,09 2,9
Компонент матрицы 3* 2,2±0Д 6,7±0,5 3,0 2,80±0,25 64±5 23
* Компоненты экстракта, дающие наиболее интенсивные пики на хроматограмме (не идентифицированы); ** Доверительные интервалы рассчитаны из трех параллельных измерений; * импринтинг-факгор, рассчитанный как отношение
степеней извлечения компонента импринтированным и неимпринтированным ТЮ2; погрешность из-за низкой сорбции макистеронов на неимпринтированном ТЮ2.
эти значения имели бы высокую
Для сорбента, полученного в присутствии 3-аминофенилборной кислоты, степени извлечения фитоэкдистероидов выше (70-85%), чем без нее. Однако возрастает и степень извлечения компонентов матрицы, особенно одного из них (компонент 3 в табл. 5). Таким образом, сорбенты, импринтированные экдистеном и комплексом экдистен - АФБК, взаимно дополняют друг друга по свойствам.
Из таблицы 4 и 5 следует, что картриджи с НИП извлекают фитоэкдистероиды значительно слабее из растительного экстракта, чем из чистого раствора экдистена. Вероятно, это вызвано подавлением сорбции фитоэкдистероидов компонентами матрицы растительного экстракта. На МИП-сорбентах сорбция экдистена также снижается - с 65-80% (чистые растворы экдистена, табл. 4) до 40% (растительный экстракт, табл. 5), но лишь в том случае, когда в качестве темплата использовали экдистен; если же имприн-тировали комплекс экдистена с АФБК, извлечение сохраняется на уровне 80-90%, что и вызывает наблюдаемое повышение ИФ при переходе от чистого раствора экдистена к растительному экстракту и от экдистена к его комплексу в качестве темплата.
Сорбция фитоэкдистероидов на обращенно-фазовом кремнеземе. В сравнительных целях сорбцию фитоэкдистероидов серпухи изучили также на картриджах 2огЪах С18 с обращенно-фазовым кремнеземом (табл. 6). На этом сорбенте минорные фитоэкдистероиды удерживаются, но сам экдистен (темплат) сорбируется слабо (примерно в той же степени, как на неимпринтированном ТЮ2). Кроме того, обращенно-фазовый кремнезем значительно (более чем на 50%) извлекает компоненты матрицы экстракта. Эти данные подтверждают преимущества сорбентов на основе ТЮ2.
Возможность практического использования полученных сорбентов. В данной работе результаты проведенного анализа растительного экстракта проверяли, параллельно анализируя тот же экстракт методом ВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения, который благодаря точному (до трех верных знаков после запятой) определению масс молекулярных ионов позволяет практически однозначно провести отнесение хроматографических пиков. Если пользователь располагает лишь хроматографом без масс-селективного детектора или системой ВЭЖХ-МС низкого разрешения, отнесение хроматографических пиков может быть неоднозначным. В таком случае велик риск потерять или ошибочно идентифицировать сигналы прежде всего минорных фитоэкдистероидов, что особенно критично при отсутствии стан-
Таблица 6. Степени извлечения (%)
фитоэкдистероидов из этанольного экстракта серпухи венценосной после твердофазной экстракции (картриджи с кремнеземом, имеющим привитые группы С18)
Аналит Степень извлечения
Экдистен 28
Экдизон 84
Туркестерон 75
Дакрихайнанстерон 85
Макистерон А 109
Макистерон С 108
Компонент матрицы 1* 57
Компонент матрицы 2* 66
Компонент матрицы 3* 78
* Компоненты экстракта, дающие наиболее интенсивные пики на хроматограмме.
дартов этих соединений. Использование картриджей с разработанными сорбентами поможет решению аналитической задачи, позволив отделить основные компоненты матрицы растительного экстракта. Кроме того, полученные сорбенты могут быть использованы при препаративном выделении фитоэкдистероидов.
Выводы
Показана возможность молекулярного импринтинга фитоэкдистероидов. Методом поверхностного импринтинга экдистена получены два сорбента, извлекающие группу 6 фитоэкдистероидов серпухи венценосной (экдистен, экдизон, туркестерон, дакрихайнанстерон, макистероны А и С) более эффективно, чем соответствующие неимпринтированные сорбенты, и более селективно, чем обращенно-фазовый кремнезем. Выявлены преимущества молекулярного импринтинга экдистена в виде его соединения с 3-амино-фенилборной кислотой. Полученные сорбенты в форме картриджей для твердофазной экстракции позволяют отделить фитостероиды от основных компонентов матрицы экстракта серпухи венценосной.
Список литературы
1. Bathoii M., Pongracz Z. Phytoecdysteroids - from isolation to their effects on humans // Curr. Med. Chem. 2005. Vol. 12. Pp. 153-172.
2. Large T., Lafont R., Morgan E.D., Wilson I.D. Micellar Capillary Electrophiresis of ecdysteroids // Anal. Proc. 1992. Vol. 29. Pp. 386-388.
3. Lafont R., Blais C., Harmatha J., Wilson I.D. Ecdysteroids: chromatography. In: I.D. Wilson, E.R. Adlard, M. Cooke, C.F. Poole, eds. Encyclopedia of separation science. London, 2000. Vol. III. Pp. 2631-2643.
4. Ochieng C.O., Ishola I.O., Opiyo S.A., Manguro L.A.O., Owuor P.O., Wong K.-C. Phytoecdysteroids from the Stem Bark of Vitex doniana and Their Anti-Inflammatory Effects // Planta Med. 2013. Vol. 79, N1. Pp. 52-59.
5. Odinokov V.N., Galyautdinov I.V., Mel'nikova D.A., Muslimov Z.S., Khalilov L.M., Denisenko O.N., Mogilen-ko T.G., Zaripova E.R., Zakirova L.M. Isolation and identification of phytoecdysteroids from juice of Serratula quin-quefolia // Chem. Nat. Compd. 2013. Vol. 49, N2. Pp. 392-394.
6. Wainwright G., Prescott M.C., Lomas L.O., Webster S.G., Rees H.H. Development of a new high-performance chromatography - Mass spectrometric method for the analysis of ecdysteroids in biological extracrs // Arch. Insect Biochem. 1997. Vol. 35. Pp. 21-31.
7. Bathori M., Gergely A., Kalasz H., Nagy G., Dobos A., Mathe I. Liquid Chromatographic Monitoring of Phytoecdys-teroid production of Serratula Wolfii // J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 2000. Vol. 23, N2. Pp. 281-294.
8. Chadin I., Volodin V., Whiting P., Shirshova T., Kolegova N., Dinan L. Ecdysteroid content and distribution in plants of genus Potamogeton // Biochem. Syst. Ecol. 2003. Vol. 31. Pp. 407-415.
9. Li Y., Warren J.T., Boysen G., Gilbert L.I., Gold A., Sangaiah R., Ball L.M., Swenberg J.A. Profiling of ecdysteroids in complex biological samples using liquid chromatography/ion trap mass spectrometry // Rapid. Commun. Mass Spectrom. 2006. Vol. 20. Pp. 185-192.
10. Bathori M. Phytoecdysteroids effects on mammalians, isolation and analysis // Mini-Rev. Med. Chem. 2002. Vol. 2, N12. Pp. 285-293.
11. Molecular imprinting of polymers // Eds. Piletsky S., Turner A. Georgetown, TX, USA: Landes Bioscience. 2006. Pp. 208.
12. Cheong W.J., Yang S.H., Ali F. Molecular imprinted polymers for separation science: a review of reviews // J. Sep. Sci. 2013. Vol. 36, N3. Pp. 609-628. doi: 10.1002/jssc.201200784.
13. Zulfiqar A., Morgan G., Turner N.W. Detection of multiple steroidal compounds in synthetic urine using comprehensive gas chromatography - mass spectrometry combined with a molecularly imprinted polymer clean-up protocol // Analyst. 2014. Vol. 139. Pp. 4955-4963.
14. Doue M., Bichon E., Dervilly-Pinel G., Pichon V., Chapuis-Hugon F., Lesellier E., West C., Monteau F., Le Bizec B. Molecularly imprinted polymer applied to the selective isolation of urinary steroid hormones: An efficient tool in the control of natural steroid hormones abuse in cattle // J. Chromatogr. A. 2012. Vol. 1270. Pp. 51-61.
15. Kunitake T., Lee S.-W. Molecular imprinting in ultrathin titania gel films via surface sol-gel process // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 504. Pp. 1-6.
16. Grebenok R.J., Ripa P.V., Adler J.H. Occurence and levels of ecdysteroids in spinach // Lipids. 1991. Vol. 26, N8. Pp. 666-668.
17. Chadin I., Volodin V., Whiting P., Shirshova T., Kolegova N., Dinan L. Ecdysteroid content and distribution in plants of genus Potamogeton // Biochem. System. Ecol. 2003. Vol. 31. Pp. 407-415.
18. Lee S.-W., Takahara N., Korposh S., Yang D.-H., Kunitake T. A Novel Mass-Sensitive Sensor based on P-Cyclodextrin-Anchored Bisphenol A - Imprinted TiO2 Ultrathin Layers // Sens. And Mater. 2011. Vol. 23, N4. Pp. 229-236.
Поступило в редакцию 13 января 2015 г.
После переработки 23 марта 2015 г.
68
^.A. Cebko, C.C. Aepamhyk, A.A. Hxa^ahheh h^p.
Sevko D.A.1, Abramchuk S.S.1'3, Ikhalainen A.A.2, Antokhin A.M.2, Taranchenko V.F.2, Goncharov VM.2, Aksenov A.V.2, Mitrofanov D.A.2, Sinitsyn M.Iu.2, Beklemishev M.K.1 SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION OF PHYTO-ECDYSTEROIDS FROM PLANT EXTRACTS BY USING MOLECULARLY IMPRINTED TiO2 NANOPARTICLES
1Lomonosov Moscow State University, Faculty of Chemistry, Leninskiye Gory 1-3, GSP-1, Moscow, 119991 (Russia), e-mail: dasha.polyanina@gmail. com
2 Federal State Unitary Enterprise "Scientific Center" Signal"", Bol'shaia Olen'ia, 8, Moscow, 107014 (Russia) 3A.N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds of Russian Academy of Sciences, Vavilova, 28, Moscow, 119991 (Russia)
A sorbent molecularly imprinted with ecdystene, the most abundant phytoecdysteroid, was obtained by surface modification of TiO2 nanoparticles using hydrolysis of titanium(IV) n-butoxide. Ecdystene and its complex with 3-aminophenylboronic acid (APBA) were used as templates. The solid phase extraction (SPE) cartridges with the obtained sorbents were used for the group sorption of six phytoecdysteroids of sawwort (Serratula coronata). Compared with the silica-C18, the recovery of phytoecdysteroids with the imprinted sorbents is higher, and the recovery of matrix component lower. The analytes were adsorbed on the SPE cartridge, eluted by a mixture of acetone - acetonitrile - isopropanol - formic acid (10 : 45 : 45 : 1) and determined by HPLC-MS/MS technique. Sorption of phytoecdysteroids on the developed sorbent enabled their separation from the extract matrix. The sorbent based on the ecdystene - APBA complex was the most efficient: the recovery of phytoecdysteroids was 2-3 times higher those that with the non-imprinted sorbents. Obtained sorbents save their sorption properties during storage, this fact confirms the stability of molecular imprints.
Keywords: molecular imprinting, imprinted sorbents, surface sol-gel synthesis, solid phase extraction, high performance liquid chromatography, phytoecdysteroids, plant extracts.
References
1. Bathori M., Pongracz Z. Curr. Med. Chem., 2005, vol. 12, pp. 153-172.
2. Large T., Lafont R., Morgan E.D., Wilson I.D. Anal. Proc., 1992, vol. 29, pp. 386-388.
3. Lafont R., Blais C., Harmatha J., Wilson I.D. Ecdysteroids: chromatography. In: I.D. Wilson, E.R. Adlard, M. Cooke, C.F. Poole, eds. Encyclopedia of separation science. London, 2000, vol. III, pp. 2631-2643.
4. Ochieng C.O., Ishola I.O., Opiyo S.A., Manguro L.A.O., Owuor P.O., Wong K.-C. PlantaMed., 2013, vol. 79, no. 1, pp. 52-59.
5. Odinokov V.N., Galyautdinov I.V., Mel'nikova D.A., Muslimov Z.S., Khalilov L.M., Denisenko O.N., Mogilen-ko T.G., Zaripova E.R., Zakirova L.M. Chem. Nat. Compd., 2013, vol. 49, no. 2, pp. 392-394.
6. Wainwright G., Prescott M.C., Lomas L.O., Webster S. G., Rees H.H. Arch. InsectBiochem., 1997, vol. 35, pp. 21-31.
7. Bathori M., Gergely A., Kalasz H., Nagy G., Dobos A., Mathe I. J. Liq. Chrom. Rel. Technol., 2000, vol. 23, no. 2, pp. 281-294.
8. Chadin I., Volodin V., Whiting P., Shirshova T., Kolegova N., Dinan L. Biochem. Syst. Ecol., 2003, vol. 31, pp. 407-415.
9. Li Y., Warren J.T., Boysen G., Gilbert L.I., Gold A., Sangaiah R., Ball L.M., Swenberg J.A. Rapid. Commun. Mass Spectrom., 2006, vol. 20, pp. 185-192.
10. Bathori M. Mini-Rev. Med. Chem., 2002, vol. 2, no. 12, pp. 285-293.
11. Molecular imprinting of polymers // Eds. Piletsky S., Turner A. Georgetown, TX, USA: Landes Bioscience. 2006, pp. 208.
12. Cheong W.J., Yang S.H., Ali F. J. Sep. Sci., 2013, vol. 36, N3, pp. 609-628. doi: 10.1002/jssc.201200784.
13. Zulfiqar A., Morgan G., Turner N.W. Analyst, 2014, vol. 139, pp. 4955-4963.
14. Doue M., Bichon E., Dervilly-Pinel G., Pichon V., Chapuis-Hugon F., Lesellier E., West C., Monteau F., Le Bizec B. J. Chromatogr. A., 2012, vol. 1270, pp. 51-61.
15. Kunitake T., Lee S.-W. Anal. Chim. Acta., 2004, vol. 504, pp. 1-6.
16. Grebenok R.J., Ripa P.V., Adler J.H. Lipidsd 1991, vol. 26, N8, pp. 666-668.
17. Chadin I., Volodin V., Whiting P., Shirshova T., Kolegova N., Dinan L. Biochem. System. Ecol., 2003, vol. 31, pp. 407-415.
18. Lee S.-W., Takahara N., Korposh S., Yang D.-H., Kunitake T.A Sens. And Mater., 2011, vol. 23, N4, pp. 229-236.
Received January 13, 2015 Revised March 23, 2015
* Corresponding author.
