CC BY
38
Рис. 3. Встраивание красителя ТЬТ в амилоидные фибриллы; спектры поглощения свободного (/) и связанного с фибриллами (2) красителя (С,- = Сь)\ б- зависимость Скетчарда: А'ы = 2,0-Ю7 М Км = 1,2-105 М п{ = 0,01; и2 = 0,08
Необходимо отметить, что предлагаемый подход универсален — он может быть использован для нейтральных аналогов красителя ТЬТ, которые могут проникать через гематоэнцефаличе-ский барьер, что может найти свое применение в диагностике и терапии нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для анализа взаимодействия хими-
ческих веществ (в том числе нефлуоресцирую-щих), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы РАН «Молекулярная и клеточная биология», Фонда Дмитрия Зимина «Династия» и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 10-04-90038-Бел.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Carrell, R. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's |Text| / R. Carrell, B.Gooptu // Curr. Opin. Struct. Biol.- 1998,- Vol. 8,- P. 799-809.
2. Krebs, M. The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications [Text] / M. Krebs, E. Bromley, A. Donald // J. Struct. Biol.— 2005.— Vol. 149,- P. 30-37.
3. Turoverov, K. ThT as an instrument for testing and investigation of amyloid and amyloid-like fibrils | Text | / K. Turoverov, 1. Kuznetsova, A. Maskevich |et al.| // Proc. of SP1E.- 2007,- P. 6733.
4. Schirra, R. Dye aggregation in freezing aqueous
solutions I Text I / R. Schirra // Chem. Phys. Letters.— 1985,- Vol. 119,- P. 229-238.
5. Raj, C. g-Cyclodextrin inducted intermoleculareximer formation of thioflavin T |Text| / C. Raj, R. Ramaraj // Chem. Phys. Letters.- 1997,- Vol. 273,- P. 285-290.
6. Khurana, R. Mechanism of thioflavin T binding to amyloid fibrils [Text] / R. Khurana, C. Coleman, C. lonescu-Zanetti |et al.j // J. Struct. Biol.— 2005.— Vol. 151,- P. 229-238.
7. Goers, J. Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation [Text] / J. Goers, S.E. Permyakov, E.A. Permyakov |et al.| // Biochemistry.— 2002,- Vol. 41,- P. 12546-12551.
УДК 541.(64+1 83.12)
М.А. Захарова, И.В. Полякова, А.Р. Грошикова,
O.A. Писарев, Е.Ф.Панарин
МОЛЕКУЛЯРНОЕ УЗНАВАНИЕ ГЛЮКОЗЫ ИСКУССТВЕННЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ ИМПРИНТИРОВАННОЙ
ПОЛИМЕРНОЙ СЕТКИ
Молекулярный импринтинг — это метод со- к целевому веществу, которые способны имити-здания сорбционных материалов со свойствами ровать аффинное связывание, характерное для искусственных высокоспецифичных рецепторов природных компонентов, таких как фермент-
субстрат, гормон-рецептор, антиген-антитело и т. п. Процесс молекулярного импринтинга включает следующие основные этапы:
образование межмолекулярного комплекса между функциональными группами мономеров (полимеров) и целевой молекулой-темплатом, выступающей в роли шаблонной молекулы (,template — шаблон);
закрепление полученного комплекса в трехмерной структуре полимера за счет межмолекулярных сшивок;
удаление шаблонного соединения из готовой полимерной сетки.
В результате по окончании процесса синтеза в полимерной матрице сорбента присутствуют трехмерные молекулярные «отпечатки», которые по форме, размеру, расстоянию между функциональными группами комплементарны молекуле шаблонного соединения и способны повторно узнавать и специфично связывать эту молекулу среди множества других [1, 2]. Таким образом, молекулярно импринтированные полимеры (МИПы) представляют собой искусственные рецепторы.
Создание искусственных рецепторов для специфичного связывания токсинов эндогенной и экзогенной природы является актуальной задачей при разработке действенных эфферентных методов лечения токсикозов различного происхождения [3]. Такие методы основываются на сор-бционных механизмах селективного связывания токсинов и моделируют естественные механизмы их элиминации из организма. Применение МИПов в экстракорпоральном лечении представляется наиболее перспективным по сравнению с другими классами сорбентов, так как ре-це игорные сорбционные участки МИПов способны обеспечивать наиболее селективное связывание целевых токсических веществ. Кроме того, межмолекулярные связи токсин — искусственный рецептор конкурентны связям токсин — альбумин в биокомплексах, образующихся в организме для элиминации метаболитов [4]. Применение МИПов в процессе гемо/плазмосорбции позволит разрушать межмолекулярные связи токсин — альбумин в биокомплексах и оставлять альбумин в плазме крови.
Создание МИПов, специфично связывающих глюкозу, обусловлено необходимостью развития новых подходов к коррекции уровня этого углевода в организме человека.
Повышенный уровень глюкозы, или гипергликемия, — один из факторов риска возникновения метаболического сердечно-сосудистого синдрома и важнейший симптомом сахарного диабета. Для коррекции нарушенного углеводного обмена при тенденции к гипергликемии применяют диетотерапию с ограничением жиров и углеводов, а также инсулин и другие гипогли-кемизирующие препараты. Однако в интенсивной терапии наиболее перспективными представляются экстракорпоральные эфферентные методы коррекции уровня глюкозы в организме.
В процессе синтеза полимеров, импринтиро-ванных молекулами глюкозы (гл-МИПов), стабильность комплексов шаблонная молекула глюкозы — функциональный мономер и, соответственно, количество аффинных центров связывания в этих комплексах значительно зависели от конформации углевода в полимеризационной смеси при заданных условиях синтеза. Поэтому физико-химические условия сорбции определяют природу межмолекулярных взаимодействий в сорбционной системе и соотношение вкладов специфичного и неспецифичного связывания глюкозы с гл-МИПом.
Цель работы — выяснение природы межмолекулярных взаимодействий глюкозы с новым гл-МИПом, а также механизмов распределения сорбата на энергетически неоднородных сорбци-онных сайтах в импринтированной полимерной матрице.
Экспериментальная часть
В работе исследовался гл-МИП, синтезированный в ИВС РАН на основе неионогенного мономера диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ). Шаблонные молекулы глюкозы вводились в по-лимеризационную среду в количестве 4 моль %. Природа неспецифичной сорбции глюкозы с гл-МИПом исследовалась на контрольном полимере (КП) на основе ДМЭГ, который был синтезирован в аналогичных с гл-МИПом условиях полимеризации, но без введения шаблонных молекул глюкозы (см. структурную формулу).
Равновесную сорбцию проводили в статических условиях [5]. С этой целью навески сорбентов и раствора глюкозы с определенной начальной концентрацией помещали в пеницил-линовые флаконы и оставляли на перемешивающем устройстве на период времени, необходимый для установления сорбционного равновесия.
Концентрацию глюкозы в растворе определяли спектрофотометрическим методом при 630 нм, предварительно окрашивая раствор глюкозы о-толуидиновым реактивом. Растворы глюкозы были стабильны в модельном физиологическом 0,9 % растворе №С1 в широком диапазоне рН в течение 10 суток.
Равновесную емкость сорбции рассчитывали по формуле
тн
где С, Сравн (ммоль-л-1) — начальная и равновесная концентрации глюкозы соответственно; ^(мл) — объем раствора; тн (г) — масса навески сорбента.
Величину интегрального коэффициента распределения Г находили путем интегрирования графической зависимости дифференциального коэффициента распределения Г(. от у — степени насыщения сорбента сорбатом; Г,- определялся
как отношение концентрации сорбата к равно-
2у
ставляет собой отношение величины сорбцион-ной емкости (¡; в /-й точке равновесной изотермы к максимальной сорбционной емкости дтах.
Изменение свободной энергии А(7(Джмоль-1) сорбции рассчитывали как
А
где Я — универсальная газовая постоянная; Г(К) — температура; 1п Г — логарифм коэффициента распределения.
А
считывалось из изотерм равновесной сорбции, полученных при двух температурах:
л// = -л1пГ?-1пГ', 1/7-2-1/7!
где индексы 1 и 2 соответствуют Т{ = 293 К и Т2 = = 310 К.
А
ределяли из равенства
А А А
Результаты и их обсуждение
Природа межмолекулярных взаимодействий, в результате которых осуществлялась неспецифичная равновесная сорбция глюкозы, сначала была исследована на неимпринтированном
но ^VcH20H
сно I
неон
HOCH
неон ^^
он
неон
СН2ОН
но' ^ сн2он
Контрольный полимер (КП)
КП — сорбенте сравнения, который не содержит специфичных сайтов связывания.
Изотермы сорбции глюкозы на КП при температуре 293 К при всех значениях рН имели сходный характер и свидетельствовали о полифункциональных взаимодействиях глюкозы с КП, при которых малые концентрации глюкозы в растворе способствовали накоплению сорб-тива на границе раздела фаз, а дальнейший рост концентрации способствовал высокоемкостному насыщению сорбента (рис. 1, а). С ростом температуры до 310 К характер изотерм менялся (рис. 1,6). При кислом и щелочном значениях рН они становились практически прямолинейными, причем наблюдался рост величин коэффициентов распределения. Вместе с тем, в нейтральной среде сорбция ухудшалась, а изотерма приобретала ступенчатый характер.
Известно, что преобладание экзотермических сорбционных процессов характерно для обменных взаимодействий и водородных связей, в то время как превалирование эндотермических процессов характерно для гидрофобных взаимодействий [6, 7].
Детальная интерпретация природы межмолекулярных взаимодействий была основана на изучении термодинамических функций сорбции. Как видно из таблицы, в нейтральной среде сорбция глюкозы на КП протекала как экзотермический энтальпийно контролируемый процесс (отрицательное изменение энтальпии и энтропии). Поскольку КП является неионогенным сорбентом, то термодинамически выгодное изменение свободной энергии сорбции, по всей
г)
д ., ммоль/г
0,7 0,8 0,9 1,0
С , ммоль/л
0,8 0,9 1,0
С , ммоль/л
рнг.
Рис. 1. Концентрационные зависимости емкости равновесной сорбции глюкозы из модельного водного раствора (0,9 % ЫаС1) на КП (а, б) и на гл-МИПе (в, г) для различных рН при двух значениях температуры Т; рН: 2,4 (/); 7,0 (2); 11,0 (3); Т, К: 293 (а, в); Ш (6, г)
видимости, определялось превалирующим вкладом водородных связей. В кислой и щелочной средах сорбция протекала как эндотермический энтропийно контролируемый процесс (положительное изменение энтальпии и энтропии), так как образование водородных связей между глюкозой и сорбентом подавлялись из-за избытка Н-протонов или ОН-анионов в сорбционной среде. Но при этом эндотермическая сорбция сопровождалась более равномерным распределением сорбата в неимпринтированной полимерной сетке (см. рис. 1, б).
Чем же может объясняться природа гидрофобного связывания глюкозы с КП?
В работах по исследованию влияния структуры углеводов (в частности, пространственного расположения ОН-групп) на структуру воды как растворителя осуществлялся анализ доступной площади поверхности углеводов и расчет приблизительной энергии растворения молекул. Для этого применялся метод молекулярной динамики в сочетании с расчетом углов водородных связей в системе вода — вода в окружении молекулы углевода [8,9]. Расчет энергии растворения молекулы углевода производился на основании суммарного вклада электростатических взаимодействий растворителя с полярными группами и гидрофобных — с неполярными. Конформация
Примечания:
1. КП, Гл-МИП — контрольный полимер и полимер, импринтированный глюкозой.
2. Верхние и нижние значения величин определены при Г] = 293 К и Т2 = 310 К, соответственно.
3. Сорбция из 0,09 % водного раствора №С1.
Коэффициенты распределения и термодинамические функции сорбции глюкозы полимерными сорбентами
Сорбент рН г,/г2 АС? АН А ГА 5
глюкозы кДж/моль
Сорбция без мочевины
2,4 2002,2 -18,49 13,30 31,79
2702,4 -20,33 13,30 33,63
КП 11,0 1397,0 -17,61 35,06 52,68
3080,2 -20,67 35,06 55,73
1381,0 -17,58 -45,59 -28,01
7,0 493,9 -15,96 -45,59 -29,64
1347,8 -17,52 7,33 24,85
1590,1 -18,97 7,33 26,30
Гл-МИП 11,0 725,4 1132,8 -16,01 -18,09 19,77 19,77 35,78 37,86
2,4 1414,0 -17,84 8,49 26,13
1712,4 -19,16 8,49 27,65
Сорбция в среде 1М мочевины
КП 272,21 -13,63 -6,28 7,35
7,0 236,29 -14,06 -6,28 7,78
Гл-МИП 46,62 5,91 -9,24 -10,21 7,55 7,55 16,79 17,76
молекул углеводов определялась ориентацией ОН-групп либо в экваториальной, либо в осевой плоскостях относительно углеводородного кольца углевода. При экваториальной ориентации ОН-групп возрастала вероятность образования водородных связей между молекулами углевода и растворителя. При осевой — образовывался водородный каркас внутри молекулы углевода, и одновременно с этим увеличивалась вероятность взаимодействий молекул растворителя с неполярными СН-радикалами углеводного кольца.
Таким образом, на основании этих работ и экспериментальных данных по изучению термодинамических функций сорбции можно полагать, что полифункциональное неспецифичное связывание глюкозы с КП осуществлялось в результате водородных связей и гидрофобных взаимодействий и что соотношение их вкладов в сорбцию значительно зависело от физико-химических условий сорбционной среды.
При сорбции глюкозы гл-МИПом наблюдалось полифункциональное связывание и неоднородное распределение сорбата (рис. 1, в, г). Но в отличие от сорбции на КП, характер изотерм мало изменялся при варьировании температуры и рН. Это свидетельствовало о различии в механизмах распределения глюкозы в контрольной и импринтированной полимерных сетках, и было обусловлено наличием в импринтированной полимерной матрице гл-МИПа специфичных сорбционных сайтов.
Как правило, специфичная селективность импринтированных сорбентов возрастает при большем соответствии условий сорбции условиям синтеза, в которых формируются аффинные центры [10]. Синтез гл-МИПа осуществлялся методом радикальной сополимеризации при температуре 60 °С, и поэтому возрастало гидрофобное сродство формирующихся искусственных рецепторов к шаблонным молекулам глюкозы.
В импринтированных полимерных сетках связывание сорбата осуществляется при взаимовлиянии специфичных и неспецифичных взаимодействий. Как видно из таблицы, при значении рН, равном 7,0 (т. е. в условиях, близких к условиям синтеза гл-МИПа), термодинамические функции сорбции на гл-МИПе отличались от сорбции на КП. Неспецифичное связывание глюкозы с КП при указанном значении рН осуществлялось при доминирующем вкладе водородных связей, в то время как при сорбции на гл-МИПе наблюдалось доминирование гидрофобных взаимодействий, обусловленное преобладанием специфичного связывания сорбата с аффинными центрами гидрофобной природы (см. таблицу). В кислой и щелочной средах термодинамически выгодное изменение свободной энергии сорбции и на КП, и на гл-МИПе определялось гидрофобными взаимодействиями. Но при этом, в отличие от КП, на гл-МИПе термодинамические функции практически не изменялись при изменении рН, что подтверждало преимущественное распределение глюкозы на сорбционных центрах другой природы (комплементарных полостях).
Одним из способов исследования соотношения вкладов водородных связей и гидрофобных взаимодействий в сорбцию является изучение изотерм и термодинамических функций сорбции в присутствии мочевины.
Как видно из таблицы, при сорбции на КП введение 1 М мочевины в сорбционную среду полностью изменило механизм связывания углевода с неимпринтированной полимерной сеткой. При этом подавление водородных связей способствовало возрастанию вклада гидрофоб-
СПИСОК J
ruggemann, О. New configurations and appli-
rug-
gemann, K. Haupt, L. Ye |et al.| // Chromatogr. A.— 2000,- Vol. 889,- P. 15-24.
2. Spivak, D.A. Optimization, evaluation, and characterization of molecularly imprinted polymers / D.A. Spivak // Advanced Drug Delivery Reviws.— 2005,- Vol. 57,- P. 1779-1794.
3. Лопаткин, H.A. Эфферентные методы в медицине / H.A. Лопаткин, Ю.М. Лопухин,— М.: Медицина, 1989,- 352 с.
4. Лейкин, А.Ю. Высокоселективные гемо-и энтеросорбционные системы на основе полимер-
ных взаимодействий в системе , а коэффициенты распределения понижались на порядок.
При сорбции на гл-МИПевсреде 1 М мочевины энтальпийная составляющая свободной энергии сорбции практически не изменялась по величине, оставаясь положительной. Незначительное понижение энтропийного члена изменения свободной энергии сорбции показывало достаточно малый вклад неспецифичного связывания.
В заключение можно сделать вывод, что неспецифичное связывание глюкозы с молекулярным контрольным неимпринтированным полимером определяется водородными связями и гидрофобными взаимодействиями, соотношение вкладов которых в общее изменение свободной энергии сорбции можно регулировать физико-химическими условиями среды.
При этом в процессе сорбции глюкозы на гл-МИПе имело место специфичное распознавание молекул сорбата искусственными рецепторами в молекулярно импринтированной полимерной сетке. Преимущественно специфичная сорбция глюкозы наблюдалось в условиях среды, наиболее близких к физиологическим (0,9 %-й водный раствор №С1, рН = 7,0).
Таким образом, новый молекулярно имп-ринтированный сорбент способен выполнять функцию искусственного рецептора молекулы глюкозы, что в дальнейшем обеспечит высокоселективную специфичную сорбцию углевода непосредственно из плазмы крови.
Работа осуществлялась при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009—2013 годы» (контракт №14.740.11.0382) и гранта РФФИ 09-03-00516.
ных ионитов / А.Ю. Лейкин, Т.А. Черкасова, И.В. Кумпаненко, А.В. Рощин // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева).— 2006.— Т. L.— № 5,- С. 309-321.
5. Либинсон, Г.С. Сорбция органических веществ ионитами / Г.С. Либинсон —М.: Медицина, 1979,- 182 с.
6. Cooper, А. / A. Cooper, С. Johnson, J. Lakey, Nollmann // Biophysical Chemistry. —2001,— Vol.
93,- № 2-3,- P. 215-230.
7. Ben-Naim, A. Hydrophobic phenomena in biochemical process / A. Ben-Naim // Biophysical Chemistry.- 2003,- Vol. 105,- № 2,- P. 183-193.
8. Behler, J. Water structuring properties of carbohydrates, molecular dynamics studies on 1,5-anhydro-D-fructose / J. Behler, D.W. Price, M.G.B. Drew // Phys. Chem. Chem. Phys.- 2001,- № 3,- P. 588-601.
9. Dashnau, J.L. Carbohydrate intramolecular hydrogen bonding cooperativity and its effect on water structure / J.L. Dashnau, K.A. Sharp, J.M. Vanderkooi
// J. Phys. Chem. В.- 2005,- Vol.109.- Р. 2415224159.
10. Ежова, Н.М. Сорбция лизина молекуляр-но импринтированными карбоксильными сорбентами / Н.М. Ежова, И.В. Полякова, O.A. Писарев // Прикл. биохимия и микробиология,— 2009.— Т. 45,- № 2,- С. 243-247.
