CC BY
28
УДК 543
ГРАДИЕНТНОЕ ВЭЖХ РАЗДЕЛЕНИЕ АЛКИЛФОСФОНОВЫХ КИСЛОТ НА ПОРИСТОМ ГРАФИТИРОВАННОМ СОРБЕНТЕ HYPERCARB С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВОДНОГО РАСТВОРА МУРАВЬИНОЙ КИСЛОТЫ В КАЧЕСТВЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ
Е.Н. Гончарова, И.П. Семенова, М.А. Статкус*, Г.И. Цизин
(кафедра аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; e-mail: mstatkus@gmail.com)
Предложен способ градиентного ВЭЖХ-разделения алкилфосфоновых кислот на пористом графитированном углеродном сорбенте Hypercarb с использованием водного раствора муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы. Аналиты детектировали с помощью квадрупольного масс-спектрометра. Для увеличения удерживания аналитов хроматографическую колонку перед инжекцией раствора образца промывали водой. Этот прием позволяет увеличить коэффициенты удерживания алкилфосфоновых кислот в 3-4 раза по сравнению с описанными в литературе аналогами.
Ключевые слова: жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, пористый графити-рованный углеродный сорбент Hypercarb, алкилфосфоновые кислоты.
Нервно-паралитические отравляющие вещества (зарин ОБ, зоман ОЭ, ви-газ УХ) относятся к наиболее опасным видам химического оружия. Эти фосфорорганические соединения чрезвычайно токсичны и, попадая в организм человека, поражают нервную систему [1]. Согласно Конвенции о запрещении химического оружия 1993 г., производство, накопление и применение этих веществ запрещены. Важный аспект Конвенции - развитие методов определения фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) и продуктов их распада в образцах, взятых с мест производства или хранения, а также из окружающей среды (в случае их применения). Большинство ФОВ летучи, относительно неполярны и при попадании в окружающую среду подвергаются достаточно быстрому гидролизу до соответствующих О-алкилалкилфосфоновых кислот, а затем более медленному гидролизу до алкилфосфоновых кислот. Продукты разложения ФОВ относительно устойчивы и значительно менее токсичны, чем исходные вещества; присутствие этих продуктов трансформации свидетельствует о наличии контакта анализируемого объекта с ФОВ [2].
Конечный продукт гидролиза зарина, зома-на и УХ - метилфосфоновая кислота; она и ее гомологи (этил- и пропилфосфоновые кислоты) входят в «Список 2» химических соединений,
контролируемых в соответствии с Конвенцией о запрещении химического оружия.
Определение конечных продуктов гидролиза фосфорорганических отравляющих веществ -непростая задача. Из-за низкого поглощения в УФ-области и отсутствия способности к флуоресценции селективное детектирование этих веществ можно проводить только с помощью метода масс-спектрометрии [3]. Известны работы, в которых для косвенного УФ-детектирования алкилфосфоновые кислоты переводили в бензил-производные [4], однако это усложняет процедуру анализа и не позволяет надежно идентифицировать отдельные аналиты.
Для определения алкилфосфоновых кислот широко используют газовую хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС), но по причине нелетучести аналитов требуется трудоемкая и длительная деривати-зация [5-7]. Поскольку алкилфосфоновые кислоты обладают кислотными свойствами (рКа = 2,5), их можно определять с помощью анионо-обменной хроматографии. Но естественное содержание анионов в анализируемых объектах существенно превышает возможную концентрацию алкилфосфоновых кислот, что затрудняет ионнохроматографическое разделение и определение. Эти трудности приводят к тому, что все чаще для определения алкилфосфоновых кислот
применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию в обращенно-фазовом режиме с использованием масс-спектрометрического детектирования (ВЭЖХ-МС). В этом случае в водных образцах определение можно проводить напрямую (без дериватизации), сводя к минимуму возможные потери аналитов перед анализом. Использование тандемной масс-спектрометрии позволяет достигать весьма низких пределов обнаружения (10 нг/мл для метилфосфоновой кислоты [8]), не прибегая к трудоемким и длительным методам пробоподготовки.
Алкилфосфоновые кислоты - очень гидрофильные вещества, поэтому их разделение в режиме обращенно-фазовой хроматографии затруднительно по причине их малого удерживания. Для решения проблемы удерживания гидрофильных аналитов в литературе предложено использовать пористый графитированный углеродный сорбент ИурегоагЬ [9]. В качестве элюента для разделения метил-, этил- и пропил-алкилфосфоновых кислот (а также бутилфос-фоновой и О-алкилалкилфосфоновых кислот) использовали водный раствор муравьиной и других карбоновых кислот. Удалось достигнуть разделения всех аналитов, однако для метил-, этил- и пропилфосфоновых кислот коэффициенты удерживания достаточно низкие (около 0,8-2,6).
Мы предлагаем решить проблему недостаточного удерживания метил-, этил- и про-пилфосфоновых кислот за счет использования
градиента концентрации муравьиной кислоты в подвижной фазе.
Настоящая работа посвящена разработке прямого метода определения метил-, этил- и пропилфосфоновых кислот в водных растворах с использованием углеродного сорбента Hypercarb, основанного на ВЭЖХ-МС-разделении и определении.
Экспериментальная часть
Реагенты и сорбенты. Для приготовления растворов и элюентов использовали деиони-зованную воду, которую получали на установке «Millipore Simplicity» («Millipore», США), удельное сопротивление воды составляло 18,2 МОмсм. Для приготовления элюентов использовали раствор муравьиной кислоты в воде (50 мас.%), степень чистоты «for HPLC» («Sigma-Aldrich», США).
Использовали растворы метилфосфоновой (MPA), этилфосфоновой (EtPA) и н-пропил-фосфоновой (и-PrPA) кислот в ацетонитриле с концентрацией 0,1 мг/мл. Все растворы хранили в стеклянной посуде с притертыми пробками. Исходные растворы хранили в темноте при +4 °С.
Аппаратура. Для определения использовали жидкостной хромато-масс-спектрометр производства «Shimadzu» (Япония), состоящий из следующих модулей:
квадрупольный масс-спектрометр «LCMS-20202 c ионизацией аналитов электрораспылением (ESI);
Т а б л и ц а 1
Параметры МС-детектора и интерфейса
Параметр Значение
Время накопления сигнала на выбранной массе (SIM event time) 0,2 с
Напряжение на детекторе (Detector voltage) 1,1 кВ
Напряжение на интерфейсе (Interface voltage) -4,5 кВ
Напряжение на линии десольватации (DL voltage) 0 В
Температура интерфейса (Interface temperature) 350 °C
Температура линии десольватации (DL temperature) 250 °C
Поток газа-распылителя (Nebulizing gas flow) 1,5 л/мин
Температура блока нагревателя (Heat Block) 400 °C
Поток газа-осушителя (Drying gas flow) 15 л/мин
Режим ионизации (Ionisation mode) ESI
два ВЭЖХ-насоса LC-20; автосамплер «SIL-20AC». ВЭЖХ-разделение осуществляли на колонке с пористым графитированным углеродным сорбентом Hypercarb 30x2,1 мм («Thermo Scientific», США), диаметр частиц 5 мкм.
Условия хроматографического разделения. В качестве элюента использовали деионизован-ную воду с добавкой муравьиной кислоты (от 0,01 до 0,5 об.%). Скорость потока составляла 0,2 мл/мин, температура колонки 40 °С.
Т а б л и ц а 2
Параметры регистрации ионов аналитов
Аналит m/z Регистрируемый ион
MPA 95 [M-H]-
EtPA 109 [M-H]-
w-PrPA 123 [M-H]-
Т а б л и ц а 3
Градиент для разделения алкилфосфоновых кислот
Время элюирования, мин Состав элюента
20-0 (до инжекции) деионизванная вода
инжекция образца
0-10 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в деионизованной воде
В работе для детектирования алкилфосфоновых кислот использовали параметры МС-детектора и интерфейса, указанные в табл. 1. Эти параметры не оптимизировали, используя рекомендованные производителем оборудования значения.
Параметры регистрации ионов аналитов представлены в табл. 2. Величины m/z и режим
с
S к
В
S s
3600 3400 3200 3000 2800
- 1 ; А 2 А
1,1,1,1,1,1,1,
3600 3400 3200 3000 2800
0 2 3 4 Время, мин 5 6 7
- з Б
- 2 / 1
- / 1
01234 56 78
Время, мин
Рис. 1. Хроматограммы разделения алкилфосфоновых кислот: А - изократический режим, элюент - 0,1%-й раствор НСООН в воде; Б - градиентное элюирование согласно программе, представленной в табл. 3. Условия определения: колонка НурегсагЬ 30*2,1; температура колонки: 40 °С; МС-детектирование (1 - метилфос-фоновая кислота, 2 - этилфосфоновая кислота, 3 - пропилфосфоновая кислота)
Т а б л и ц а 4
Ширина на полувысоте и разрешение пиков аналитов
Условия определения ю1/2, мин R S
MPA EtPA w-PrPA MPA-EtPA EtPA-w-PrPA
Градиентное элюирование 0,158 0,194 0,291 0,94 1,52
Изократический режим 0,219 0,247 0,318 0,51 1,12
регистрации ионов выбирали, исходя из строения определяемых веществ. Детектирование проводили в режиме SIM-регистрации отрицательных ионов.
Результаты и обсуждение
Алкилфосфонофые кислоты (APA) представляют собой очень полярные соединения и слабо удерживаются на большинстве коммерчески доступных фаз в режиме обращено-фазовой ВЭЖХ, что затрудняет их определение. Известно, что на сорбенте Hypercarb удерживание полярных соединений существенно выше, чем на октадецилсиликагеле. В нескольких работах [9, 10] предложено использовать Hypercarb в качестве неподвижной фазы в ВЭЖХ для разделения алкилфосфонофых и алкилметилфосфоновых кислот (AMPA). В качестве подвижной фазы использовали растворы муравьиной и других кар-боновых кислот в воде. При увеличении концентрации карбоновых кислот в элюенте удерживание APA и AMPA уменьшается, что свидетельствует о вытеснительном «квази-ионообменном» механизме элюирования аналитов. В работе [10] предложено использовать в качестве элюента 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде. При этом коэффициент удерживания MPA достаточно мал и составляет 0,8. Авторы попробовали провести разделение APA с помощью воды без добавок карбоновых кислот, однако в этом случае коэффициент удерживания самого слабоудер-живаемого компонента смеси (MPA) превысил значение 30, что делает разделение практически невозможным. Мы предположили, что проведение элюирования с использованием градиента концентрации муравьиной кислоты в воде позволит решить проблему слабого удерживания аналитов. Для проверки этого предположения была предложена градиентная программа, представленная в табл. 3. Первая часть градиента (20 мин до ввода образца, так называемая «промывка») необходима для установления равновесия
к'
__3
-■
/ 2
/ V~ -Ш
1
: y J 1 MPA 2 EtPA 3 PrPA
ii i
0 5 10 15 20 25 30
Время, мин
Рис. 2. Зависимость коэффициентов емкости аналитов от времени предварительной промывки колонки деионизо-ванной водой
к' 16 -
1 MPA
2 EtPA
3 PrPA
4 Li_i_i_,_i_i_._._i_i_i_._,_._i_i_._i_i_i_i_._i_i_._L
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
СНСООН' 0/о
Рис. 3. Зависимость коэффициентов емкости аналитов от концентрации муравьиной кислоты в элюенте
Т а б л и ц а 5
Метрологические характеристики определения APA
Аналит Градиентное раздедение Изократическое разделение
уравнение градуировочной зависимости R2 ^ин мкг/мл уравнение градуировочной зависимости R2 ^ин мкг/мл
MPA y = 2841х + 853 0,996 0,47 y = 2834х + 1179 0,965 1,34
EtPA y = 3147х + 687 0,995 0,53 y = 3216х + 978 0,968 1,28
w-PrPA y = 6949х + 2162 0,994 0,59 y = 7424х + 1962 0,979 1,04
хроматографической колонки с водным элюен-том, не содержащим муравьиной кислоты, при этом из колонки удаляется муравьиная кислота, оставшаяся после предыдущего разделения. Затем происходит ввод образца и одновременное повышение концентрации муравьиной кислоты до 0,1%.
Данный градиент позволяет увеличить время удерживания APA, улучшить их разделение и форму пиков (уменьшить ширину пиков) по сравнению с изократическим элюированием 0,1%-м раствором муравьиной кислоты в де-ионизованной воде (рис. 1). Значения ширины пиков на полувысоте и разрешение пиков ана-литов приведены в табл. 4.
Для выбора оптимальных условий проведения разделения мы изучили зависимость коэффициентов емкости аналитов от времени промывки колонки водой (рис. 2) при проведении элюирования 0,25%-й муравьиной кислотой в воде.
Увеличение времени промывки до 20 мин приводит к увеличению удерживания аналитов и коэффициентов емкости; дальнейшее увеличение времени промывки не приводит к существенному изменению коэффициентов емкости. Поэтому для дальнейшей работы в качестве оптимальной выбрана продолжительность промывки 20 мин.
Изучена зависимость коэффициентов емкости аналитов от концентрации муравьиной кислоты в элюенте при предварительной промывке колонки деионизованной водой в течение 20 мин (рис. 3). При увеличении концентрации муравьиной кислоты в элюенте до 0,1% происходит уменьшение коэффициентов емкости аналитов; дальнейшее увеличение концентрации не приводит к существенному изменению удерживания APA. В качестве оптимальной выбрана концентрация муравьиной кислоты 0,1%, так как в этом случае длительность разделения не превышает 7 мин.
В выбранных условиях для каждого определяемого вещества были построены градуиро-вочные зависимости, рассчитаны пределы обнаружения, полученные результаты представлены в табл. 5. Видно, что тангенсы углов наклона градуировочных зависимостей для каждого определяемого вещества примерно одинаковы в градиентном и изократическом режимах, однако градиентное элюирование позволяет уменьшить пределы обнаружения в 2-3 раза за счет улучшения воспроизводимости площадей пиков аналитов. По нашему мнению, это связано с увеличением времени удерживания аналитов.
Авторы выражают благодарность И.В. Ры-бальченко и И. А. Родину за предоставленные растворы аналитов.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-23-00012).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Munro B., Talmage S. // Environmental Health Perspectives 1999. Vol. 107. N 12. P. 933.
2. Owens J., Koester C. // J. Agric. Food Chem. 2009. Vol. 57. N 17. P. 8227.
3. Desoubries C. et al. // J. Chromatogr. B. 2012. Vol. 900. P. 48.
4. Mazumder A., Gupta H. // J. Chromatogr. A. 2009. Vol. 1216. P. 5228.
5. Riches, Morton I., ReadR.W., BlackR.M. // J. Chromatogr. B. 2005. Vol. 816. P. 251.
6. Sega G., Tomkins B., Wayne H. // J. Chromatogr. A. 1997. Vol. 790. P. 143.
7. Kataoka M. // J. Chromatogr. A. 2000. Vol. 891. P. 295.
8. Zhou T., Lucy Ch. // J. Chromatogr. A. 2008. Vol. 1213. P. 8.
9. Байгильдиев Т.М., Родин И.А, Ставрианиди А.Н., Браун А.В., Ахмерова Д.И., Шпигун О.А., Рыбальчен-ко И.В. Экспрессное определение низких содержаний метилфосфоновой кислоты методом ВЭЖХ-МС/МС // Заводская лаборатория 2016. Т. 82. С. 5.
10. Mercier J.P., Morin Ph., Dreux M., Tambute A. // 11. Roen B. // Analytica Chimica Act. 2013. Vol. 761. J. Chromatogr. A. 1999. Vol. 849. Р. 197. P. 109.
Поступила в редакцию 20.04.17
GRADIENT HPLC SEPARATION OF ALKYLPHOSPHONIC ACIDS ON POROUS GRAPHITIC CARBON SORBENT HYPERCARB WITH WATER SOLUTION OF FORMIC ACID AS A MOBILE PHASE
E.N. Goncharova, I.P. Semenova, M.A. Statkus*, G.I. Tsysin
(Analytical chemistry division M.V. Lomonosov Moscow State University, Chemistry Department; e-mail: mstatkus@gmail.com)
An approach to gradient HPLC separation of alkylphosphonic acids on porous graphitic carbon sorbent Hypercarb with water solution of formic acid as a mobile phase was proposed. Analytes were detected by quadrupole mass-spectrometer. HPLC column was washed with water before the injection of analytes, this procedure resulted in 3-4 fold increase of the retention times of alkylphosphonic acids compared to literature data.
Key words: liquid chromtography (HPLC), mass spectrometry, porous graphitic carbon Hypercarb, alkylphosphonic acids.
Сведения об авторах: Гончарова Елизавета Николаевна - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (goncharovae.n@mail.ru); Семенова Ирина Павловна - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (semenova150794@gmail.com); Статкус Михаил Александрович - ст. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (mstatkus@gmail.com); Цизин Григорий Ильич - глав. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (tsisin@analyt.chem.msu.ru).
