CC BY
118
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 2, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.633-674:543.544
А. А. Дутов, Ю. Л. Лукьянова, Е. В. Беленькова, А. В. Сверкунова, О. Н. Коновалова, Е. Н. Федорова,
А. В. Ермолина
ВЗЖХ-АНАЛИЗ ВАНИЛИЛМИНДАЛЬНОЙ, 5-ГИДРОКСИИНДОЛУКСУСНОЙ,
гомованилиновой и гомогЕнтизиновой Кислот в биологических жидкостях в клинической лаборатории
Лаборатория хроматографии НИИ медицинской экологии при Читинской государственной медицинской академии, аналитическая лаборатория кафедры химии Читинского государственного университета
Предложен простой и быстрый метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) анализа ванилилминдаль-ной, гидроксииндолуксусной, гомованилиновой и гомогентизиновой кислот в моче с твердофазной экстракцией на сверхсши-том полистироле (Purosep-200). Разделение на колонке Chromolith Performance RP-18e ("Merck") 100 • 4,6 мм с монолитным обращенно-фазным силикагелем в изократическом или градиентном режиме с УФ-детекцией при 285 нм. Для простого моноанализа ванилилминдальной или гомогентизиновой кислот используют изократический режим. Элюент изопропанол-вода-TFA (1:99:0,025, v/v/v), скорость потока 1400 мкл/мин, давление 37 бар, полное разделение менее чем за 4 мин. При анализе ванилилминдальной, гидроксииндолуксусной и гомованилиновой кислот применяют градиентный режим низкого давления, при этом переключение на 2-й элюент осуществлялось со 2-й минуты. Состав элюента изопропанол-вода-TFA (6:94:0,025, v/v/v/v), скорость потока 1400 мкл/мин, давление 43 бар, полное разделение менее чем за 7 мин. Выход (процент экстракции) составил 78-113%. Простота, воспроизводимость и достаточная чувствительность метода в сочетании с возможностью его реализации на стандартном хроматографическом оборудовании (изократический насос и УФ-детектор) делают его пригодным для рутинного клинического применения.
Ключевые слова: ВЭЖХ, ванилилминдальная кислота, гомогентизиновая кислота, моча, спинномозговая жидкость, монолитные колонки, сверхсшитый полистирол
A.A. Dutov, Yu.L. Lukyanova, E.V Belenkova, A.V Sverkunova, O.N. Konovalova, E.N. Fedorova, A.V Yermolina
THE HPLC ANALYSIS OF VANILLIL-ALMOND, 5-HYDROXIINDOLACETIC, HOMOVANILLIC AND HOMOGENTISIC AciDs IN BioLoGic Fluids IN cLINicAL LABoRATORY
The simple and fast HPLC technique of analysis of vanillil-almond, 5-hydroxiindolacetic, homovanillic and homogentisic acids in urine with solid-phase extraction using ultra cross-linkedpolystyrene (Purosep-200) is proposed. The separation on column Chromolith Performance RP-18e "Merck» 100x4.6 mm with monolithic phase-reversed silica gel in isocratic or gradient mode with ultraviolet detection under 285 nm. The isocratic mode is applied in case of ordinary analysis of vanillil-almond or homogentisic acids. The composition of eluent is isopropanol - water - TFA (1:99:0.025, v/v/v), flow speed is 1400 mkl/min; pressure is 37 bar, full separation less than in 4 min. The gradient low pressure mode is applied to analyze vanillil-almond, hydroxiindolacetic and homovanillic acids. Under this approach the switching to second eluent occurred from second minute. The composition of eluent is isopropanol-water-TFA (6:94:0.025, v/v/v), flow speed is 1400 mkl/min, pressure is 43 bar, full separation is less than in 7 min. The output (extraction share) consisted 78-113%. The simplicity, reproducibility and sufficient sensitivity of technique in combination with the possibility of its application on standard chromatographic equipment (isocratic pump and ultraviolet detector) made it useful for routine clinical application.
Key words: HPLC, homovanillic acid, homogentisic acid, urine, cerebrospinal fluid, monolithic column, ultra cross-linked polystyrene
Введение. Ранее нами был предложен метод определения метаболитов катехоламинов и серотонина в моче [1]. Однако значительная продолжительность анализа и сложная система хроматографического разделения затрудняли его адаптацию к лабораторной практике. Анализ ванилилминдальной кислоты в моче не утратил своего значения как диагностический тест при феохро-моцитоме. В частности, на первом месте по чувствительности и специфичности стоит определение уровня свободных норметанефрина и метанефрина в моче, на втором - анализ ванилилминдальной кислоты в моче [3, 5]. Существующие методы ВЭЖХ-анализа реализуются в основном с использованием электрохимической
Для корреспонденции:
Дутов Алексей Александрович, д-р мед. наук, ст. науч. сотр. Адрес: 672090, Чита, ул. Горького, 39а.
Телефон: 8 (3022) 31-35-62.
E-mail:dutovaa@yandex.ru
детекции [4]. Между тем их можно успешно определить и с помощью спектрофотометрического детектора, популярного в хроматографической практике. В связи с этим мы разработали новый метод анализа указанных органических кислот в моче и спинномозговой жидкости с твердофазной экстракцией на сверхсшитом полистироле, быстрым разделением на колонках с монолитным сорбентом и УФ-детекцией.
Материалы и методы. Реактивы. Стандарты ванилилминдальной (4-hydroxy-3-methoxymandelic acid, VMA), изо-ванилилминдальной (3-hydroxy-4-methoxy-mandelic acid, is-oVMA), гомованилиновой (4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid, HVA), диоксифенилуксус-ной (3,4-dihydroxyphenylacetic acid, DOPAc) кислот ("Fluka"), 5-гидроксииндолуксусной (5-hydroxy-3-indo-lacetic acid, HIAA) и гомогентизиновой (2,5-dihydroxy-phenylacetic acid, Hacid) кислот ("Sigma") растворяли в ацетоне (1000 нг/мкл) и хранили в холодильнике при 4°c (сохраняются до 1 года). Ацетонитрил (HPLc-
28
БИОХИМИЯ
Рис. 1. Хроматограммы стандартов по 200 нг каждого (а) и экстракта мочи у пациентки без патологии надпочечников (б).
Колонка Chromolith Performance RP-18e 100 • 4,6 мм с защитной предколонкой 5 • 4,6 м. УФ-детекция при 285 нм. Элюент изопропанол - вода - TFA (1:99:0,025, v/v/v), 1400 мкл/мин, 37 бар. Экстракция 92%, концентрация YMA 4,6 мг/сут (норма < 6,9 мг/сут [3]).
gradient grade, "Panreac", Испания), изопропанол (HPLC; 15 мв "Panreac"), метанол (Х.Ч., "Век-тон", Санкт-Петербург), ацетон (О.С.Ч., "Вектон", Санкт-Петербург), трифторуксусная кислота (TFA, 99%, "Panreac"), фосфорная кислота (puriss, for HPLC,
85-90%, "Fluka", Германия), диметилсульфоксид (ДМСО, UY-IR-HPLC-GPC; "Panreac", Испания).
Аппаратура и оборудование. Спектрофотометрический детектор SPD-20A Prominence ("Shimadzu", Япония), насос высокого давления LC-20AT Prominence ("Shimadzu", Япония) с ручным краном Hamilton переключения потоков в линии низкого давления для формирования ступенчатого градиента, ручной инжектор 7725i Rheodyne (США) с петлей на 100 мкл, компьютерная хроматографическая программа "Мультихром", версия 1,5х ("Амперсанд", Москва). Колонка Chromolith Performance RP-18e 100 • 4,6 мм с защитной предколонкой 5 • 4,6 мм ("Merck", Германия). УФ-детекция при 285 нм. Элюент № 1: изопропанол-вода-трифторуксусная кислота (1:99:0,025, v/v/v1); элюент № 2: изопропанол-вода-трифторуксусная кислота (6:94:0,025, v/v/v). Скорость потока 1400 мкл/мин, переключение с 1-й на 2-й минуте. Картриджи на основе 1- и 3-миллиметровых полипропиленовых шприцов с фторпластовыми фильтрами ("Supelco", США), упакованные 10 мг сверхсшитого полистирола (Purosep-200) по собственной технологии2.
Твердофазную экстракцию осуществляли с помощью манифолда на 12 картриджей ("Merck", Германия) и вакуумного микронасоса Mosquito (США). Упаривание производили в сушильном электрошкафе с пассивной конвекцией СНОЛ-3,5 ("Рембыттермо", Новосибирск).
Результаты и обсуждение. Биоматериал. В банку для сбора суточной мочи добавляли 1 г/л борной кислоты. Аликвоту из суточной мочи отбирали в 2-миллиметровую полипропиленовую пробирку и доставляли в лабораторию. В замороженном виде может сохраняться до нескольких месяцев. Посткризовую мочу собирали аналогично, в течение 3 ч после окончания криза.
Стандарты без экстракции. По 20 мкл стандартов YMA и isoVMA, 5 мкл HIAA и 10 мкл HYA (1000 нг/мкл в ацетоне каждый) отбирали 50-микролитровым микрошприцем Hamilton в 5-миллиметровый стеклянный стаканчик и упаривали досуха при 60oC. Сухой остаток растворяли в 500 мкл воды, и 5 мкл вводили в петлю
1 Volume/volume, т. е. объемные соотношения.
2 Сорбент представлен проф. В. А. Даванковым, руководителем группы исследователей, создавших сорбент, - ИНЭОС им. Несмеянова РАН, Москва. Техника упаковки: 10 мг сорбента в 2 мл смеси изопропанол-вода (1:1, v/v), интенсивное перемешивание, быстрое введение в картридж, упаковка самотеком.
(содержит по 200 нг YMA и isoVMA, 50 нг HIAA и 100 нг HYA).
Экстракция. Картриджы промывали последовательно 1 мл 5% водного ДМСО и по 0,5 мл ацетонитрила, метанола и воды. К 200 мл мочи добавляли 40 мкл IS (базовый ацетоновый стандарт 1000 нг/мл разбавляли водой 1:9, v/v), 5 мкл концентрированной H3P04 и вводили в картридж самотеком. После окончания загрузки промывали сорбент 100 мкл разбавленной фосфорной кислоты (20 мкл концентрированной H3P04 на 1 мл воды), затем 100 мкл воды. Высушивали 3 мин под вакуумом (-5 InHg), элюировали 2 • 150 мкл смеси ацетон-метанол (9:1, v/v) в 10-миллилитровый стеклянный стаканчик "Simax" (Чехия). Упаривали досуха в термостате при 5oC, сухой остаток растворяли в 200 мкл водного ДМСО (10 мкл на 1 мл воды) и 10 мкл вводили в петлю инжектора (200 нг IS).
Разработка технологии твердофазной экстракции включает оптимизацию загрузки, промывки, элюирования и упаривания/растворения. В качестве кислот при загрузке биопробы испытаны уксусная, трифто-руксусная и фосфорная кислоты. Оптимальные результаты получены с фосфорной кислотой - экстракционные потери не превышали 3-5%. При нейтральной загрузке (pH около 7,0) потери составили 12-16%. Скорость загрузки не должна превышать 0,5 мл/мин. Конструктивные особенности картриджа также важны - более стабильные результаты получены на картриджах объемом 1 мл в сравнении с 3-миллилитровым. Оптимизированная промывка вначале проводится 1% водной фосфорной кислотой, а затем водой для удаления остатков кислоты перед щелочным элюированием. Возможна безводная промывка хлороформом, пентаном или гексаном. Потерь при этом не происходит, однако и качество экстрактов не улучшается в сравнении с водной промывкой. Элюирование возможно как "чистым" ацетоном, так и его смесями с метанолом в разных пропорциях. Наиболее стабильные результаты получены при элюировании смесью ацетон-метанол
29
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2011
(9:1 или 4:1, v/v). Высокого процента экстракции добились при элюировании смесью метанол-вода (2:1, v/v). Однако в этом варианте удлиняется время упаривания, а напрямую вводить элюат в колонку не рекомендуется, поскольку пики получаются "размазанными", и разделение резко ухудшается. Добавление 25% водного аммиака к элюирующим смесям (1-5%) не улучшает элюирования ароматических кислот, а качество экстрактов при этом практически не меняется. Важным этапом является упаривание/растворение, поскольку селективность экстракции можно повысить при использовании оптимального растворителя сухого остатка после упаривания. Температура упаривания не должна превышать 60oC, поскольку при ее повышении возникают проблемы с последующим растворением экстрактов биопроб (но не стандартов). Сухой остаток можно растворять в воде, но более стабильные результаты получаются при растворении в 1% водном ДМСО.
Выход (процент экстракции) составил 78-113% (n = 144).
Хроматография. Колонку уравновешивали в течение 5-7 мин путем непрерывного прокачивания элюента № 1. Затем в петлю инжектора вводили 5 мкл стандартов и после окончания хроматограммы промывали сорбент колонки 100 мкл изопропанола. После этого в петлю вводили по 10 мкл экстрактов мочи, промывая колонку после каждой биопробы 100 мкл изопропанола.
Если необходим скрининг на феохромоцитому, можно ограничиться простым моноанализом VMA в изократическом режиме (элюент № 1). Типичная хроматограмма представлена на рис. 1. Полный хроматографический цикл около 4 мин. Использование элю-ентов на основе изопропанола позволило практически полностью избавиться от хроматографического "перекрытия" vMA с другими эндогенными пиками, которое наблюдалось в 7% случаев (n = 46). Даже при хроматографической интерференции пик vMA всегда с четко обозначенной вершиной, поэтому идентификация и количественный анализ особых проблем не представляли. То же самое касалось и внутреннего стандарта, в этом случае хроматографическое "перекрытие" наблюдали в 11% случаев (n = 46).
Если необходим анализ VMA, HIAA и HVA, градиентный режим устанавливали переключением крана на 2-й минуте на элюент № 2. Типичная хроматограмма представлена на рис. 2. Хроматографическое перекрытие HIAA наблюдали в 13% случаев, HVA - в 5% (п = 46). Уменьшить вероятность интерференции мож-
Рис. 2. Хроматограммы стандартов (а) и экстракта мочи у пациента без патологии надпочечников (б).
Дозы стандартов VMA и IS по 200 нг, HIAA 50 нг и HVA 100 нг. Градиент низкого давления: элюент № 1 изопропанол-вода-TFA (1:99:0,025, v/v/v); элюент № 2 (со 2-й минуты) изопропанол-вода-TFA (6:94:0,025, v/v/v/v). Скорость потока 1400 мкл/мин, давление 37 и 43 бар соответственно. Экстракция 78%, концентрации VMA, HIAA и HVA 8,2, 2 и 2,4 мг/сут соответственно. Норма VMA и HVA < 6,9 и < 7,3 мг/сут [4], HIAA - 2-10 мг/сут [2].
Рис. 3. Хроматограмма ароматических кислот спинномозговой жидкости у 10-летнего мальчика без патологии надпочечников. Условия те же, что на рис. 2.
но разбавлением элюента - вместо 6% использовать 5-5,5% изопропанола. Однако в большинстве случаев в этом нет необходимости.
У элюентов на основе изопропанола есть достоинство и недостаток. Относительно первого - разделение ароматических карбоновых кислот гораздо эффективнее использования элюентов на основе ацетонитрила или метанола. Кроме того, заметно возрастает чувствительность, которая в 2-4 раза выше, чем при применении элюентов на основе ацетонитрила. Недостаток - высокое давление, которое в 2,5-3 раза выше в сравнении с
30
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
таковым при использовании элюентов на основе ацетонитрила. Это делает проблематичным их применение с традиционными колонками, упакованными суспензионным способом. Но проблем не возникает при использовании колонок с монолитным сорбентом и бимодальной структурой пор. Выяснилось еще одно преимущество колонок с монолитным сорбентом - высокая стабильность времен удерживания при работе с элюентами с низким содержанием органического компонента.
С помощью предложенной технологии экстракции и хроматографического разделения можно определять содержание ароматических
кислот в спинномозговой жидкости (рис. 3). Здесь их концентрация в несколько раз ниже, чем в моче. Метод может быть использован в неврологии, например, для контроля эффективности терапии паркинсонизма препаратами L-ДОФА.
Помимо диагностики феохромоцитомы, определение уровня VMA, 5-HIAA и HVA может использоваться в качестве скрининговых тестов на нейробластому у детей [6-8].
Предложенным методом можно определять содержание гомогентизиновой кислоты - маркера алкаптонурии [2]. В норме гомогентизиновая кислота в моче практически отсутствует. Варианты хроматографического разделения стандартов представлены на рис. 3. Из представленных данных видно, что гомогентизиновая кислота не полностью разделяется с изованилилминдальной кислотой, особенно при использовании элюента на основе изопропанола. Самый простой способ - не добавлять последнюю к биопробе, поскольку ее применяют в качестве IS. Это вполне допустимо, если учесть относительную стабильность и полноту экстракции (не менее 78%). К тому же при алкаптонурии концентрация гомогентизиновой кислоты достигает гигантских значений и может превышать 2 г/сут [2]. Хроматографическое взаимодействие с DOPAC (3,4-дигидроксифенилуксусная кислота) полностью исключено (рис. 4).
Рис. 4. Хроматограмма стандартов органических кислот по 200 нг каждой (DOPAC 100 нг). Колонка Chromolith Performance RP-18e с защитной предколонкой 5 • 4,6 мм. УФ-детекция при 285 нм. Элю-енты изопропанол-вода-TFA (1:99:0,025, v/v/v), 1400 мкл/мин, 34 бар (а) и ацетонитрил-метанол-вода-TFA (3.5:3.5:93:0,025, v/v/v/v), 1400 мкл/мин, 37 бар (б).
Нижний предел чувствительности (лимит детекции) при УФ 285 нм составил для VMA 0,9 нг, isoVMA 1,1 нг, HIAA 0,25 нг, HVA 0,6 нг и Hacid 1 нг на инъекцию при соотношении сигнал/шум, равном 3.
Простота, воспроизводимость и достаточная чувствительность метода в сочетании с возможностью его реализации на стандартном хроматографическом оборудовании (изократический насос и УФ-детектор) делают его пригодным для рутинного клинического применения.
ЛИТЕРАТУРА
Дутов А. А. // Клин. лаб. диагн. - 2005. - № 2. - С. 18-20. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред. Н. У Тица. - М., 1997.
Boyle J. G., Davidson D. F., Perry C. G., Connell J. M. C. // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2007. - Vol. 92, N 12. - P. 4602-4608. DavidsonD. F. // Ann. Clin. Biochem. - 1989. - Vol. 26. - P. 137-143. Gerlo E. A., Sevens C. // Clin. Chem. - 1994. - Vol. 40. - P. 250-256. Kairisto V, Koskinen P., MattilaK. et al. // Clin. Chem. - 1992. - Vol. 38. - P. 416-420.
Kinoshita Y., Yamada S., Haraguchi K. et al. // Clin. Chem. - 1988. - Vol. 34. - P. 2228-2230.
Liu Yu-Li, Cheng A. T. A., Chen Herr Ren, Hsu Yun-Pung P. // Biomed. Chromatogr. - 2000. - Vol. 14, N 8. - P. 544-548.
Поступила 27.12.10
3
7
8
31
