Метод определения метаболитов гидроксилазного пути обмена триптофана в эпифизе крысы с помощью ион-парной хроматографии с детектированием по флуоресценции Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.1:591.147.5) - 074.543.54

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ

ГИДРОКСИЛАЗНОГО ПУТИ ОБМЕНА ТРИПТОФАНА В ЭПИФИЗЕ КРЫСЫ С ПОМОЩЬЮ ИОН-ПАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ ПО

ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ М.М.Золотухин, Е.М. Дорошенко УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Разработан чувствительный и селективный метод количественного определения: L-триптофана и метаболитов его гидроксилазного пути (серотонин, мелатонин, 5-гидроксииндолуксусная кислота, N-ацетилсерото-нин и 5-метоксииндолуксусная кислота) с помощью ион-парной обращенно-фазной хроматографии с детектированием по природной флуоресценции в хлорнокислых экстрактах эпифизов крыс.

Ключевые слова: крыса, эпифиз, метаболиты триптофана, ВЭЖХ.

A sensitive and selective method for simultaneous determination of tryptophan and metabolites of its hydroxylase pathway (serotonin, 5-hydroxyindoleacetic acid, N-acetylserotonin, 5-methoxyindoleacetic acid, and melatoin) by ion-pair reversed-phase chromatography and detection by natural fluorescence was elaborated. Good resolution of all compounds listed in the perchloric extracts of rat pineal gland was achieved.

Key words: rat, pineal gland, tryptophan metabolites, HPLC.

Гидроксилазный путь обмена триптофана является источником синтеза индоламинов, обладающих широким спектром биологического действия. Известно, что уровни этих метаболитов изменяются в зависимости от фазы циркадианного ритма [1]. Метаболизм триптофана в эпифизе крыс изучен детально и включает четыре основных этапа. На первом этапе происходит захват триптофана из кровеносного русла путем активного транспорта в пинеалоциты. Триптофан преобразуется в 5-гидро-кситриптофан митохондриальной триптофангидрок-силазой. Этот этап является скорость-лимитиру-ющим. Активность этого фермента возрастает в темновую фазу в 2 раза. На втором этапе цитоп-лазматическая декарбоксилаза L-ароматических аминокислот катализирует декарбоксилирование 5-гидрокситриптофана в серотонин (5-гидрокситрип-тамин). Содержание серотонина в эпифизе крысы достигает в дневное время максимального значения, снижается в ночное время за счет превращения его в К-ацетилсеротонин на третьем этапе. Возможно альтернативное превращение 5-гидро-кситриптамина по окислительному пути в 5-гидро-ксииндолуксусную кислоту с последующим метилированием до 5-метоксииндолуксусной кислоты, или по восстановительному до 5-гидрокситрипто-фола с последующим его метилированием до 5-метокситриптофола. Не исключается прямое метилирование серотонина с образованием 5-меток-ситриптамина. Третий этап является также важным в регуляции синтеза мелатонина через активность К-ацетилтрансферазы, которая ацетилирует аминогруппу серотонина до К-ацетил-5-гидроксит-риптамина, используя ацетил-КоА как кофактор. Для этого фермента показана циркадианная ритмичность с возрастанием активности в 20-100 раз

в ночное время. На четвертом этапе К-ацетилсе-ротонин превращается в мелатонин (рис.1) при участии цитозольного фермента гидроксииндол-О-метилтрансферазы, использующий в качестве донора метильную группу S-аденозилметионина. Активность этого фермента не подчиняется цир-кадианным изменениям и продукция мелатонина зависит от доступности его предшественника N ацетилсеротонина. После синтеза мелатонин (К ацетил-5-метокситриптамин) путем пассивной диффузии поступает в кровяное русло. Благодаря своей липофильной структуре он проникает через биологические мембраны, где реализует свой эффект [2-7].

Активное изучение интермедиатов обмена триптофана в эпифизе крыс методом ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектирования проводилось в 80-90-х годах [6-11]. Позже, появились работы, посвященные определению только мела-тонина в эпифизах млекопитающих [12-14].

Целью данной работы была отработка метода определения уровней метаболитов гидроксилазного пути обмена триптофана в эпифизе крысы.

Материалы и методы

В работе использовалось семь белых беспородных крыс-самцов массой 150-250 г, которые содержались в течение двух недель при искусственном световом режиме (12/12 ч). Декапитацию проводили спустя два часа после начала темновой фазы. Извлеченные эпифизы помещали в жидкий азот. Гомогенизацию производили тефлоновым пестиком в 100 мкл среды, содержащей 0,1 М хлорную кислоту, 25 мг/л ЭДТА и 1 цМ ванилиновую кислоту (УЛ) (внутренний стандарт). Центрифугировали 15 мин при 13000 g. Супернатанты замораживали и хранили при -40 °С.

nh

TH

HIOMT

naT

-п-CH2CH2

NH NH hi

CO N-acetyl- i serotonin CH3

nh

AAD

-ch2-ch— coo

I 4-

nh3 tryptophan

-ch2-ch— coo 2 i +

5-hydroxytryptophan

HIOMT

—ch2—ch2 -^ h3c(

I 4-

nh3 serotonin

-ch2~ch2

Nh+

MAO

nh

5-methoxytryptamine

-CH2CHO ALR ho

NH

л

melatonin

ch2 h2

nh I

co I

5-hydroxyindole-acetaldehyde

—ch2-coo_ „ ,

HIOMT

nh 5-hydroxyindole-acetic acid

-ch2-coo

HIOMT

-ch2 ch2

oh

h

5-hydroxy-tryptophol

о

-ch2-ch2 oh

о

5-methoxy-tryptophol

5-methoxyindole-acetic acid

Рис. 1. Схема катаболизма триптофана в эпифизе крысы [2-7].

ТН — триптофангдроксилаза, AAD — декарбоксилаза L—ароматических аминокислот, МАО — моноаминооксидаза, МАТ — N — ацетилтрансфераза, НЮМТ — гидроксииндол-О-метилтрансфераза, ALR — альдегидредуктаза.

(G1316A). ^орость потока элюента 0,5 мл/мин. Введение образцов осуществлялось автосамплером (ALS G1313A), объем 20 мкл. Детектирование при длине волны возбуждения 280 нм и испускания 340 нм. Использовали подвижные фазы, содержащие ацетонитрил (16,65-18,67 % об.), октилсульфонат натрия (1,67-2,59 mM), уксусную кислоту (17-85,0 мM), ЭДТА (25 мг/л) и дигидрофосфат калия (0,1 М).

Интегрирование, расчет содержания изучаемых компонентов и спектральный анализ метаболитов триптофана проводили с помощью программы ChemStation версии А.10.01 и ее спектрального модуля.

Уровни 5-гидрокситриптофана определяли, используя подвижную фазу, содержащую 0,1 М дигидрофосфат калия, 17 мМ уксусной кислоты, 25 мг/л ЭДTA, 1 мМ гептилсульфоната натрия, 0,8 мМ октилсульфоната натрия и 11 % метанола (об.).

Для приготовления подвижных фаз использовали химически чистый ацетонитрил (Merck, Германия), КН2РО4, ЭДТА (Reanal, Венгрия), октилсульфонат натрия (Элсико, Россия). В качестве эталонных соединений применяли L-триптофан (Trp), N-ацетил^-триптофан (NAT), триптамина гидрохлорид (TRN), серотонин креатинин-сульфат (5-HT) (Reanal, Венгрия), мелатонин (Mel), 5-гидроксиин-долуксусная кислота (5-HIAA), N-ацетил-серото-нин (NAS) и 5-метоксииндолуксусная кислота (5-MIAA), ванилиновая кислота (VA), триптолин (Trip) (Sigma, США).

Воду для подвижных фаз подвергали тройной дистилляции в стеклянном аппарате с последующим удалением следов органических соединений пропусканием через патрон («Norganic», Millipore, США). Кроме того, для дополнительной очистки буферов, их пропускали через мембранный фильтр с размером пор 0,22 |im. Концентрации эталонных растворов Trp, 5-HT, 5-HIAA, NAS, NAT, TRN, 5-MIAA, Trip и Mel составили 10 мМ. Растворы хранили при -40°С. Методом последовательных разбавлений из эталонных растворов соединений готовили рабочие растворы с концентрацией 10 мкM для Trp, 5-HT, 5-HIAA, NAS и 1 мкЫ для NAT, VA, TRN, 5-MIAA, Trip и Mel, которые хранили при -20°С.

Хроматографический анализ проводился методом обращено-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1100 с детектором флуоресценции (G1321A, Германия). Для определения была использована колонка диаметром 3 мм и длиной 250 мм с наполнителем Separon SGX C18, 8 мкм (Эл-сико, Россия). Разделение проводили при 30°С в термостате для хроматографических колонок

Результаты

При изменении состава элюента коэффициенты емкости триптамина и 5-гидрокситриптамина менялись в большей степени, чем остальных метаболитов. На параметры удерживания наиболее сильно влияли концентрации ион-парного реагента и уксусной кислоты, менее содержание органического модификатора. При изменении рН подвижной фазы наблюдалось изменение в очередности элю-ирования 5-НТ и 5-MIAA (рис. 2-5). Наилучшее разделение исследуемых веществ было получено с использованием подвижной фазы следующего состава: 0,1 М КН2РО4, 17 мМ СН3СООН, 25 мг/л ЭДТА, 1,67 мМ октилсульфонат натрия (рН 3,67) и 18,68 % СН^ (об.).

В этой хроматографической системе мы тестировали разделение метаболитов гидроксилазно-го пути катаболизма триптофана и альтернативной метаболической ветви серотонина с некоторыми минорными метаболитами, такими как триптамин

30 25 20 je 15 10 5 0

1, 67 1, 76 1, 85 1, 94 2, 04 2,13 2, 22 2 , 31 2, 4 2, 5 2, 59 mM, SOS

Рис. 2. Зависимость коэффициента емкости (k') от содержания ион-парного реагента (SOS) для 0,1 М дигидрофосфата калия, 17 мМ CH3COOH и 18.67 % (об.) ацетонитрила

Trp

5HT

NAS

NAT

Trn

5MIAA

Mel

5HIAA

h

h

hc

hc

Рис. 3. Зависимость k' от рН для 0,1 М дигидрофосфата калия, 1,67мМ SOS и 18,67 % (об.) ацетонитрила

30 -

А

25 -20 -15 -10 5

23

25 t, C°

27

Рис. 4. Зависимость коэффициента емкости от температуры для 0,1 М дигидрофосфата калия, 17 мМ CH3COOH, 1,67 mM SOS и 18,67 % (об.) ацетонитрила

Рис. 5. Зависимость k' от содержания уксусной кислоты для 0,1 М дигидрофосфата калия, 1,67 мМ SOS и 18,67 % (об.) ацетонитрила

и N-ацетилсеротонин. Полученные данные свидетельствуют, что Tm и NAT не мешают определению основных интермедиатов, хотя и обнаруживаются в малых количествах в эпифизе крысы.

Разработанный метод был применен для количественной оценки уровней Trp, 5-HT, NAS, 5-HIAA, 5MIAA и Mel в шишковидных железах крыс. Полученные нами цифры были сопоставимы с результатами, полученными другими авторами [8-11]. Результаты, полученные автором [6], отличны от наших по уровням Mel, NAS. Значения этих соединений завышены вследствие возможной интерференции пиков.

На рисунке 6А, Б представлены хроматограм-мы смеси стандартов и экстрактах эпифизов крыс. Результаты количественного анализа представлены в таблице 1.

Рис. 6. Хроматограммы: (л/Всмеси стандартов: 1- Trp, 2-5-HT, 3- 5-HIAA, 4-VA, 5- NAS, 6- NAT, 7- TRN, 8- 5-MIAA, 9- Trip, 10- Mel; (Б-В) экстракта эпифиза крысы (одна и та же хроматограмма в различном масштабе)

Таблица 1. Содержание триптофана и его метаболитов в эпифизах крыс (нмоль/г ткани)

Trp 2,558 ± 0,257

5-HTP 0,082 ± 0,007

5-HT 55,243 ± 14,274

5-HIAA 16,096 ± 1,959

NAS 0,053 ± 0,003

NAT 0,1 ± 0,018

TRN 0,013 ± 0,001

5-MIAA 0,455 ± 0,049

Mel 0,047 ± 0,006

Предел детектирования для мелатонина при соотношении сигнал/шум = 2 составлял 0,65 пмоль на 1 г ткани, что значительно ниже физиологических концентраций индоламинов в эпифизе крысы

[6-7].

Разработанный вариант количественного определения метаболитов триптофана в биологическом материале позволяет проводить анализ в изокра-тическом режиме, что значительно повышает вос-

0

производимость параметров удерживания, кроме этого, обладает достаточной селективностью и чувствительностью методом определения индола-минов, что существенно увеличивает надежность результатов.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о пригодности метода для качественной и количественной оценки состояния гидроксилазно-го пути обмена L-триптофана в биологическом материале при различных экспериментальных условиях.

Литература

1. Boguszewska A., Pasternak K. Melatonin and its biological significance / A. Boguszewska // Pol. Merkuriusz. Lek. - 2004. -№ 101. - P. 523-527.

2. Cardinali D.P. Melatonin. A mammalian pineal hormone / D.P. Cardinali // Endocr. Rev. - 1981. - Vol. 2. - P. 327-346.

3. Reiter R.J. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions / R.J. Reiter // Endocr. Rev. - 1991. -Vol. 12. - P. 151-180.

4. Reiter R.J. Melatonin: the chemical expression of darkness / R.J. Reiter // Mol. Cell Endocrinol. - 1991. - Vol. 79. - P. 153-158.

5. Sugden D. Melatonin biosynthesis in the mammalian pineal gland / D. Sugden // Experientia. - 1989. - Vol. 45. - P. 922-932.

6. Lee Chin J.R. Determination of six indolic compounds, including melatonin, in rat pineal using high-performance liquid chromatography with serial fluorimetric - electrochemical detection / J.R. Lee Chin // J. Chromatogr. - 1990. - Vol. 528. - P. 111-121.

7. Malcolm H., Finlay M., Finlay D. Determination of melatonin and monoamines in rat pineal using, reversed-phase ion-interaction chromatography with fluorescence detection / H. Malcolm // J. Chromatogr. - 1991. - Vol. 554. - P. 93-102.

8. Determination of indoles in human and rat pineal / G.M. Anderson [et al] // J. Chromatogr. -1982. - Vol. 228. - P. 155-163.

9. Wakabayashi H., Shimada K., Aizawa Y. Determination of serotonin and melatonin in rat pineal gland by high-performance liquid chromatography with ultraviolet and fluorometric dual detection / H. Wakabayashi // Chem Pharm Bull. -1985. - Vol. 33, №9. - P. 3875-3880.

10. Wakabayashi H., Shimada K., Aizawa Y. Variation of melatonin and serotonin content in rat pineal gland with sex and oestrous phase difference determined by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection / H. Wakabayashi [et al] // J. Chromatogr. - 1986. - Vol. 381, №1. - P. 21-28.

11. Highly sensitive method for the determination of melatonin by normal-phase high-performance liquid chromatography with fluorometric detection / A.A. Vitale [et al] // J Chromatogr B Biomed Appl. - 1996. - Vol. 681, №2. - P. 381-384.

12. Sensitive determination of melatonin by precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography / . Iinuma [et al] // J. Chromatogr A. - 1999. - Vol. 835, №1-2. - P. 67-72

13. Determination of pineal melatonin by precolumn derivatization reversed-phase high-performance liquid chromatography and its application to the study of circadian rhythm in rats and mice / K. Hamase [et al] // Anal Biochem. - 2000. - Vol. 279, №1. - P. 106-110.

1 4. A sensitive internal standard method for the determination of melatonin in mammals using precolumn oxidation reversed-phase high-performance liquid chromatography / K. Hamase [et al] // J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. - 2004. - Vol. 811, №2. - P. 237-241.

Resume

THE METHOD OF DETERMINATION OF METABOLITES OF TRYPTOPHAN HYDROXYLASE PATHWAY IN RAT PINEAL GLANDS BY ION-PAIR HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH FLUORESCENCE DETECTION M.M. Zolotukhin, Ya.M. Darashenka Grodno State Medical University The method for simultaneous determination of tryptophan, serotonin, 5-hydroxyindoleacetic acid, N-acetylserotonin, 5-methoxyindoleacetic acid, and melatoin by ion-pair reversed-phase separation and detection by natural fluorescence was elaborated. A good resolution of all the above compounds in the pineal gland extracts was achieved. The mobile phase consisted of a 18.67 % (v/v) mixture of acetonitrile and aqueous buffer containing 0.1 M potassium dihydrophosphate, 17 mM acetic acid, 25 mg/l EDTA, 1.67 mM sodium octanesulphonate with pH 3.67. Detection was done by fluorescence (^ex= 280 nm, A,em = 340 nm). The method is applicable for the determination of tryptophan and principal indoleamines in individual rat pineals.

nocmynuna 23.02.07