CC BY
19
УДК 615.322:547.972.2].074(571.15) DOI 10.178l6/pmj35195-101
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ В ХАТЬМЫ ТЮРИНГЕНСКОЙ ТРАВЕ, ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ НА ТЕРРИТОРИИ АЛТАЙСКОГО КРАЯ
Л.М. Федосеева, О.А. Мызникова*
Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул, Россия
QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN LAVATERA THURINGIACA L., GROWING IN ALTAI KRAI TERRITORY
L.M. Fedoseeva, O.A. Myznikova*
Altai State Medical University, Barnaul, Russian Federation
Цель. Определение количественного содержания флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве, произрастающей на территории Алтайского края.
Материалы и методы. Объект исследования - хатьмы тюрингенской трава, заготовленная в разные фазы вегетации на территории Алтайского края. Количественное определение флавоноидов в исследуемом сырье проводили методом дифференциальной спектрофотометрии.
Результаты. Установлено, что максимальное накопление флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве происходит в период бутонизации (1,14 %) и цветения (1,02 %). Сумма флавоноидов в пересчёте на рутин, извлекаемых 70%-ным спиртом этиловым из сырья, заготовленного в разных районах, меняется незначительно и составляет 1,00-1,23 %.
Выводы. Результаты работы свидетельствуют о целесообразности изучения хатьмы тюрингенской в качестве источника флавоноидов.
Ключевые слова. Lavatera thuringiaca L, трава, флавоноиды.
Aim. To determine the quantitative content of flavonoids in Lavatera thuringiaca L., the grass, growing in Altai Krai. Materials and methods. The object of the study: Lavatera thuringiaca L. grass, stored at different phases of vegetation in Altai Krai territory. Quantitative determination of flavonoids in the investigated raw material was fulfilled, using differential spectrophotometry method.
Results. Maximum accumulation of flavonoids in Lavatera thuringiaca L. grass was found to occur in the period of budding (1.14 %) and blossoming (1.02 %). The sum of flavonoids in terms of rutin, extracted with 70 % ethanol from raw material, stored in different regions, is changed insignificantly and makes 1.00-1.23 %. Conclusions. The results of this work testify expediency of studying Lavatera thuringiaca L. as a source of flavonoids.
Key words. Lavatera thuringiaca L, grass, flavonoids.
© Федосеева Л.М., Мызникова О.А., 2018
тел. +7 923 713 44 85
e-mail: [email protected]
[Федосеева Л.М. - доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармации; Мызникова О.А. (контактное лицо) - аспирант кафедры фармации].
Введение
Хатьма тюрингенская (Lavatera thurin-giaca L.) семейства Мальвовые (Malvaceae Juss) - многолетнее травянистое растение, широко распространённое на территории Алтайского края. Комплекс биологически активных соединений (БАС) хатьмы тюрин-генской травы отличается значительным структурным разнообразием и включает полисахариды, фенолокислоты, флавоноиды, конденсированные и гидролизуемые дубильные вещества, кумарины, что свидетельствует о целесообразности изучения и внедрения данного сырья в научную медицину [4-5]. Необходимо сравнить качественный состав и количественное содержание различных групп соединений в хатьмы тюрин-генской траве.
Ранее нами были изучены спиртовое извлечение, эфирная, этилацетатная, бута-нольная фракции хатьмы тюрингенской травы и обнаружены фенолокислоты, фла-воноиды групп флавона, флавонола, катехи-на и другие соединения [5].
Целью данной работы является определение количественного содержания флаво-ноидов в хатьмы тюрингенской траве, произрастающей в Алтайском крае.
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служила хатьмы тюрингенской трава, заготовленная в период бутонизации (июнь), цветения (июль) и плодоношения (август) в 2017 г. Заготовку проводили в семи районах Алтайского края, различающихся по климатическим условиям и уровню техногенной нагрузки: Бийский, Быстроистокский, Калманский, Красногор-
ский, Солтонский, Целинный районы, окрестности города Барнаула.
На первоначальном этапе работы, используя воду очищенную и водно-спиртовые растворы различной концентрации, подбирали экстрагент, извлекающий максимальное количество флавоноидов хатьмы тюрин-генской травы.
Количественное содержание суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве определяли методом дифференциальной спектрофотометрии по методике Государственной фармакопеи (ГФ) XIII издания
(ФС.2.5.0015.15) [1].
Оптическую плотность испытуемых растворов, растворов стандартного образца рутина («Sigma-Aldrich», каталожный номер R5143) измеряли на спектрофотометре «Schimadzu UV-mini 1240» при длине волны 410 нм, что соответствует максимуму поглощения комплексного соединения рутина с алюминия хлоридом.
Содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье определяли в пересчёте на рутин. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с требованиями ГФ XIII издания (ФС.1.1.0013.15) [1].
Валидацию методики количественного определения суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве проводили в соответствии с ОФС.1.1.0012.15. Оценивали такие параметры методики, как специфичность, линейность, правильность, повторяемость (сходимость) [1].
Для определения специфичности готовили спиртовое извлечение хатьмы тюрин-генской травы и раствор стандартного образца рутина. Проводили реакцию комплек-сообразования с алюминия хлоридом. Полученные растворы исследовали методом дифференциальной спектрофотометрии.
Сравнивали спектральные характеристики исследуемого и стандартного образцов.
Для определения линейности в мерные колбы вместимостью 25 мл помещали алик-воты спиртового извлечения хатьмы тюрин-генской травы объёмом 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 мл, прибавляли по 2 мл спиртового раствора 2%-ного алюминия хлорида. Доводили объём раствора 96%-ным спиртом этиловым до метки, перемешивали. Далее поступали так, как описано в ФС.2.5.0015.15.
Экспериментальные данные обрабатывали методом наименьших квадратов. Составляли уравнение регрессии, рассчитывали коэффициент корреляции (г).
Для оценки правильности методики из спиртового извлечения хатьмы тюринген-ской травы готовили разведения трёх уровней: 1 : 1; 1 : 1,5; 1 : 2. Определяли количественное содержание суммы флавоноидов в соответствии с валидируемой методикой. Рассчитывали открываемость (Я, %) и относительное стандартное отклонение (ЯЖ, %).
Повторяемость (сходимость) методики проверяли путём приготовления спиртовых извлечений хатьмы тюрингенской травы из 6 навесок сырья. Определяли количественное содержание суммы флавоноидов в ис-
следуемых образцах в соответствии с тестируемой методикой. Определение проводили в одной лаборатории, в одинаковых условиях, в короткий промежуток времени.
Рассчитывали относительное стандартное отклонение (ЯЖ, %).
Результаты и их обсуждение
В ходе определения оптимального экст-рагента для извлечения флавоноидов хатьмы тюрингенской травы использовали воду очищенную и водно-спиртовые смеси различной концентрации (от 30 до 90 %). Экстракцию проводили трижды по 30 мин, нагревая извлечения с обратным холодильником на кипящей водяной бане. Далее полученные извлечения исследовали методом дифференциальной спектрофотомет-рии. Выход флавоноидов в пересчёте на рутин при экстракции водой очищенной составил 0,59 %. При использовании в качестве экстрагента водно-спиртовых смесей в концентрации от 30 до 90 % установили, что при использовании спирта этилового 70%-ного выход флавоноидов составляет 1,02 % (рис. 1). Данный растворитель применяли для дальнейших исследований.
Рис. 1. Зависимость выхода флавоноидов хатьмы тюрингенской травы от концентрации спирта этилового
При проведении валидации методики количественного определения суммы флавонои-дов хатьмы тюрингенской травы оценивали следующие показатели: специфичность, линейность, правильность, повторяемость.
В ходе определения специфичности снимали дифференциальные спектры продуктов реакции флавоноидов исследуемого сырья и стандартного образца рутина с алюминия хлоридом. Полученные спектры имеют максимумы поглощения при длине волны 410 нм. Другие группы фенольных соединений не дают характерных максимумов в данной области, что свидетельствует о достаточной специфичности методики [2].
Для оценки линейности готовили спиртовое извлечение хатьмы тюрингенской травы, как описано выше. Отбирали аликво-ты извлечения объёмом 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 мл. Определяли количественное содержание суммы флавоноидов в полученных растворах в соответствии с валидируемой методикой.
Строили график зависимости оптической плотности растворов от количественного содержания суммы флавоноидов (рис. 2).
_ 0,16
Уравнение графика имеет следующий вид: у = 0,0932л: + 0,0001. Значение коэффициента корреляции стремится к единице, что свидетельствует о наличии линейной зависимости оптической плотности от концентрации исследуемых растворов в пределах аналитической области методики.
Для оценки правильности методики из спиртового извлечения хатьмы тюрингенской травы готовили разведения, отбирая аликвоты объёмом 1,0; 1,5; 2,0 мл. На каждом уровне концентраций определяли количественное содержание суммы флавоноидов в трёх пробах в соответствии с валидируемой методикой (табл. 1).
Границы открываемости методики находятся в пределах 93,45-99,10 %, относительное стандартное отклонение составляет 1,88 %, что свидетельствует о высокой степени соответствия между значением расчётного и полученного содержания суммы флаво-ноидов в исследуемых образцах.
Оценку повторяемости (сходимости) проводили, измеряя оптическую плотность извлечений хатьмы тюрингенской травы, приготовленных из шести навесок, в соответствии с валидируемой методикой. Результаты представлены в табл. 2.
0,14
2 0,12
0,1
Е 0,08
0,06
1,554 3; 0,1449
3 = 0,0932л г = 0,< + 0,0001 )999 3449; 0,125 4
>г1л 204; 0,1045
260; 0,0864
•07 223; 0,0674
0,1
0,8
1
1,2
1.4
1,6
1,
Содержание суммы флавоноидов (С), % Рис. 2. График зависимости оптической плотности от содержания суммы флавоноидов в извлечении хатьмы тюрингенской травы
Таблица 1
Результаты оценки правильности методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве
№ Разведение Расчётное содержание Полученное содержание Открываемость, Метрологические
п/п модельной смеси суммы флавоноидов, % суммы флавоноидов, % % характеристики
1 1,08 96,43
2 1:1 1,12 1,10 98,21
3 1,07 95,54
1 1,57 93,45 х = 97,24 %,
2 1:1,5 1,68 1,66 98,80 « = 1,83,
3 1,64 97,62 Я5Ю = 1,88 %
1 2,21 98,66
2 1:2 2,24 2,22 99,10
3 2,18 97,32
Таблица 2
Результаты оценки сходимости методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве
Навеска, г Оптическая плотность Содержание суммы флавоноидов в пересчёте на рутин, % Метрологические характеристики
1,0028 0,1012 1,09 Р = 95 %, п = 6, / = 2,57, х ± д х =1,12 ± 0,04 %, 5 = 0,02, е = 2,04 %, Я5Ю = 1,79 % < 3 %
1,0036 0,1068 1,15
1,0043 0,1027 1,10
1,0016 0,1042 1,12
1,0031 0,1056 1,14
1,0012 0,1035 1,12
Из табл. 2 следует, что относительное стандартное отклонение результатов не превышает 3 %. Валидируемая методика удовлетворяет требованиям по сходимости.
Таким образом, методика количественного определения суммы флавоноидов хатьмы тюрингенской травы специфична, имеет линейный характер. Метрологические характеристики параметров, правильность и сходимость не превышают валидационные критерии. Методика пригодна для достижения цели исследования.
Общеизвестно, что содержание БАС зависит от срока заготовки сырья и места произрастания. Следующим этапом работы являлось изучение динамики накопления флавоноидов в зависимости от фенологической фазы.
Максимальное количество флавоноидов отмечено в хатьмы тюрингенской траве в период бутонизации и цветения - 1,02-1,14 %, минимальное - в период плодоношения -0,77 % (табл. 3). Данная закономерность согласуется с информацией о важной роли флавоноидов в процессах роста, развития и размножения растений, а также с рекомендациями по срокам заготовки морфологической группы сырья «Трава» [1-3].
Далее проводили определение содержания суммы флавоноидов в пересчёте на рутин в хатьмы тюрингенской траве, произрастающей в разных районах Алтайского края. Результаты исследований представлены в табл. 3.
Выявлено, что содержание флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве, заготовленной
Таблица 3
Результаты количественного определения суммы флавоноидов в хатьмы тюрингенской траве
Экстрагент Метрологические характеристики, Р = 95 %, п = 5, f = 2,78
x ± д x , % е , %
Вода очищенная 0,59 ± 0,05 0,03 5,36
Спирт этиловый 30%-ный 0,67 ± 0,05 0,03 4,82
Спирт этиловый 40%-ный 0,75 ± 0,06 0,03 4,67
Спирт этиловый 50%-ный 0,76 ± 0,07 0,04 5,66
Спирт этиловый 60%-ный 0,86 ± 0,05 0,03 3,53
Спирт этиловый 70%-ный 1,02 ± 0,07 0,04 3,88
Спирт этиловый 80%-ный 0,91 ± 0,06 0,03 3,83
Спирт этиловый 90%-ный 0,61 ± 0,05 0,03 4,96
Фенологическая фаза Метрологические характеристики, Р = 95 %, п = 5, f = 2,78
x ± д x , % 5 е , %
Бутонизации 1,14 ± 0,06 0,04 3,25
Цветения 1,02 ± 0,07 0,04 3,88
Плодоношения 0,77 ± 0,05 0,03 4,19
Район заготовки сырья Метрологические характеристики, Р = 95 %, п = 5, f = 2,78
x ±д x , % 5 е , %
Бийский 1,02 ± 0,07 0,04 3,88
Быстроистокский 1,22 ± 0,07 0,04 3,50
Калманский 1,23 ± 0,07 0,04 3,28
Красногорский 1,06 ± 0,05 0,03 2,91
Солтонский 1,14 ± 0,05 0,03 2,54
Целинный 1,16 ± 0,05 0,03 2,81
Окрестности Барнаула 1,00 ± 0,04 0,02 2,08
в разных районах Алтайского края в период цветения, меняется незначительно и составляет 1,00-1,23 %.
Таким образом, можно рекомендовать сбор сырья в фазы бутонизации и цветения повсеместно на территории Алтайского края.
Выводы
1. В ходе работы установлено, что максимальное количество флавоноидов в пересчёте на рутин хатьмы тюрингенской травы извлекает спирт этиловый 70%-ный. Данный экстрагент следует использовать при определении количественного содержания суммы флавоноидов исследуемого сырья.
2. Проведена валидация методики количественного определения суммы фла-воноидов в хатьмы тюрингенской траве по показателям: специфичность, линейность, правильность, повторяемость. Доказано, что методика пригодна для исследования.
3. Методом дифференциальной спек-трофотометрии установлено, что наибольшее накопление флавоноидов в хатьмы тю-рингенской траве происходит в фазы бутонизации (1,14 %) и цветения (1,02 %).
4. Сумма флавоноидов в пересчёте на рутин в хатьмы тюрингенской траве, заготовленной в различных местах произрастания, имеет сопоставимые значения и составляет 1,00-1,23 %, что свидетельствует о воз-
можности заготовки сырья на территории разных районов Алтайского края.
Библиографический список
1. Государственная фармакопея Российской Федерации. М. 2015, available at: http://www.femb.ru/feml.
2. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музыч-кина Р.А., Толстиков Г.А Природные фла-воноиды. Новосибирск: Гео 2007; 232.
3. Макаренко О.А., Левицкий А.П. Физиологические функции флавоноидов в растениях. Физиология и биохимия культурных растений 2013; 45 (2): 100-112.
4. Федосеева Л.М., Мъвникова О.А Определение состава БАС хатьмы тюрингенской травы, произрастающей на территории Алтайского края. Актуальные проблемы фармакологии и фармации 2016; 13: 191-197.
5. Федосеева Л.М., Мызникова О.А., Кудрикова Л.Е. Изучение фенольных соединений надземной части хатьмы тюринген-ской, произрастающей на территории Алтайского края. Химия растительного сырья 2017; 2: 107-112.
Материал поступил в редакцию 25.12.2017
