CC BY
40SCIENCES OF EUROPE # 25, (2018) | CHEMICAL SCIENCES
7
CHEMICAL SCIENCES
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИНЕФРИНА ГИДРОХЛОРИДА И ЭПИНЕФРИНА ГИДРОТАТРАТА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ
СПЕКТРОСКОПИИ
Зорькин С.А.
Студент 4-го курса «Национальный исследовательский Мордовский Государственный Университет им. Н.П.Огарева»
QUANTITATIVE DETERMINATION OF EPINEPHRINE HYDROCHLORIDE AND EPINEPHRINE HYDROTETRATE IN DOSAGE FORMS BY MOLECULAR SPECTROSCOPY
Zorkin S.A.
Student of the 4th year of the Ogarev Mordovia State University
АННОТАЦИЯ
Данная статья посвящается количественного определения эпинефрина гидрохлорида и эпинефрина гидротартрата в лекарственных формах методом молекулярной спектроскопии.
В статье описывается: теоретические основы спектроскопии, основной закон светопоглащения, классификация спектрометрических методов, использование УФ спектроскопии в фармацевтическом анализе, стадии спектрофотометрического анализа и способы количественно определения эпинефрина гидрохлорида и эпинефрина гидротатрата в лекарственных формах методом молекулярной спектроскопии.
ABSTRACT
This article is devoted to the quantitative determination of epinephrine hydrochloride and epinephrine hy-drotartrate in dosage forms by molecular spectroscopy.
The article describes: the theoretical basis of spectroscopy, the basic law of light absorption, the classification of spectrometric methods, the use of UV spectroscopy in pharmaceutical analysis, the stage of spectrophotometry analysis and methods for the quantitative determination of epinephrine hydrochloride and epinephrine hydrotrate in drug forms by molecular spectroscopy.
Ключевые слова: эпинефрина гидрохлорида, эпинефрина гидротартрата, количественное определение, молекулярная спектроскопия.
Keywords: epinephrine hydrochloride, epinephrine hydrotartrate, quantitative determination, molecular spectroscopy.
1.Теоретическая основа метода Спектроскопические методы основаны на поглощении электромагнитного излучения растворами или твердыми частицами[1]. Электромагнитное излучение имеет двойственную природу: волновую и корпускулярную:
С = Я XV где С - скорость света в вакууме; Я - длина волны излучения; V - частота колебаний.
В ультрафиолетовой и видимой областях длину волны обычно выражают в нм, а в инфракрасной области - в мкм или волновых числах
Волновое число - это число волн, приходящееся на 1 см длины светового луча:
1
V = X
Испускание и поглощение электромагнитного излучения происходит квантовано: ДЕ = h X V
Электромагнитные волны охватывают гораздо больший диапазон длин волн, чем воспринимает человеческий глаз. Энергия электромагнитного излучения увеличивается с уменьшением длин волн, что и определяет характер взаимодействия электромагнитных волн с исследуемым веществом. В аналитических целях используют УФ, видимый и ИК диапазоны длин волн, поскольку более коротковолновое излучение приведет к разрушению связей в молекулах, а более длинноволновое слабо воздействует на химические связи и не дает информации о строении молекулы. Поглощение в УФ и видимой областях приводит к переходам электронов из основного электронного состояния в возбужденное, а поглощение в ИК области вынуждает связанные атомы колебаться относительно их средних положений. Основные области электромагнитного спектра и причины поглощения излучения в этих областях приведены в таблице 1.
8
8С1Б1ЧСБ8 ОБ ЕиЯОРЕ # 25, (2018) | СИБМ1СЛЬ ВСЧЕЫСЕ
Таблица 1.
Области электромагнитного спектра._
Длина волны, Я 10'3нм 10 нм 400 нм 800 нм 300 мкм 300 мм 200 м
Спектральная область Мягкое рентгеновское излучение Ультрафиолетовая Видимая Инфракрасная Микроволновая Короткие радиоволны
Причина поглощения излучения Переходы внутренних электронов в атомах Переходы валентных электронов Колебательные переходы молекул Вращательные переходы молекул Спиновые переходы ядер и электронов
Наблюдаемый спектр поглощения Электронный спектр ИК спектр ЯМР спектр ЭПР спектр
Энергия, эВ ~ 105 ~ 10 доли эВ ~ 10-3 ~ 10-6
Электроны в молекулах могут располагаться на связывающих, не связывающих и разрыхляющих орбиталях. На связывающих орбиталях располагаются электроны, участвующие в образовании валентных связей (с - и п -электроны), на несвязы-вающих - электроны, не участвующие в образовании химических связей (п-электроны). Расположение электронов на связывающих и несвязывающих орбиталях соответствует основному состоянию молекулы, на разрыхляющих орбиталях - возбужденному состоянию, которое возникает при поглощении молекулой определенного количества энергии. При этом при возбуждении возможен переход электронов с одних орбиталей на другие (рис. 1):
Е
* 4 <
/ ч >
п—> а* п—>яг*
л—>яг*
Рис.1. Переход электронов с одних орбиталей на другие.
Различные электронные переходы требуют неодинаковой энергии, поэтому полосы в спектре поглощения располагаются при разных длинах волн. Наибольшей энергии требует с —> с * переход, связанный с возбуждением внутренних электронов с -связи. Он соответствует поглощению в дальней УФ области. Переход п —> с * связан уже с меньшими затратами энергии, полосы поглощения располагаются в области 200-300 нм. Еще меньшая энергия требуется для п—> п * и п —> п * переходов, которые характерны для молекул с сопряженными связями.
Таким образом, существенными элементами, обуславливающими наличие электронных спектров органических молекул, являются кратная связь и не поделённая электронная пара. Группировки, содержащие в своем составе сопряженные двойные связи
и неподеленные пары электронов, называются хромофорами. На положение максимума поглощения хромофоров могут влиять группы, усиливающие светопоглощение хромофоров - ауксохромы.
При облучении исследуемого вещества электромагнитным излучением с постепенно изменяющейся длиной волны можно проследить изменение интенсивности его поглощения. Графическое изображение этой зависимости называется спектром. Область интенсивного поглощения в нем называется полосой или максимумом поглощения, длина волны, при которой наблюдается максимум поглощения, называется аналитической длиной волны
(^шах)
Поглощение называют характеристическим, если оно вызывается определенной группой атомов, причем характер поглощения относительно мало изменяется с изменением остальной части молекулы. Наличие в спектре характеристических полос поглощения позволяет обнаружить в соединении определенные структурные элементы и сделать вывод о его строении.
Вид спектральной кривой зависит от растворителя, поведения вещества в растворе, наличия в молекуле исследуемого вещества тех или иных заместителей и т.д. Все эти факторы могут вызвать сдвиг Хшах или изменить интенсивность поглощения. Так, если полоса поглощения смещается в более длинноволновую область, то говорят о бато-хромном сдвиге, если смещение происходит в более коротковолновую область - гипсохромном сдвиге. Увеличение интенсивности поглощения называют гиперхромным эффектом, а уменьшение - гипо-хромным эффектом. В инфракрасной области спектра электронных переходов не происходит, но ИК излучение усиливает колебания атомов в молекулах. Поглощение инфракрасного излучения вызывает колебания с изменением либо длин связей (валентные колебания, V), либо углов между связями (деформационные колебания, ^ Валентные колебания могут быть симметричными и антисим-метричными[3] (рис. 2).
8С1Б1ЧСБ8 ОБ ЕиЯОРЕ # 25, (2018) | СИБМ1СЛЬ ВСЧЕЫСБ
9
валентные антисимметричные колебания (У^) Рис. 2. Колебание молекул.
Чем больше атомов в молекулах, тем больше число возможных колебаний, поэтому ИК спектры молекул представляют собой сложный набор различных колебаний, каждое из которых проявляется в узком интервале частот. Многие атомные группы и некоторые связи характеризуются в спектре определенными частотами, мало отличающимися в различных соединениях. Такие частоты называют характеристическими. Для большинства групп и связей в органических молекулах характеристические частоты сведены в справочные таблицы.
1.1. Основной закон светопоглащения
При прохождении света через раствор исследуемого вещества часть его отражается, часть поглощается, часть рассеивается, и часть проходит через вещество:
^0 ^отр + ^рас + ^погл + ^
Интенсивность поглощения раствора характеризуется величиной оптической плотности (Б), представляющей собой десятичный логарифм отношения интенсивности светового Потока, падающего на вещество, к интенсивности светового потока, прошедшего через вещество:
D = lg
{с /
В основе всех спектроскопических методов лежит закон светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера, отражающий прямо пропорциональную зависимость оптической плотности от концентрации раствора и толщины светопоглощающего слоя[2]: В = к * С * I где С - концентрация исследуемого раствора, в % или в моль/л;
l - толщина поглощающего слоя, в см; k - показатель поглощения (молярный или удельный).
Молярный показатель светопоглощения (е) равен оптической плотности одномолярного раствора при толщине поглощающего слоя 1 см.
Удельный показатель светопоглощения (Е^) равен оптической плотности раствора, содержащего 1 г вещества в 100 мл раствора при толщине поглощающего слоя 1 см.
Связь между показателями поглощения можно отразить формулой:
Ю/ М.м.
где М.м. - молярная масса вещества
1.2. Классификация спектрометрических методов
В основу классификации спектрометрических методов положены три основных принципа.
Классификация по диапазону используемых длин волн:
• УФ спектроскопия (200 - 400 нм)
• фотометрия в видимой области (400 - 800
нм)
• ИК спектроскопия (4000 - 400 см"1)
Классификация по способу фиксирования поглощения и используемой аппаратуры:
• визуальные (колориметрия);
• фотоэлектрические.
Классификация по типу излучения, падающего на вещество:
• фотоколориметрический метод - основан на поглощении веществом немонохроматического света (в диапазоне определенного интервала длин волн).
• спектрофотометрический метод - основан на поглощении веществом монохроматического света (определенной длины волны).
2. УФ спектроскопия в фармацевтическом анализе
УФ спектроскопия признана фармакопейным методом с 1968 г. и включена во все современные фармакопеи. Благодаря простоте аналитических операций и, в большинстве случаев, высокой чувствительности, метод нашел широкое применение в фармацевтическом анализе.
Так, УФ спектрофотометрия используется при установлении подлинности, доброкачественности, количественном определении как индивидуальных веществ, так и компонентов лекарственных форм, а также при испытаниях на растворимость и однородность дозирования.
2.1. Стадии спектрофотометрического анализа
Фотометрический анализ включает ряд стадий:
• подготовку анализируемого образца;
• приготовление одного или нескольких растворов стандартного образца;
е = Е
10
1см
10
SCIENCES OF EUROPE # 25, (2018) | CHEMICAL SCIENCES
• выбор рабочего светофильтра получение электронного спектра;
• выбор рабочей кюветы (толщины поглощающего слоя);
• определение области концентраций веществ, в которой наблюдается подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера;
• измерение оптической плотности анализируемого раствора и растворов стандартного образца;
• расчет содержания определяемого вещества и заключение о его качестве в соответствии с требованиями НД.
2.2. Испытание на подлинность и доброкачественность
При использовании УФ спектроскопии на данных стадиях фармацевтического анализа находят применение следующие приемы:
• нахождение в спектре Хшах и Хщп, характеризующих области максимального и минимального поглощения;
• определение отношения оптических плотностей при различных длинах волн;
• расчет и сравнение удельного показателя поглощения с приведенным в нормативной документации;
• сравнение УФ спектра анализируемого вещества со спектром стандартного образца этого же вещества (или со спектром, приведенным в НД).
Во всех случаях необходимо получить УФ спектр в условиях, приведенных в НД - растворитель, концентрация, интервал длин волн, толщина кюветы.
Некоторые испытания на подлинность с использованием УФ спектрофотометрии требуют применения стандартных образцов лекарственных веществ. В этом случае проба стандартного образца должна быть приготовлена и одновременно определена в тех же условиях, что и испытуемое вещество.
При испытании на доброкачественность используют те же характеристики, что и при идентификации. При наличии примесей может изменяться Хшах, появляться дополнительные максимумы, изменяться интенсивность поглощения.
Специфические примеси, присутствующие в лекарственных веществах, как правило, имеют близкое химическое строение с исследуемым веществом, поэтому и максимумы поглощения их близки, что затрудняет идентификацию примесей. Наиболее удобно использовать данный метод, когда лекарственное вещество и его специфическая примесь поглощают при разных длинах волн.
2.3. Количественное определение
Принцип количественного определения методом УФ спектрофотомерии сводится к следующему: навеску анализируемого вещества растворяют в подходящем растворителе, дополнительно готовят разведение полученного раствора и измеряют оптическую плотность в условиях, указанных в методике[4]. Воспользуемся не фармакопейным методом количественного определения
эпинефрина гидрохлорида и гидротартрата в лекарственных формах. УФ-спектрофотометрия предлагает определение в максимуме светопоглащения 279 нм [5]. Концентрацию анализируемого вещества можно рассчитать несколькими способами.
2.3.1.Сравнение оптической плотности раствора испытуемого вещества с оптической плотностью стандартного раствора.
Современные нормативные документы часто включают расчеты количественного содержания анализируемого вещества с использованием стандартных образцов. Стандартные образцы - это дополнительно очищенные вещества, которые используются как эталонные при проведении анализа физико-химическими и физическими методами.
Государственные стандартные образцы (ГСО) выпускаются в соответствии со специальными требованиями, на них имеются специальные фармакопейные статьи. При расчете количественного содержания стандартный образец принимается за 100%.
Рабочие стандартные образцы (РСО) представляют собой образцы серийных лекарственных веществ, соответствующие требованиям фармакопейных статей на эти вещества. При расчете количественного содержания определяемого вещества в лекарственной форме учитывают фактическое содержание данного вещества в РСО.
Стандартные образцы веществ-свидетелей (СОВС) используют для определения примесей или компонентного состава лекарственных форм. В качестве СОВС могут быть использованы ГСО, РСО, а также вещества, специально изготовленные и аттестованные в порядке, предусмотренном частной фармакопейной статьей.
В этом случае готовят один раствор стандартного образца анализируемого вещества (ГСО или РСО) с концентрацией, близкой к концентрации этого вещества в анализируемой пробе. Из закона Бугера-Ламберта-Бера следует:
De
Dx „ _ Ост * D х ~С х~ D
Данный способ достаточно часто используется в фармацевтическом анализе. Он является наиболее точным, поскольку измерение оптической плотности анализируемого и стандартного образцов осуществляются в одно и то же время на одном приборе. По этой причине он включен во многие нормативные документы. Единственным ограничением данного способа является высокая стоимость некоторых стандартных образцов и сложности с их приобретением.
Расчет количественного содержания вещества проводят по формуле:
С * П *У, *У
^ _ ^ст ^х "к '
О * V * а где V - объем колбы (разведение), мл; Уп- объем пипетки (взятая навеска из разведения), мл;
а - объем вещества, взятого для анализа, мл; V - объем жидкой лекарственной формы, мл.
БСШЖЕБ ОБ ЕиЯОРЕ # 25, (2018) | СИЕМТСЛЬ вСЧЕЫСЕ
11
2.3.2. Расчет концентрации по величинам удельного или молярного коэффициента поглощения.
В этом случае концентрацию вещества в анализируемом растворе рассчитывают, исходя из экспериментального значения оптической плотности и величины удельного или молярного коэффициента светопоглощения, взятого из НД или справочных руководств. Данный вариант расчета используется крайне редко, как правило, лишь в тех случаях, когда недоступен стандартный образец. Это связано с высокой погрешностью расчетов, поскольку измерение оптической плотности испытуемого и стандартного растворов проводится в разное время и на разных приборах.
Расчет количественного содержания вещества в данном случае проводят по формулам:
О* * ^ О. * Кь * М. м.* 100
^ Л ^ ^ Л к
= Е^м * г * Кп * а = £*Т*кП*а
2.3.3. Расчет концентрации по градуировоч-ному графику.
При использовании данного способа готовят серию растворов (5-10) стандартного образца исследуемого вещества с постоянно возрастающей концентрацией, добавляя при необходимости реагент для получения окрашенного соединения. Для каждого раствора измеряют оптическую плотность при определенном светофильтре или длине волны относительно раствора сравнения.
По полученным данным строят график Б = /(С) (рис. 3). Затем измеряют оптическую плотность исследуемого раствора (Ох) и по графику находят соответствующее значение концентрации.
Калибровочный график удобно использовать при проведении серийных анализов. Калибровочный график строят для каждого прибора, его периодически перепроверяют. Недостатком данного способа является достаточно большая погрешность, возникающая от приготовления и измерения оптической плотности серии растворов.
Расчет концентрации вещества в препарате или лекарственной форме при использовании метода градуировочного графика проводят по формуле:
Сж * V * 100
х = —-
а
Литература
1. Государственная фармакопея российской федерации / «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008.
- с.57.
2. Спектрофотометрический анализ в органической химии. / И.Я. Бернштейн, Ю.Л. Каминский.
- Л.: Химия,1975. - с.5.
3. Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М., Теория поля, 7 изд., М., 1988; Горелик Г. С., Колебания и волны,
2 изд., М., 1959; Крауфорд Ф., Волны, пер. с англ.,
3 изд., М., 1984.
4. 0ФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»
5. Фармацевтическая химия: учебн. пособие: в 2ч. / В.Г.Беликов. - 3-е изд. - М.: МЕДпресс-ин-форм, 2009. - с.279.
с» с
Рис. 3. Градуировочный график.
