CC BY
330
УДК 543.867:543.544
УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ - ПРОИЗВОДНЫХ ОЛЕАНОЛОВОЙ КИСЛОТЫ
© Н.В. Мироненко , Т.А. Брежнева, В.Ф. Селеменев
Воронежский государственный университет, Университетская пл., 1,
Воронеж, 394006 (Россия), e-mail: natashamir@yandex.ru
Показана возможность определения содержания суммы тритерпеновых сапонинов прямым спектрофотометрическим методом при Х=210 нм с использованием в качестве стандартного образца их агликона - олеаноловой кислоты. Проведен расчет соответствующих метрологических характеристик разработанной методики. Показана возможность ее применения для определения тритерпеновых сапонинов в лекарственном препарате - таблетках «Сапарал» и в растительном материале (корнеплодах сахарной свеклы).
Ключевые слова: тритерпеновые сапонины, олеаноловая кислота, УФ-спектрофотометрия.
Введение
Природные соединения гликозидного характера - тритерпеновые сапонины - являются основными компонентами многих лекарственных средств, число которых на фармрынке постоянно увеличивается. Контроль качества таких лекарственных препаратов в настоящее время затруднен в связи с отсутствием приемлемых методик количественного определения тритерпеновых сапонинов в растительном сырье и производимой из него продукции, а также отсутствием стандартных образцов этих веществ. Анализ осложняется специфическими физико-химическими свойствами сапонинов, в частности склонностью к коллоидообразованию и коньюгированию с липидными соединениями растительного материала. Определение гликозидов затрудняется также тем, что в состав растительного сырья и получаемых из него фитопрепаратов входит, как правило, не индивидуальное вещество, а сумма близких по структуре тритерпеновых сапонинов, имеющих общий агликон и отличающихся только числом сахарных остатков (рис. 1).
Поскольку основные методы определения содержания тритерпеновых сапонинов основаны на физико-химических свойствах их агликонов - наиболее реакционно-способной составляющей молекул, определяющей их биологическую активность, рациональным было бы использовать именно агликоны в качестве стандартных образцов при разработке методик количественного определения сапонинов. Подобный подход широко используется для решения задач практического анализа различных природных объектов сложного состава. Методики количественного определения сапонинов через их агликон введены в НД на лекарственное растительное сырье аралии маньчжурской [1], на фитопрепараты, получаемые из этого вида сырья [2]. Агликон определяют титриметрически после гидролиза сапонинов анализируемого объекта, что делает методики длительными и трудоемкими. В обзоре [3] обсуждена возможность прямого УФ-спектрофотометрического определения некоторых тритерпеновых сапонинов, имеющих в структуре агли-конов тризамещенные непредельные связи. Подобный структурный фрагмент присутствует в агликоне сапонинов - производных олеаноловой кислоты в положении 12, 13, что предполагает возможность применения метода УФ-спектрофотометрии для определения этих веществ в растворах.
В настоящей работе была исследована возможность прямого количественного УФ-спектрофотометрического определения ряда тритерпеновых сапонинов с использованием в качестве стандартного образца их агликона - олеаноловой кислоты. Были подобраны оптимальные условия проведения спектрофотометрического анализа, показана возможность использования методики для определения сапонинов в лекарственном препарате и растительном сырье.
* Автор, с которым следует вести переписку.
н
Рис. 1. Структурная формула одного из сапонинов свеклы 3-О[Р-Э-глюкопиранозил (1-2)-ф-Б-ксило-пиранозил-(1-3))-р-Э-глюкуронопиранозил-3р-окси-олеан-12-ен-28-оевой] кислоты
Экспериментальная часть
В работе использовали образец сапонинов сахарной свеклы, предоставленный фирмой «Вектон», содержащий, по данным поставщика, 92% основного вещества. Точное содержание тритерпеновых сапонинов в предоставленном образце (91,77%) определяли путем проведения гидролиза сапонинов с последующим титрованием полученного в результате гидролиза агликона - олеаноловой кислоты в среде неводного растворителя.
По данным литературы, при выделении сапонинов из корнеплодов сахарной свеклы получаются суммарные образцы, содержащие три индивидуальных сапонина, агликоном которых является олеаноловая кислота (рис. 1) [3]. Для получения дополнительных сведений об используемом образце было проведено его хроматографическое исследование в тонком слое сорбента в системе н-бутанол - вода - уксусная кислота в соотношении 4 : 5 : 1. В качестве проявителя использовали 20%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты в 95%-ном этаноле. На полученных хроматограммах были обнаружены три зоны малинового цвета со значениями И=0,35; 0,55; 0,78, соответствующие трем индивидуальным сапонинам, входящим в состав суммарного образца.
При проведении УФ-спектрофотометрического определения в качестве стандартного образца использовали агликон сапонинов - олеаноловую кислоту, полученную по методике [4] и содержащую 98,2% основного вещества. Количественное определение содержания олеаноловой кислоты в полученном образце проводили методом потенциометрического титрования в среде 95%-ного этилового спирта [5]. Контроль чистоты (примесей сапонинов) осуществляли методом ТСХ в системах растворителей: петролейный эфир - хлороформ - ацетон 20 : 20 : 5 (I), н-бутанол - этанол - аммиак 7 : 2 : 5 (II). Проявитель - 20%-ный раствор фосфорновольфрамовой кислоты. На полученных хроматограммах обнаруживалось одно пятно ярко-малинового цвета со значениями Я^Г) = 0,62, Я^И) = 0,81, соответствующее олеаноловой кислоте. В ИК-спектре полученного образца олеаноловой кислоты отсутствуют полосы поглощения в диапазоне частот 1120-1040 см-1, отнесенные к валентным колебаниям эфирной и гидроксильной групп С-О-, свойственных для глюкопираноз, входящих в состав углеводной части исходных молекул сапонинов. Отдельная полоса поглощения в области 1726 см-1, присущая сложноэфирной группировке (глюкуронозидной связи), в спектре олеаноловой полосы также отсутствует. Определяли температуру плавления (растворитель - этанол) и удельное вращение (растворитель - хлороформ) полученного образца агликона сапонинов, значения которых составили 301° и +79°. Корреляция полученных результатов с литературными данными позволяет отнести олеаноловую кислоту к разряду стандартных образцов и использовать ее при разработке методики определения тритерпеновых сапонинов.
Спектрофотометрические измерения проводили с использованием спектрофотометра СФ-46. Готовили раствор сапонинов с концентрацией 0,1 мл/мл (с различными соотношениями аммиачный буфер - вода) для снятия спектра поглощения в диапазоне длин волн 180-260 нм. Исходные растворы олеаноловой кислоты готовили растворением точной навески образцов с последующим приготовлением серии рабочих растворов
путем разбавления исходных до нужной концентрации аммиачным буфером исходя из соотношения водная фаза - буфер 1 : 1. Рабочий диапазон концентраций олеаноловой кислоты составил 0,01-0,4 мг/мл. В качестве раствора сравнения использовали смесь дистиллированная вода - аммиачный буфер (1 : 1).
Апробацию методики осуществляли на таблетках «Сапарал», содержащих около 0,04 г тритерпено-вых сапонинов в одной таблетке (точное их содержание предварительно определяли титриметрическим методом после гидролиза по стандартной методике [2]). УФ-спектрофотометрическая методика была также применена для количественного определения сапонинов в корнеплодах сахарной свеклы. Содержание сапонинов предварительно определяли фотоколориметрическим методом, описанным в [6].
Обсуждение результатов
Авторы [7] отмечают, что область поглощения соединений, содержащих двойные связи, а также кислородсодержащие углеводные циклы и сопряженные с ними карбоксильные группы, должна находиться за пределом рабочего диапазона обычных спектрофотометров (165-200 нм). Как было установлено экспериментально, полоса поглощения растворов исследуемых сапонинов в водных и водно-спиртовых растворителях располагается при X =198-200 нм, в области, малопригодной для количественного анализа.
Для соединений, имеющих в структуре молекул гетероатомы, связанные кратной связью, смещение максимума поглощения в длинноволновую область спектра возможно при изменении рН среды [7]. Поскольку в структуре молекул изучаемых сапонинов присутствовали карбоксильные группы, оптимальных результатов можно было достичь, обеспечив щелочную реакцию среды растворителя. Данную задачу решали добавлением к растворам сапонинов и олеаноловой кислоты аммиачного буфера с рН=10, в котором исследуемые вещества переходили в солевую (аммонийную) форму. Предварительные эксперименты по определению оптимального соотношения аммиачного буфера и раствора сапонинов (рис. 2) позволили добиться батохромного смещения максимума поглощения от 199 до 210 нм при соотношениях раствора сапонинов и аммиачного буфера 1 : 1. Поскольку дальнейшее увеличение содержания аммиачного буфера в пробах не приводило к смещению максимума поглощения в длинноволновую область, как оптимальное было выбрано соотношение 1 : 1, позволяющее получить стабильный по положению в спектре и интенсивности максимум поглощения при Х=210 нм.
В аналогичных условиях (соотношение анализируемый раствор - буфер 1 : 1) нами был снят спектр раствора агликона изучаемых сапонинов - олеаноловой кислоты и установлено, что максимум поглощения агликона находится также при Х= 210 нм (рис. 3).
Наличие общего, стабильного в подобранных условиях максимума поглощения в УФ-спектрах сапонинов и их агликона указывает на то, что за светопоглощение в данной области спектра отвечает только агликон сапонинов, сахара в ней оптически прозрачны. Количественное суммарное содержание сапонинов в этом случае может быть определено в пересчете на их общий агликон.
В вышеприведенных условиях была получена градуировочная зависимость, построенная на основании результатов измерения оптической плотности стандартных растворов олеаноловой кислоты и описываемая уравнением А = 11,916-С - 0,0101, где А - оптическая плотность, С - концентрация, мг/ см3.
На первом этапе проверяли значимость коэффициента Ь градуировочной функции. По результатам расчетов коэффициент Ь = 0,0101 не значим, следовательно инструментальные и экспериментальные шумы, равно как и другие случайные влияния, не вносят ощутимого эффекта в сигнал.
Однородные значения стандартного отклонения результатов измерений каждой концентрации позволили рассчитать остаточное стандартное отклонение и оценить адекватность градуировочной модели путем сравнения дисперсии адекватности и дисперсии воспроизводимости по критерию Фишера. Различие не значимо, что подтверждает, что выбранная модель адекватна [8]. Приложение принципа распространения погрешностей позволило оценить влияние дисперсии значений Б на величины а и Ь и рассчитать дисперсии констант. Полученные значения предполагают существование доверительного интервала для коэффициента а, на основании которого строили регрессионную полосу (коридор) для градуировочной кривой методики (рис. 4). Для оценки качества аналитической модели вычисляли метрологические характеристики, значения которых приведены в таблице.
Рис. 2. УФ-спектры растворов сапонинов с аммиачным буфером в соотношениях: исходный раствор; 10 : 1; 2 : 1; 1 : 1, 1 : 2 соответственно, С (концентрация) сапонинов - 0,1 мг/мл
Рис. 3. УФ-спектр раствора олеаноловой кислоты, С - 0,09 мг/мл
Рис. 4. Градуировочная кривая зависимости оптической плотности растворов олеаноловой кислоты от концентрации с полосами регрессии
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов
Время анализа, ч Метрологические характеристики
8 8С103 г а Предел обнаружения сапонинов, мг/см3 Рабочий диапазон концентрации сапонинов, мг/ см3
1,0 0,020 0,017 1,5 0,99 11,92 0,010 0,02-0,20
Условные обозначения: Б - стандартное отклонение результатов (дисперсия воспроизводимости), мг/мл; Бу - остаточное стандартное отклонение (дисперсия адекватности), мг/мл; Бс - стандартное отклонение методики 8с=8у/а, мг/мл; г - коэффициент корреляции; а - коэффициент чувствительности, усл.ед. (опт. пл-ть)/ (мг/мл).
Узкий диапазон регрессионной полосы, относительно малое значение стандартного отклонения методики, максимальный коэффициент корреляции свидетельствуют о высокой точности и правильности полученных результатов анализа сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту. Полученные результаты
подтверждают целесообразность использования стандартного образца - агликона в практике анализа сапонинов, что позволяет повысить точность и надежность соответствующего метода анализа.
Методика была апробирована для определения содержания сапонинов - производных олеаноловой кислоты в стандартизованном лекарственном средстве - таблетках «Сапарал» (действующее начало - сумма сапонинов аралии маньчжурской), содержащих 0,036-0,044 г действующего вещества в одной таблетке. Навеску растертых таблеток растворяли в смеси аммиачный буфер - вода 1 : 1 и спектрофотометрировали при Х=210 нм. Результат, полученный в пересчете на агликон, далее пересчитывали на содержание сапонинов, используя значение их средней молярной массы, приведенной в фармакопейной методике [2], в итоге получили содержание сапонинов - 0,039 г в одной таблетке. Ошибка определения сапонинов этим методом составила ±3%, что укладывается в указанный в НД диапазон содержаний (0,036-0,044 г в одной таблетке, относительная погрешность ±10%). Таким образом, разработанная нами методика не уступает фармакопейной, давая одновременно выигрыш во времени анализа около 5 ч, поскольку позволяет исключить стадию гидролиза сапонинов препарата.
При помощи предлагаемой методики было проведено определение сапонинов в растительном сырье - корнеплодах сахарной свеклы. Сапонины предварительно извлекали из навески растительного материала исчерпывающей экстракцией смесью этанол - ацетон 1 : 4 (контроль полноты извлечения проводили методом ТСХ в условиях, описанных выше) с последующим переосаждением в десятикратном по отношению к объему полученного извлечения объеме воды, подкисленной НС1 до рН=1,0. Осадок сапонинов отфильтровывали, подсушивали, растворяли в смеси аммиачный буфер - вода (1 : 1) и спектрофотометрировали в вышеприведенных условиях. Относительную погрешность определения рассчитывали, повторяя анализ с добавкой точных навесок стандарта - олеаноловой кислоты (добавку вводили на стадии очистки извлечения при переосаждении в подкисленной воде, чтобы исключить возможность фонового влияния соэкстра-гируемых с сапонинами соединений). Относительная ошибка определения в случае анализа растительного сырья составила 6%, что является приемлемым для анализа столь сложного объекта. Результат определения сапонинов в корнеплодах по предлагаемой методике (0,26%) оказался вполне сопоставимым с результатом, полученным альтернативной методикой (0,24%) [6], анализ по которой занимает около 30 ч. Выигрыш во времени составил около 23 ч.
Результаты определения тритерпеновых сапонинов - производных олеаноловой кислоты в вышеописанных объектах различной степени чистоты с применением разработанной УФ-спектрофото-метрической методики позволяют прогнозировать возможность ее применения и для других видов растительного сырья и получаемых из него фитопрепаратов.
Выводы
Определены оптимальные условия получения стабильного по положению в спектре и интенсивности максимума поглощения при Х=210 нм тритерпеновых сапонинов и олеаноловой кислоты (соотношение аммиачный буфер - исследуемый раствор 1 : 1). В установленных условиях построена градуировочная зависимость оптической плотности растворов олеаноловой кислоты от концентрации, проведен расчет метрологических характеристик. Проведена апробация методики на растительном материале (корнеплодах сахарной свеклы) и таблетках «Сапарал». Относительные ошибки анализа составили 6 и 3% соответственно.
Список литературы
1. Аралии настойка. Фармакопейная статья предприятия 42-0358349402.
2. Таблетки «Сапарал». Фармакопейная статья 42-1755-81.
3. Деканосидзе Г.Б., Чирва В.Я., Сергиенко Т.В. и др. Исследования тритерпеновых гликозидов. Тбилиси, 1982. 152 с.
4. Патент 2258709 РФ. Способ получения олеаноловой кислоты / Брежнева Т. А., Сливкин А.И. 2005.
5. Государственная фармакопея. 11-е изд. М., 1989. Вып. 2. 400 с.
6. Нагорная В.А., Жижина Р.Т., Карташов А.К. Определение сапонина в продуктах сахарного производства // Сахарная промышленность. М., 1966. №8. С. 39-43.
7. Казицына Л.А, Куплетская Н.Б. Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии. М., 1971. 264 с.
8. Аналитическая химия. Проблемы и подходы / под ред. Р. Кельнера и др.: в 2-х т. М., 2004. С. 467-470.
Поступило в редакцию 17 сентября 2010 г.
