Изучение тритерпеновых сапонинов травы тысячелистника широколопастного Achillea latiloba Ledeb Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.322.582.998.1].07:547.466+546

ИЗУЧЕНИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ ТРАВЫ ТЫСЯЧЕЛИСТНИКА ШИРОКОЛОПАСТНОГО ACHILLEA LATILOBA LEDEB

© 2006 г. М.П. Глушко

Thriterpene saponines were found in Achillea latiloba Ledeb. herb with the qualitative reactions and thin layer chromatography. Existence of oleanolic acid was identified and absence of ursolic acid was registered in Achillea latiloba Ledeb. herb using HELC-analysis. Quantitative containing of triterpene saponine sum was found with gravimetry, UV-spectroscopy and HELC methods, which appears to be near 1,2 % in recalculation to air-dry raw material.

Тритерпеновые сапонины широко распространены в природе. Изучение химии природных сапонинов представляет большой интерес в связи с широким спектром их фармакологической активности. Применяются как стимулирующие и тонизирующие средства, оказывают противовоспалительное, регулирующее водно-солевой обмен, антиаллергическое, отхаркивающее, седативное, мочегонное и слабительное действия. В растениях обычно содержится несколько близких по строению и свойствам гликози-дов, разделение и идентификация которых представляет собой сложную задачу. В настоящей работе отражены основные аспекты проведённого исследования по выявлению, количественному определению и идентификации тритерпеновых сапонинов надземной части тысячелистника широколопастного (Achillea latiloba Ledeb.).

Изучение проводили следующими методами: качественные реакции, хроматография в тонком слое сорбента, гравиметрический метод, УФ-спектрофотометрия и ВЭЖХ-анализ. Качественные реакции проводили по стандартным методикам [1]. Пробоподготовку для хроматографического исследования - по стандартной методике В.С. Сироткина [2]. Хромато-графирование осуществляли до и после гидролиза в следующих системах растворителей: хлороформ - метиловый спирт (8:2) и хлороформ - этиловый спирт (9,5:0,5). Хроматограммы проявляли специфическими реагентами (фосфорновольфрамовая и фосфорномолибденовая кислоты). Хро-матографические пластинки нагревали в термостате при 100-105 °С в течение 3-5 мин и просматривали в видимом свете. Сравнение проводилось с достоверными образцами веществ-свидетелей олеаноловой и урсоловой кислот. При сопоставлении значений Rf зон адсорбции веществ-свидетелей и полученных зон адсорбции исследуемого извлечения установлено наличие тритерпеновых сапонинов в траве тысячелистника широколопастного (табл. 1).

Количественное определение тритерпеновых сапонинов проводили различными методами. Выделение суммы сапонинов для гравиметрического определения проводили по известной методике В.С. Сироткина [2].

Как известно, гравиметрический метод имеет большую ошибку определения по сравнению с методом спектрофотометрии, поэтому в анализе мы опирались также на известные работы отечественных и зарубежных учёных по спектрофотометрическому определению тритерпеноидов, основанному на реакции с серной кислотой [3, 4].

Таблица 1

Результаты хроматографической подвижности суммы сапонинов, полученной из тысячелистника широколопастного и стандартных образцов олеаноловой и урсоловой кислот

Зона адсорбции Rf 10%-й раствор фосфорновольфрамовой кислоты 10%-й раствор фосфорномолибденовой кислоты

1 I)0,69-0,70; II)0,64-0,66 Синяя Розово-фиолетовая

2 I)0,68-0,69; II)0,63-0,65 Синяя Розово-фиолетовая

3 I)0,68-0,69; II)0,63-0,65 Синяя Розово-фиолетовая

Примечание. - показатель хроматографической подвижности исследованных образцов; 1 - зона адсорбции, образующаяся при хроматографировании суммы тритерпеновых сапонинов; 2 - зона адсорбции стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС) олеаноловой кислоты; 3 - зона адсорбции СОВС урсоловой кислоты.

Удельный показатель поглощения олеаноловой кислоты определяли по следующей методике: 20 мг олеаноловой кислоты (точная навеска) количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл концентрированной серной кислоты и термостатировали 1 ч при 80 °С. После охлаждения раствор в мерной колбе доводили до метки кон -центрированной серной кислоты. Из полученного исходного раствора брали по 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл и из них готовили новые разведения до объёма 10 мл. Затем измеряли оптическую плотность разведений относительно серной кислоты при X = 310 нм.

Точную навеску измельченного сырья (травы) помещали в колбу с обратным холодильником и заливали 200 мл смеси: метиловый спирт - этиловый спирт (1:1). Сумму сапонинов трижды экстрагировали в течение 3 ч нагреванием колбы на водяной бане. Экстрагент удаляли, остаток растворяли в смеси ледяной уксусной кислоты и 30%-й серной кислоты. Реакционную смесь нагревали в течение 30 мин при 120 °С. Охлажденную смесь с выделившимся осадком фильтровали на стеклянном фильтре № 3 и промывали водой до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумаге. После этого осадок растворяли при нагревании в 50 мл спирта этилового, разбавляли водным раствором щелочи (0,4 г гидроксида натрия в 6 мл воды), быстро фильтровали через бумажный фильтр и подкисляли соляной кислотой (3-5 мл). К выпавшему осадку добавляли 4 объема во-

ды, фильтровали на стеклянном фильтре № 3, промывали водой до нейтральной реакции по универсальному индикатору и сушили при 110— 120 °С до постоянного веса. Точную навеску осадка (около 0,06 г) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и растворяли в 0,1 М растворе гидроксида натрия. Объем колбы доводили до метки тем же растворителем. Затем 1 мл полученного раствора экстрагировали в делительной воронке 5 мл хлороформа. Хлороформ отгоняли на водяной бане, а остаток высушивали в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С в течение 2 ч. После этого сухой остаток помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и растворяли в кислоте серной концентрированной, доводили ею же до метки. Полученный раствор термостатировали в течение 2 ч при температуре 70 °С, а затем фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 316 нм относительно концентрированной серной кислоты.

т} , „ D • 25 • 25-100

Расчет проводили по формуле: X = ---, где D - значение

E{% • а • (100 - W)

оптической плотности исследуемого раствора; Е|с% - удельный показатель поглощения урсоловой кислоты в концентрированной серной кислоте; a -навеска выделенной суммы сапонинов; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

В связи с тем, что идентификация агликона сапонина всеми вышеперечисленными методами невозможна, нами был проведен ВЭЖХ-анализ суммы тритерпеновых сапонинов, выделенных из травы тысячелистника широколопастного. В качестве веществ-свидетелей использовали стандартные образцы (РСО) олеаноловой и урсоловой кислот. Исследования проводились на приборе «Миллихром АО2». Условия хроматографирова-ния следующие. В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка «Ultrasphere ODS» 28709 размером 2,0 х 75 мм, размер частиц - 6 мкм. В качестве подвижной фазы использовались А - 0,1 % ТФУ и Б - ацетонитрил. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента - 100 мкл/мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS при длине волны от 220 до 280 нм.

Для исследования траву тысячелистника широколопастного измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (ГОСТ 214-83). Точную навеску сырья около 8 г обезжиривали в аппарате Сокслета петролейным эфиром (кипящем при температуре 4070 °С), затем сырьё высушивали, переносили в колбу на 250 мл, экстрагировали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 3-кратно 70%-м спиртом этиловым в количестве 100, 50 и 50 мл. Время каждой стадии составляло 3 ч. Извлечения объединяли, сгущали под вакуумом и выпаривали досуха. Сухой остаток гидролизовали 10 мл смеси 30%-й кислоты серной и ледяной уксусной в течение 1 ч на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Гидролизат охлаждали, добавляли воду очи-

щенную в соотношении 1:5 и оставляли на 12 ч, затем обрабатывали в делительной воронке пятикратно по 5 мл хлороформа. Хлороформную фракцию переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки. Полученный раствор подвергали ВЭЖХ-анализу.

Методом ВЭЖХ было определено наличие олеаноловой и отсутствие урсоловой кислот, а также определено количественное содержание. Результаты гравиметрического, спектрофотометрического и ВЭЖХ-анализов приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты определения количественного содержания суммы тритерпеновых сапонинов в траве тысячелистника широколопастного в пересчёте на воздушно-сухое сырьё

Результат обнаружения Метод определения

Гравиметрия УФ-спектрофотометрия ВЭЖХ

Сумма тритерпеновых сапонинов 1,31±0,09 1,45±0,07 0,98±0,02

Все полученные результаты подвергались статистической обработке согласно рекомендациям Государственной фармакопее XI издания [5].

Выводы

1. Методом качественных реакций и хроматографирования в тонком слое сорбента обнаружено наличие в траве тысячелистника широколопастного тритерпеновых сапонинов.

2. Методом ВЭЖХ-анализа в траве тысячелистника идентифицирована олеаноловая кислота и зарегистрировано отсутствие урсоловой кислоты.

3. Методом гравиметрии, УФ-спектрофотометрии и методом ВЭЖХ определено количественное содержание суммы тритерпеновых сапонинов, которая составляет в среднем около 1,2 % в пересчёте на воздушно-сухое сырьё.

Литература

1. Лекарственное растительное сырьё. Фармакогнозия: Учеб. пособие / Под ред. Г.П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. СПб., 2004. С. 262-282.

2. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. В.С. Сироткина. Томск, 1987.

3. Заркуа Т.Г. и др. // Современные аспекты изучения лекарственных растений: Сб. науч. тр. ВНИИФ. М., 1995. Т. 34. С. 177-180.

4. Савина А.А. и др. // Химия природ. соединений. 1986. № 3. С. 320-323.

5. Государственная фармакопея СССР. М., 1989. Вып. 2.

Пятигорская государственная фармацевтическая академия 31 мая 2006 г.