CC BY
6
Сборник науч. трудов Ангар. НИИ гигиены труда и проф. заболеваний. 1977, вып. 7, с. 80.
Колло Р. Кальченко К. И. — Гидрол. и лесохим.
пром.-ость, 1971, № 12, с. 4.
Минх А. А. Ионизация воздуха и ее гигиеническое значение. М., 1958.
Немыря В. И. — В кн.: Ленинградская микологическая конф. 8-я. Материалы. Л., 1971, с. 168.
Немыря В. И., Влоаавец В. В. Охрана окружающей среды от выбросов предприятий микробиологической промышленности. М.. 1979.
Рычков Р. — Правда, 2/У1 1980 г.
Фармакологические препараты (ВОЗ. Серия техн. докл. № 530). М., 1975, с. 6—8.
Федоринчик Н. С. — В кн.: Биологические средства защиты растений. М., 1974, с. 263.
Чижевский А. Л.—Сов. врач, газета, 1934, № 19, с. 1383—1390.
— Chem. Age, 1978, v. 116, p. 9.
— Jap. chem. Week, 1977, v. 18, № 888, p. 4.
Mínalo Т., Ко К., Yamaguchi J. — Advanc. appl. Microbiol., 1977, v. 21, p. 53—88.
Поступила 20.07.81
УДК 614.777:628.19l:S78]-078
M. С. Аизен
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНТЕРОВИРУСОВ В ВОДЕ
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Санитарно-вирусологические исследования приобретают особое значение в решении гигиенических вопросов биологического загрязне^я окружающей среды. Разработанные в последние годы методы концентрирования сделали реальным проведение саннтарно-вирусологических исследований сточных жидкостей, а также природной, обработанной и питьевой воды (М. С. Айзен и соавт.; Г. А. Баг-дасарьян и соавт.; В. П. Широбоков). Имеются сообщения о присутствии энтеровирусов в различных водных объектах и водопроводной воде (А. М. Ошеровнч и Г. С. Часовникова; Э. В. Ра-бышко), но регистрация вирусов часто ограничивается качественной характеристикой. Назрела необходимость в принятии единой системы количественного учета вирусов в санитарно-гигиениче-ской оценке воды. Это позволит более четко оценить степень вирусного загрязнения изучаемого объекта, эффективность существующих и разрабатываемых методов санации воды, сопоставить вирусологические показатели с другими факторами биологического и химического загрязнения воды, влияющими на здоровье человека. Внедрение методов количественного определения вирусов обеспечит эффективный гигиенический контроль безопасности воды в отношении энтеровирусов.
В данной работе рассматриваются методы определения количества вирусных частиц в воде. Для выделения энтеровирусов в клеточных культурах используют методы бляшкообразования и цитопа-тического действия (ЦПД) на клетку. Для количественной обработки получаемых результатов были развиты статистические методы расчета дозы 50% гибели восприимчивых организмов (ЬОь0, тканевая цитопатогенная доза — ТЦД50 и др.). Методы определения 50% дозы стали общепринятыми для обозначения количества вируса. Они основаны на установлении взаимоотношений между внесенной дозой и ответной реакцией организма и в основном отражают вариации чувствительности организма или клеток. Для подсчета 50% дозы пользуются методами полных кумулятивов Рида и Менча, опреде-
ления «центральной величины» Кербера, а также пробит-методом (М. К. Ворошилова и соавт.; Аг-mitage и Spicer). Ценность количественных методов определения 50% доз заключается в возможности нивелирования ошибок, связанных с изменением вирусных частиц различными механизмами в клетках хозяина, незначительными нарушениями количества вносимых доз и др. Но эти методы не обладают количественной определенностью, они не позволяют установить, какое количество организмов включается в инфекционный процесс, какова концентрация вирусных частиц в исследуемом материале. Особенно чувствуется ограниченность методов 50% доз в санитарно-вирусологической практике, поскольку исследования рассчитаны на выявление низких концентраций вирусов, которые трудно, а часто и невозможно учитывать этими методами. При саннтарно-вирусологических исследованиях для количественного анализа пользуются простым подсчетом бляшкообразующих единиц без расчета 50% дозы. Такого преимущества не имеет метод выделения по ЦПД. Однако следует отметить, что метод бляшек не имеет широкого использова-ния в санитарно-вирусологической практике. Для применения этого метода требуется большое количество культуры клеток (в основном первичной ткани) и труднодоступные реактивы. Кроме того, этот метод затрудняет определение смесей в вирусных конгломератах, использование пассаЖей материала для обнаружения вирусных частиц, проявляющих свое действие в процессе адаптации к культуре клеток; имеется риск потери материала в случае погрешностей в постановке опыта. В отношении чувствительности выделения энтеровирусов по ЦПД и методом бляшек приводятся разноречивые данные. Имеются сведения как о большой чувствительности того или другого метода, так и об их равноценности (Gabrielson и Hsiung; Koaten-bader и Cliver; Nupen).
Нами проведена проверка сравнительной чувствительности выделения вирусов методом бляшек и ЦПД на модельной системе, состоящей из вируса
полиомиелита, штамм Leon 12 ab, дозированно внесенного в пробы стерильной водопроводной воды и перевиваемой клеточной культуры почек обезьян Vero. Экспериментальные исследования показали сопоставимость результатов количественной оценки методами ЦПД и бляшек при выделении вируса в дозах выше 10 БОЕ; при исследовании более низких концентраций намечалось преимущество в чувствительности метода ЦПД. На основании данных литературы и результатов собственных исследований можно считать, что в санитарно-вирусоло-гической практике метод ЦПД более предпочтителен ввиду большой чувствительности в обнаружении малых доз, доступности и экономичности. В связи с этим количественные методы должны разрабатываться с учетом применения способа обнаружения по ЦПД. Для подсчета инфекционных частиц определяют наиболее вероятное число (НВЧ). Методы расчета НВЧ широко применяются для учета как бактерий группы кишечных палочек, так и других микроорганизмов в воде. Методы расчета НВЧ основаны на теории распределения малых чисел по Пуассону. В отношении использования методов НВЧ для количественного определения вирусов приведено экспериментальное доказательство сохранения соотношений между дозой вируса Коксаки Bs и ответной реакцией клеток первичной культуры почек обезьян в рамках теории поведения одной частицы в жидкой среде, подчиняющейся закону распределения малых чисел по Пуассону (Chang и соавт.). Поскольку ЦПД дает одна вирусная частица или малое количество частиц, НВЧ определяется в зависимости от различных комбинаций положительных и отрицательных результатов в серии однотипных проб. Само распределение отдельных наблюдений является обычно асимметричным ввиду того, что процент положительных проб очень мал в сравнении с процентом отрицательных проб. Распределение по Пуассону характеризуется одним параметром — среднеарифметической (X), что соответствует искомому НВЧ микробных тел в исследуемом объеме. При исследовании одного ряда пробирок Chang дает расчет НВЧ по формуле:
Р =
— 2,303
нвч = —¿—lg
где Р — вероятность отрицательного значения; в — число отрицательных проб; V — объем исследуемого материала; л — общее число проб. В случае наличия разведений в исследовании материала для расчета НВЧ может быть применена следующая формула:
НВЧ —
1/Ть '
где А — число положительных проб с дегенери-рованными культурами клеток; а — объем исследуемого материала; Ь — объем материала, при внесении которого не было дегенерации.
Количественный учет НВЧ вирусов впервые был применен при исследовании фекалий больных. На основании приведенных формул Chang составил таблицу пересчета НВЧ вирусных частиц на 1 мл клинического материала. Для пользования таблицей необходимо заражение культуры клеток тремя разведениями исследуемого материала с коэффициентом 4. На каждое разведение используют 5 пробирок. По сумме положительных и отрицательных результатов в пробирках определяют НВЧ с помощью таблицы. Имеется сообщение о применении таблиц Chang для количественного учета вирусов в воде водоемов (Р. Вальтер-Оффен-хауер и К. Хорн). Однако использование данного метода требует большого количества клеточного материала, что затруднительно в практических условиях. Кроме того, полученный результат показывает НВЧ вирусов в 1 мл и для определения содержания вирусов во всем объеме пробы проводят дополнительный пересчет. Такой пересчет не дает точного результата при низкой концентрации вирусов в материале, так как существует нелинейная зависимость распределения вирусных частиц в исследуемом объеме. Мы обратились к выбору метода подсчета НВЧ с учетом двух факторов — экономии и точности. На^основании общих закономерностей в природе распределения бактерии и вирусов считаем возможным использование в санитарной вирусологии общепринятых стандартных методов определения количества микроорганизмов в воде. Из большого числа различных модификаций определения НВЧ бактерий нами отобраны наиболее предпочтительные с точки зрения вирусологических исследований варианты. Для исследования воды с низким содержанием энтеровирусов подсчет НВЧ может быть проведен по методике, основанной на пятикратном делении материала и использовании табл. 1 (Г. П. Калина; «Международные стандарты питьевой воды»). При увеличении числа делений исходного материала до десяти-пробирочного ряда можно получить значение НВЧ в промежуточных интервалах в соответствии с' табл. 2 (Г. П. Калина; МасСоу). Для количественной оценки более загрязненной воды целесообразно применять методику, основанную на двукратном делении исходного материала1и двух последующих десятикратных разведений. В этом случае НВЧ подсчитывался по табл. 3, предложенной Хоскинсфм — Муром (Moore и соавт.). При использовании метода определения НВЧ согласно табл. 1 в случае наличия положительных результатов во всех 5 пробирках для получения более точного ответа следует продолжить исследование данной пробы в разведениях согласно методике для подсчета НВЧ по табл. 3.
Таким образом, схема индикации и одновременно количественного учета энтеровирусов следующая. Пробу исследуемой воды (1 л)' фильтруют через фильтр мембранный или фильтрующий материал ФПП-3/20-3 при отрицательном давлении 0,5 атм, создаваемом вакуумным насосом. Вирус-
Таблица 1
НВЧ на I л при пятикратном делении исходного материала
Число пробирок с ЦПД из 5 и с - СЛСДОМЯНИЫХ НВЧ Предел НВЧ (95% доверительные границы) нижний | верхний
0 0,0 0,0 6,0
1 2,2 0.1 12,6
2 5,1 0,5 19,2
3 9,2 1,6 29.4
4 16,0 3.3 52,9
5 . 16,0 •S.0 \9
содержащий материал, адсорбировавшийся на фильтре, элюируют с помощью 2—5 мл мясной воды или 1 М раствора хлористого натрия на гли-коколевом буфере рН 11,5 и полностью переносят1 в стерильный сосуд. Полученный элюат в объеме 2—5 мл эквивалентен 1 л воды, отобранной для исследования. Заражение клеточных, культур в пробирках производят следующим образом. Для определения НВЧ по табл. 1 или 2 весь объем элюата равномерно распределяют по 5 или 10 пробиркам соответственно. Для определения НВЧ по табл. 3 из исходного объема элюата делают 2 последовательных десятикратных разведения в 10 и 100 раз. Затем вносят поровну все количество исходного и в разведениях элюата в каждые 2 пробирки (всего 6 пробирок). Контакт вируссодер-жащего материала с клеточной поверхностью длится 1—2 ч в условиях термостата. По истечении этого срока исследуемую жидкость удаляют и сохраняют для повторного исследования или заражения других клеточных культур. С целью экономии клеточного материала, времени и труда работников для количественного учета вирусов в соответствии с табл. 3 можно первоначально проводить исследование только исходного материала в 2 пробирках. При наличии 1 или 2 положительных ответов данную пробу исследуют уже в разведениях, что позволяет получить количественный результат на основании числа положительных и отрицательных ответов по табл. 3. Объем элюата,
Таблица 2
НВЧ на I л при десятикратном делении исходного материала
Число иробнрок с ЦПД из 10 исследованных НВЧ Предел НВЧ (95% доверительные границы)
нижниП верхний
1 1,05 0,2 7,5
2 2,2 0,6 9,0
3 3.6 1.1 11.1 ■
4 5,1 1,9 13,8
5 6,9 2,8 16,9
6 9.2 4,0 21,0
7 12,0 6,4 26,4
8 16,1 7,4 34.9
9 23,0 10,3 51,6
10 32,2 14,4
Таблица 3
НВЧ на I л при двукратном деления исходного материала и его разведений в 10 и 100 рал по Хоекинсу- Муру
Число пробирок о ЦПД
■сходный при разведении при разведении НВЧ
материал Ю-1 ю-3
I б 0 о.б'о
1 | 0 1 1,20
1 0 2 1,90
1 1 ; 0 1,30
1 1 1 2,00
1 t 2 2,80
1 2 0 2.10
1 2 1 2,56
1 2 2 3,70
2 0 0 2,30
2 0 1 5,00
2 0 2 9,50
й 1 0 6,20
2 1 1 13,00
2 1 2 21,00
2 2 0 24,00
2 2 1 70,00
2 2 2 240,00 и более
вносимый на клеточную поверхность, не влияет на проявление цитопатического действия вируса (Kosten bader и Cliver), что следует иметь в виду при использовании других методов концентиро-вания. С целью получения окончательного ответа делают дополнительный пассаж материала от каждой пробирки. На основании положительных и отрицательных результатов находят НВЧ по соответствующей таблице. Табл. 3 может быть использована для определения'НВЧ вируса в любом вируссодержащем материале независимо от его концентрации. Для этого материал исследуют в клеточной культуре до разведения, в котором вирус уже отсутствует. Табличное НВЧ находят по результатам 3 последних разведений и умножают на число разведений.
Такйм образом, на современном уровне развития санитарной вирусологии гигиеническую оценку вирусного загрязнения окружающей среды возможно проводить на основании интегрального учета качественных и количественных показателей. Для количественного определения энтеровирусов схему исследования по концентрированию и обнаружению вирусов необходимо дополнить специальным распределением материала соответственно статистическим таблицам расчета НВЧ выделенных энтеровирусов. Количественное определение но НВЧ возможно при использовании любого метода концентрирования (адсорбция на различных фильтрах, ионообменных смолах, бентоните и др.). При этом требуется деление на части элюата, получаемого от 1 л воды. Известно, что процедура по концентрированию вируса ведет к потерям различной степени* в зависимости от метода концентрирования. Внесение поправок на процент потерь не представляется возможным, так как э(|х|>ективность концентрирования непостоянна.
— G4 —
Получить данные, приближающиеся к истинному количеству вирусных частиц в пробе, можно при одновременном использовании двух методов, зоны максимальной эффективности концентрирования которых диаметрально противоположны (В. А. Ка-р . занцева и соавт.). Таким методом можно пользоваться при проведении специальных исследований, требующих особо точных сведений. В санитарной практике достаточно ограничиться любым из предлагаемых методов концентрирования и последующим подсчетом НВЧ по таблицам. Осуществление санитарно-вирусологических исследований водных объектов едиными методами концентрирования и количественного определения вирусов позволит выработать критерии оценки для постоянного гигиенического контроля. Применение единой системы учета по НВЧ в вирусологических и бактериологических исследованиях открывает возможности для установления зависимостей между ними в комплексной оценке микробного состояния водных объектов.
Литература. Айзен М. С., Казанцева В. А., Дроздов С. Г. и др. — Вопр. вирусол., 1979, № 5, с. 554—557.'
Багдасарьян Г. А., Ловцевич Е. Л., Лепахина Н. К■ — Гиг. и сан., 1975, № 4, с. 106—107.
Вальтер-Оффенхауер Р., Хори К. — Там же. 1974.
• № 9, с. 72—74. '
Ворошилова М. К., Жевандрова В. И., Балаян М. С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М„ 1964, с. 127—131.
Казанцева В. А., Айзен М. С., Дроздов С. Г. — Вопр. вирусол., 1978, № 4, с. 475—478.
Калина Г. П. Сальмонеллы в окружающей среде. М., 1978, с. 132—134.
Международные стандарты питьевой воды. М., 1973, с. 68.
Ошерович А. М., Часовникова Г. С. — Гиг. и сан., 1969, № 3, с. 89—93.
Рабышко Э. В. — Там же, 1974, № 4, с. 105—106.
Широбоков В. П. — Вопр. вирусол., 1974, № 2, е. 228— 233.
Armitage P., Spicer С. — J. Hyg., 1956, v. 54, p. 401 — 414.
Chang S. L., Berg G„ Busch К. et al. — Virology, 1958, v. 6, p. 27—42.
Chang S. L. — In: Viruses in Water. Washington, 1976, p. 219—234.
Gabrielson M. O., Hsiung G. D. — Appl. Microbiol., 1969, v. 13, p. 967—972.
Kostenbader К. D., Cliver D. 0. — Ibid., 1973, v. 26, p. 139—152.
Kostenbader К. D. Jr., Cliver D. O. — J. Food Sei., 1977, v. 42, p. 1253—1257.
MacCoy G. — J. appl. Bact., 1962, v. 25, p. 230—238.
Moore В. et al. —■' J. Hyg., 1959, v. 57, p. 435—472.
Nupen E. M. — Water Res., 1978, v. 4, p. 667—672.
Поступила 10.06.81
УДК 613.632.4 + 615.91:547.412.126.23
П. П. Лярский, С. Е. Глейберман, А. П. Волкова
СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ГИГИЕНЫ И ТОКСИКОЛОГИИ ПРОПЕЛЛЕНТОВ
ВНИИ дезинфекции и стерилиза
Масштабы промышленного производства аэрозольных баллонов различного назначения чрезвычайно велики. В 1974 г., например, в мире их было выпущено более 6 млрд. (Н. А. Мерсова и Н. А. Кислякова). Растет ассортимент химических веществ и расширяется сфера их использования в аэрозольных упаковках в быту, санитарно-гигиенической и лечебной практике (моющие, чистящие, дезодорирующие, дезинфицирующие, инсектицидные, репеллентные, парфюмерно-косметические, лечебные, автокосметика, полирующие, красящие и другие средства).
Однако дальнейшее развитие аэрозольной формы применения химических средств затруднялось, поскольку требовалась оценка по гигиеническим и токсикологическим показателям одного из основных их компонентов — фторхлоруглеводород-ных пропеллентов (фреонов, хладонов), основная функция которых состоит в эвакуации содержимого аэрозольной упаковки и его диспергировании. При этом не следует забывать, что количество пропел-лента в аэрозольных баллонах составляет 50— 85 масс. % и более.
Новые данные в отношении применения хладонов имеют два аспекта — экологический и токси-
3 Гигиена и санитария № 1 — 65
ни Минздрава СССР, Москва t
кологический. В соответствии с гипотезой, выдвинутой в 1974 г. (Rowland и Molina; Rowland), отрицательное экологическое воздействие хладонов связывается с накоплением их в стратосфере, где они подвергаются фотолитической диссоциации с выделением атомарного хлора, который способствует каталитическому разложению озона.. Поскольку ежегодно из аэрозольных баллонов выбрасывается в атмосферу около 500 000 тонн фреонов (И. И. Вольнов), истощение озонового пояса, по мнению авторов гипотезы, может достигнуть значительного уровня, что может привести к нежелательным для биосферы последствиям (усилению солнечной радиации, повышению температуры на Земле, изменению климата и др.). Правомерность этих положений еще нуждается в серьезных подтверждениях (Ю. Л. Трутце и соавт.), а их обсуждение выходит за рамки данного обзора. Укажем лишь, что ряд стран (США, Канада, Швеция), придавая этой гипотезе определенное значение, а также ориентируясь на ряд экономических показателей, почти полностью прекратили производство аэрозольных баллонов на основе фторхлоруглеводородных пропеллентов (Н. А. Мерсова). В связи с этим усилия многих исследователей
