CC BY
71
DOI: 10.15690/onco.v6i1/1996
Т.М. Михалевская, Е.В. Волочник, Н.Е. Конопля, О.И. Быданов
Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии,
Минск, Республика Беларусь
Клиническое значение молекулярных маркеров — мутации BRAF V600E и делеции CDKN2A — при низкозлокачественных глиомах у детей: когортное исследование
Низкозлокачественные глиомы являются наиболее частыми опухолями головного мозга у детей, они имеют благоприятный прогноз, однако в части случаев возникают рецидивы или продолженный рост опухоли. При относительно схожих клинических и морфологических характеристиках опухолей достаточно сложно выделить группу пациентов, у которых возможно прогрессирование. Цель исследования — анализ влияния некоторых клинических, гистологических и молекулярных характеристик низкозлокачественных глиом на возможность прогрессирования / рецидивирования. Методы. В ретроспективном когортном исследовании были изучены клинические данные, гистологические особенности и молекулярные маркеры — гиперэкспрессия фосфорилированной формы ERK1/2 (pERK1/2), мутация гена B-Raf (BRAF V600E), делеция гена CDKN2A (delCDKN2A) — у 90 пациентов в возрасте от 5 мес до 18 лет с низкозлокачественными детскими глиомами, находившихся под наблюдением в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии (Минск, Республика Беларусь) с 2010 по 2018 г. В образцах ткани глиом с признаками анаплазии также оценивали экспрессию гена Х-сцепленного синдрома альфа-талассемии (ATRX), триметилированного гена гистона 3 (H3K27me), p53, мутацию гена изоцитрат дегидрогеназы 1 (IDH1R132H). Определение молекулярных маркеров проводили иммуногистохимическим методом и методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Результаты. Статистически значимо подтверждено негативное влияние на бессобытийную выживаемость пациентов с глиомами таких факторов, как нерадикальное удаление опухоли p<0,0001), повторное лечение рецидива (p<0,0025), гиперэкспрессия pERK1/2 (p<0,0001), гистологические признаки анаплазии (p<0,0022), участки диффузного роста опухоли (p<0,001), мутация BRAF V600E (p<0,0001), delCDKN2A (p<0,0099). В ткани глиом с признаками анаплазии чаще встречались гиперэкспрессия pERK1/2, мутация BRAF V600E, delCDKN2A и утрата ATRX. При проведении многофакторного анализа нерадикальное удаление опухоли и наличие одного из молекулярных маркеров значимо влияли на прогноз (p<0,0001). Заключение. Определение молекулярных маркеров с одновременной оценкой степени резекции опухоли позволяет выделить группу пациентов с высоким риском рецидива/про-грессирования опухоли.
Ключевые слова: низкозлокачественные глиомы, прогноз, BRAF V600E, delCDKN2A. (Для цитирования: Михалевская Т.М. ,Волочник Е.В., Конопля Н.Е., Быданов О.И. Клиническое значение молекулярных маркеров — мутации BRAF V600E и делеции CDKN2A — при низкозлокачественных глиомах у детей: когортное исследование. Онкопедиатрия. 2019;6(1):34-44. Doi: 10.15690/onco.v6i1/1996)
34
ОБОСНОВАНИЕ
Пилоцитарная астроцитома является самой распространенной низкозлокачественной астро-цитомой у детей [1]. Пилоцитарная астроцитома возникает по аксиальной линии или вблизи нее в мозжечке, зрительном нерве и хиазме, в области гипоталамуса-таламуса [2]. Реже астроцитомы возникают в полушариях головного мозга, желудочках головного мозга, промежуточном парусе и спинном мозге [2]. У детей в 85% случаев опухоль локализуется в мозжечке, у взрослых чаще встречаются образования в полушариях мозга [3]. Часть пилоци-тарных астроцитом ассоциирована с нейрофибро-
матозом 1-го типа и встречается у 15-21% таких пациентов, обычно поражая зрительный нерв или перекрест [4].
Плеоморфная ксантоастроцитома является низкозлокачественной астроцитомой, близкой по патогенезу к пилоцитарной астроцитоме. Чаще поражает детей и подростков [5, 6]. Локализуется в поверхностных отделах теменной или лобной доли головного мозга.
Низкозлокачественные астроцитомы характеризуются индолентным клиническим течением. Они имеют относительно хороший прогноз с пятилетней выживаемостью 80-90% и 10-летней выжи-
ваемостью около 80% в зависимости от расположения опухоли и радикальности удаления [6-8]. Возможность полного хирургического удаления связана с относительно медленным и очаговым характером роста опухоли [9]. Однако некоторые из пилоцитарных астроцитом более агрессивны, имеют более высокую частоту рецидивов и неблагоприятный прогноз [10, 11]. Важно правильно идентифицировать эту группу пациентов для своевременной интенсификации лечения.
Современные молекулярные исследования способны предоставить информацию о биологическом поведении этих опухолей и возможных точках приложения таргетной терапии [12]. В качестве объекта исследования были выбраны пилоцитарная астроцитома и плеоморфная ксантоастроцитома в связи с общностью патогенеза, а именно с дизре-гуляцией МАРК-сигнального пути [6].
Мы представляем наш опыт патологоанатомиче-ской диагностики низкозлокачественных астроци-
том у детей с акцентом на негативных предикторах биологического поведения.
Цель исследования — оценить прогностическую значимость комплекса клинических, гистологических и молекулярно-генетических данных в тканях пилоцитарной и плеоморфной ксанто-астроцитомы со стабильным или рецидивирующим течением. Определить наличие взаимосвязи признаков анаплазии с некоторыми неблагоприятными молекулярными маркерами и клиническим поведением опухоли.
МЕТОДЫ
Дизайн исследования
Проведено когортное исследование с ретроспективным анализом данных.
Критерии соответствия
В исследование были включены пациенты в возрасте от 0 до 18 лет с впервые установленным диаг-
Taisiya M. Mikhaleuskaya, Alena V. Valochnik, Natalya E. Konoplya, Oleg I. Bydanov
Belorussian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology,
Minsk, Republic of Belarus
The Clinical Significance of Molecular Markers — BRAF V600E Mutations and CDKN2A Deletions — in Low-Grade Pediatric Gliomas: Cohort Study
Background. Low-grade gliomas are the most common brain tumors in children. Gliomas have a favorable prognosis, but in some cases relapses or continued tumor growth occur. With relatively similar clinical and morphological characteristics of tumors, it is rather difficult to select a group of patients who may have progression. Objective. Our aim was to study the impact of certain clinical, histological and molecular characteristics of tumors on the progression/recurrence. Methods. A retrospective cohort study was carried out. Clinical data, histological features and molecular markers (overexpression of phosphorylated ERK1/2 (pERK1/2), mutation of B-Raf kinase (BRAF V600E), deletion of CDKN2A gene (delCDKN2A) were studied in 90 patients with low-grade pediatric gliomas, who were treated in the Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology during 2010-2018. In gliomas with signs of anaplasia expression of gene of the X-linked alpha-thalassemia syndrome (ATRX), a trymethylated form of histone 3 (H3K27me), p53, and mutation of the dehydrogenase 1 isocitrate 1 gene (IDH1R132H) were also evaluated. Immunohistochemistry and the hybridization in situ (FISH) was performed to evaluate the molecular markers. Results. Statistical analysis confirmed the importance of such factors as non-radical tumor removal (p<0.0001), repeated treatment (p<0.0025), overexpression of pERK1/2 (p<0.0001), histological signs of anaplasia (p<0.0022), areas of diffuse growth (p<0.001), BRAF V600E (p<0.0001), delCDKN2A (p<0.0099). In tissue of gliomas with anaplasia overexpression of pERK1/2, mutation BRAF V600E, delCDKN2A and ATRX loss were more common. When conducting multivariate analysis, non-radical tumor removal and the presence of one of the molecular markers significantly influenced the prognosis (p<0.0001). Conclusion. The definition of molecular markers and the simultaneous assessment of the degree of tumor resection allows us to distinguish a group of patients with a high risk of tumor recurrence / progression.
Key words: Low-grade gliomas, prognosis, BRAF V600E, delCDKN2A.
(For citation: Mikhaleuskaya Taisiya M., Valochnik Alena V., Konoplya Natalya E., Bydanov Oleg I. The Clinical Significance of Molecular Markers — BRAF V600E Mutations and CDKN2A Deletions — in Low-Grade Pediatric Gliomas: Cohort Study. Onkopediatria. 2019;6(1):34-44. Doi: 10.15690/onco.v6i1/1996)
35
нозом пилоцитарной астроцитомы и плеоморфной ксантоастроцитомы.
Условия проведения
Исследование проведено на базе ГУ РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии Минздрава Республики Беларусь (Минск), ГУ РНПЦ неврологии и нейрохирургии Минздрава Республики Беларусь (Минск): на данных базах осуществлялось только взятие материала для исследования.
Продолжительность исследования
Ретроспективно проведен анализ данных 90 пациентов с низкозлокачественными глиомами, оперативное лечение которым было выполнено в период с 2016 по 2018 г. на базе РНПЦ неврологии и нейрохирургии. Все пациенты находились под наблюдением в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии с 2010 по 2018 г.
Описание медицинского вмешательства
Экспрессию иммуногистохимических и наличие цитогенетических маркеров оценивали до начала специализированного лечения с использованием участка опухолевой ткани, полученной в 84 случаях при биопсии первичного очага; в 6 случаях (когда материал первичной опухоли был непригоден для исследования) экспрессия маркеров изучалась на гистологическом материале, полученном в ходе хирургического этапа лечения рецидивной опухоли.
В качестве иммуногистохимических маркеров были выбраны следующие показатели: pERK1/2 — активная форма конечного эффектора MAPK-сигнального пути, VEI1 — антитело против мутант-ной формы киназы BRAF V600E. Также оценивали наличие делеции гена CDKN2A методом флуоресцентной гибридизации in situ — FISH. В опухолях с очагами диффузного роста и выраженной анапла-зией дополнительно проводили иммуногистохими-ческое исследование с антителами к ATRX — белку, участвующему в ремоделировании хроматина, H3K27me — суррогатному маркеру наличия мутации гистонового белка Н3, p53 — белку-онкосу-прессору, IDH 1 mut — антителу против мутантной формы белка IDH1R132H. Иммуногистохимическое исследование участков ткани опухоли осуществляли на парафиновых срезах в автоматическом стейнере (Ventana Benchmark GX, Roche, США). Были использованы следующие антитела: моно-клональное мышиное антитело ERK1(pT202/ pY204)+ERK2(pT185/pY187) (Abcam, разведение 1:500); поликлональное кроличье антитело ATRX (Abcam, разведение 1:500); моноклональное мышиное антитело к IDH1 R132H (Sigma-Aldrich, разведение 1:100); моноклональное мышиное антитело к H3K27me (Abcam, разведение 1:100); моноклональное мышиное антитело VEI-1 (Ventana, ready-to-use); моноклональное мышиное антитело к p53 (Ventana, клон — Bp-53-11, ready-to-use).
Срезы инкубировали с первичными антителами по стандартной методике в течение 20 мин. Оценку результатов проводили с использованием светового микроскопа (Nicon Eclipse 50i, Nicon, Япония): позитивным считалось окрашивание на p53 при ядерном окрашивании более 10% опухолевых клеток, на ATRX и H3K27me — при наличии ядерного окрашивания опухолевых клеток, на VEI-1 и IDH1 R132H — при наличии цитоплазматического окрашивания, гиперэкспрессия рERK1/2 учитывалась при наличии ядерного и цитоплазматического окрашивания более чем в 25% опухолевых клеток [13].
Исследование статуса гена CDKN2A в опухолевых клетках производили на двух типах материала — мазках-отпечатках и срезах формалин-фикси-рованных опухолей, заключенных в парафиновые блоки (FFPE). Мазки-отпечатки, фиксированные раствором Карнуа (ледяная уксусная кислота-этанол в соотношении 3:1), и депарафинизиро-ванные срезы с парафиновых блоков проходили ферментную обработку (3 и 25 мин в рабочем растворе пепсина для отпечатков и FFPE соответственно) [время воздействия пепсина отрабатывалось в лаборатории центра]. Гибридизация зонда и постгибридизационная отмывка осуществлялись в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя (Abbott Molecular, США) с использованием двухцветного зонда LSI CDKN2A SpectrumOrange/ CEP9 SpectrumGreen [14]. Внутрилабораторные значения погрешности зонда соответствуют 7,2% для мазков-отпечатков опухоли, более 30% клеток с аберрацией для парафиновых срезов (погрешность определялась на образцах мазков-отпечатков и FFPE без признаков злокачественного роста, верифицированных гистологически).
При исследовании анализировали весь материал на стекле, подсчитывали минимум 100 клеток в нескольких точках на стекле с характерным расположением сигналов. При очаговом расположении аберрантных клеток считали минимум 50 клеток. При подсчете диффузно располагающихся клеток с аберрантным расположением сигнала среди клеток с нормальным статусом учитывали процент анализируемого клона: для мазков-отпечатков положительным результатом считается более 15% клеток, для FFPE — более 30-35% [14, 15].
Делецию гена ставили при соотношении сигналов контрольного региона (центромера 9) к сигналам гена CDKN2A 2:1, 3:1 и т.д. (только один сигнал CDKN2A в ядре) [15]. В случаях с соотношением сигналов 2:0 ставили гомозиготную делецию гена CDKN2A. При соотношении сигналов 1:1 ставили моносомию хромосомы 9 [15].
Исходы исследования
Основной исход исследования
Проводили анализ общей бессобытийной выживаемости пациентов с низкозлокачественными глиомами. Под событием понимали рецидив опухоли, прогрессирование / продолженный рост опухоли.
36
Анализ в подгруппах
На основании гистологического исследования была выделена подгруппа пациентов с низкозлокачественными глиомами с наличием признаков анаплазии. Как признаки анаплазии рассматривались очаговая или диффузная цитологическая атипия, митотическая активность более 2 митозов на 10 полей зрения при увеличении 400, очаги некроза. В данной подгруппе дополнительно проводилось определение экспрессии IDH1 R132H, ATRX и H3K27me с помощью иммуногистохимического метода.
Методы регистрации исходов
Регистрация исходов исследования осуществлялась лечащими врачами на основании данных магнитно-резонансной томографии головного и спинного мозга.
Этическая экспертиза
Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом (Этический комитет Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии, Минск) 20.01.2016 г.
Статистический анализ
Принципы расчета размера выборки
Размер выборки предварительно не рассчитывался.
Методы статистического анализа данных
Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программного пакета R-Statistics v. 3.5.3 (R Foundation Conference Committee, США). Показатели выживаемости рассчитывали по методу Каплана-Майера. Для вычисления показателей выживаемости анализировали параметры всех пациентов, включенных в исследование. Точкой отсчета считали момент проведения первичной рентгенологической диагностики. Пациентов, судьба которых неизвестна, цензурировали по временной точке. Значимость различий между показателями выживаемости определяли с помощью log-rank теста. Многофакторный анализ прогностических признаков выполняли методом Кокса. Сравнительный анализ качественных признаков между группами пациентов проводили с помощью критерия хи-квадрат. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Для определения наличия корреляционных связей (коэффициент корреляции, r) использовали метод Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Объекты (участники) исследования
В исследование было включено 90 пациентов с диагнозом пилоцитарной астроцитомы и плео-морфной ксантоастроцитомы, из них 39 (44%) девочек. Возраст пациентов варьировал от 5 мес до 18 лет (медиана возраста составила 7,17 года). У 33 (37%) больных опухолевый процесс был лока-
лизован в черве или полушариях мозжечка, у 6 (7%) пациентов опухоль поражала червь мозжечка с врастанием в ствол, у 8 (9%) — находилась в хиаз-мально-селлярной области, у 14 (15%) — в хиаз-мально-селлярной области с врастанием в область 3-го желудочка, у 5 (6%) — в таламусе, у 17 (19%) — в больших полушариях, у 3 (3%) — в стволе мозга, у 4 (4%) — в спинном мозге. Радикальное удаление опухоли было проведено в 44 (49%) случаях, в остальных — субтотальное и частичное удаление. Характеристика пациентов приведена в табл. 1.
Основные результаты исследования
При проведении гистологического исследования пилоцитарная астроцитома, соответствующая критериям классификации опухолей центральной нервной системы Всемирной организации здравоохранения (WHO classification of Central Nervous System tumors 2016), была выявлена в 84 случаях. Гистологическая картина 6 опухолей имела признаки плеоморфной ксантоастроцитомы. Три пилоци-тарные астроцитомы имели комплексное строение, включающее участки с нейрональной дифференци-ровкой в виде лент (ribbons) и солидных скоплений.
Таблица 1. Клиническая характеристика исследуемой группы пациентов
Table 1. Clinical characteristics of the studied group of patients
Характеристики Число пациентов, n Доля пациентов, %
Пол
• Мужчины 41 46
• Женщины 39 44
Возраст, лет
• Младше 5 41 46
• Старше 5 39 44
Локализация
• Хиазмальная 2722 24
• Нехиазмальная 6368 76
Радикальность удаления
• Тотальное 44 49
• Субтотальное 40 44
• Частичное 6 7
Гистологические формы
• Пилоцитарная астроцитома 84 93
• Плеоморфная ксантоастроцитома 6 7
• Опухоли, ассоциированные с нейрофиброматозом 1-го типа 2 2
37
При гистологическом анализе 29 образцов обнаружены астроцитомы, имеющие одну или несколько гистологических черт, нехарактерных для низкозлокачественных астроцитом: зоны с диффузным ростом (26 случаев), очаговая или диффузная анаплазия (24), гиперклеточность (11), митозы (9), некроз (4). В 9 опухолях анаплазия клеточных элементов сочеталась с неопределенным фенотипом опухолевых клеток, а именно: опухолевые клетки были отросчатыми с широкой эозинофильной цитоплазмой и округлыми отростками, округлым ядром с крупным ядрышком. Двум пациентам с астроци-томами с признаками анаплазии был выставлен диагноз нейрофиброматоза 1-го типа; у одного пациента ранее проводилась лучевая терапия.
Проведенное иммуногистохимическое исследование обнаружило следующие закономерности: экспрессия маркера активации MAPK-сигнального пути pERK1/2 выявлена у 41 (46%) пациента; коэкспрессия VEI1 при наличии гиперэкспрессии pERK1/2 — у 21 (23%).
При цитогенетическом исследовании материала, полученного после хирургического удаления опухоли, утрата гена CDKN2A была зарегистрирована всего в 9 (10%) случаях: у 7 (8%) пациентов была выявлена делеция CDKN2A, у 2 (2%) — моно-сомия хромосомы 9.
К настоящему моменту 68/90 (76%) пациентов не имеют признаков прогрессирования заболевания. Общая бессобытийная выживаемость во всей анализируемой группе педиатрических глиом составила 47±11% при общей выживаемости 98%. Медиана времени до прогрессирования — 23 мес.
При проведении однофакторного анализа наиболее значимым клиническим фактором, влияющим на рецидивирование/прогрессию глиом, является объем хирургического лечения (рис. 1).
Рис. 1. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от радикальности операции
Fig. 1. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on the extent of tumor resection
100 908070-
I 60-
I 50-I 40-I 3020100-
Рис. 2. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от наличия повторного хирургического/нехирургического лечения Fig. 2. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on repeated surgical/non-surgical treatment
74-
1 2 3 4 5 6 Годы
Примечание. р<0,001.
— R0, n=44, без событий — 42; 95±3%
— R1/2, n=46, без событий — 26; 16±10% Note. р<0,001.
— R0, n=44, without events — 42; 95±3%
— R1/2, n=46, without events — 26; 16±10%
10
100 -Г
90-
80-
/о-
Ё о 60-
к о 50-
01 ta 40-
к
с зо-
EI
20-
ю-
о-
0
\
I 23456789 10 Годы
Примечание. р<0,003.
— Хирургическое лечение, n=83, без событий — 68; 67±10%
— Повторное лечение, n=7, без событий — 0; 0% Note. р<0,003.
— Surgery, n=83, without events — 68; 67±10%
— Repeated treatment, n=7, without events — 0; 0%
Пациенты, чья опухоль была удалена частично или субтотально, достоверно имели более высокий риск рецидива опухоли, чем пациенты с тотально удаленной опухолью (16±10 против 95±3%, p<0,001).
Пациенты, которым были проведены повторное хирургическое лечение и/или нехирургическое лечение по поводу продолженного роста/ рецидива опухоли, также имели более высокий риск рецидива (p<0,003), и практически все из них имели рост опухоли в течение 3 лет, как отражено на рис. 2.
Другие клинические факторы, такие как пол (p<0,804), возраст менее 5 лет (p<0,391), хиаз-мальная локализация опухоли (p<0,208), оказались статистически незначимыми.
Характерные черты, определенные при гистологическом исследовании микропрепаратов — диффузный рост в перифокальной зоне и наличие признаков анаплазии, оказывали значимое влияние на биологическое поведение опухоли. Пациенты, у которых были выявлены очаги диффузного роста опухоли и признаки анаплазии, достоверно чаще имели рецидивы / прогрессию опухолей, и их бессобытийная выживаемость составляла 10±9 против 91±9% (p<0,001) и 42±13 против 53±13% (p<0,022) соответственно (рис. 3, 4).
Однофакторный анализ также подтвердил значение молекулярных событий для оценки прогноза пациентов с глиомами.
Гиперэкспрессия pERK1/2 как следствие выраженной пролиферации опухолевых клеток из-за активации MAPK-сигнального пути является негативным прогностическим фактором (рис. 5): такие пациенты более склонны к рецидиву / продолженному росту опухоли, их бессобытийная выживаемость значимо ниже и составляет 0 против 81±12% у пациентов, не имеющих данного признака (p<0,0001).
38
Рис. 3. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от наличия зон диффузного роста
Fig. 3. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on diffuse growth
100
4 5 6 7 8 9 10 Годы
Примечание. р<0,001.
— Очаговый рост, n=37, без событий — 35; 91±7%
— Диффузный рост, n=27, без событий — 11; 10±9% Note. р<0,001.
— Focal growth, n=37, without events — 35; 91±7%
— Diffuse growth, n=27, without events — 11; 10±9%
Рис. 4. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от наличия признаков анаплазии
Fig. 4. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on the signs of anaplasia
100 у
90-
70-
X
и о 60-
OS о 50-
0> ва 40-
к
с зо-
Ч
20-
ю-
о4
5
Годы
8 9 10
Примечание. р<0,0022.
— Анаплазия, n=61, без событий — 50; 53±13%
— Без признаков анаплазии, n=29, без событий — 18; 42±13% Note. р<0,0022.
— Anaplasia, n=61, without events — 50; 53±13%
— Without anaplasia, n=29, without events — 18; 42±13%
Рис. 5. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от наличия гиперэкспрессии pERK1/2
Fig. 5. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on overexpression pERK1/2
100 -
8
10
4 5 Годы
Примечание. р<0,0001.
— Нет гиперэкспрессии pERK1/2, n=49, без событий — 47; 81±12%
— Гиперэкспрессия pERK1/2, n=41, без событий — 21; 0% Note. р<0,0001.
— Absence of overexpression pERK1/2, n=49, without events — 47; 81±12%
— Overexpression pERK1/2, n=41, without events — 21; 0%
Рис. 6. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от наличия BRAFV600E
Fig. 6. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on BRAF V600E
100-
Примечание. р<0,0001.
— BRAF V600E (-), n=68, без событий — 59; 71±11%
— BRAF V600E (+), n=22, без событий — 9; 0% Note. р <0,0001.
— BRAF V600E (-), n=68, without events — 59; 71±11%
— BRAF V600E (+), n=22, without events — 9; 0%
39
В нашем исследовании наличие мутации BRAF V600E оказывало негативное влияние на выживаемость пациентов: 0 против 71±11%; р<0,0001 (рис. 6).
Для анализа влияния делеции CDKN2A оценивали данные 70 пациентов, которым определяли все три молекулярных маркера (pERK1/2, BRAF V600E, delCDKN2A). Бессобытийная выживаемость пациентов, в ткани которых была выявлена делеция, была ниже, чем у остальной группы: 30±17 против 44±15%; p<0,0099 (рис. 7).
С учетом того, что молекулярные нарушения влияют на морфологический фенотип опухоли, было проведено исследование корреляционных зави-
симостей по Спирмену. Как и ожидалось, наличие молекулярных изменений — гиперэкспрессия pERK1/2 — было взаимосвязано с диффузным ростом (г=0,6914) и наличием анаплазии (г=0,5150). Также гиперэкспрессия pERK1/2, являясь следствием мутации BRAF V600E, сильно коррелировала и с этим признаком (г=0,6218).
Для построения модели многофакторного анализа были выбраны следующие факторы: радикальность проведенного хирургического лечения, наличие одного из молекулярных маркеров (BRAF V600E или delCDKN2A), выполнение повторного лечения. Для анализа использовались данные 70 пациентов, которым были определены все молеку-
Рис. 7. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в зависимости от наличия delCDKN2A
Fig. 7. Event-free survival of patients with low-grade gliomas depending on delCDKN2A
Рис. 8. Бессобытийная выживаемость пациентов с низкозлокачественными глиомами в благоприятной и неблагоприятной группах риска
Fig. 8. Event-free survival of patients with low-grade gliomas in favorable and unfavorable risk groups
100
Примечание. р<0,0099.
— delCDKN2A (-), n=61, без событий — 48; 44±15%
— delCDKN2A (+), n=9, без событий — 4; 30±17% Note. р<0,0099.
— delCDKN2A (-), n=61, without events — 48; 44±15%
— delCDKN2A (+), n=9, without events — 4; 30±17%
лярные маркеры. Проведенный многофакторный анализ показал, что нерадикальное удаление опухоли и наличие одного из молекулярных маркеров повышают риск развития рецидива в 6,99 и 5,53 раза соответственно. Результаты многофакторного анализа отражены в табл. 2. Повторные операции достоверно не влияли на рецидив в данной модели, возможно, вследствие того что практически все эти больные имели молекулярные нарушения.
Таким образом, представления о молекулярных изменениях в опухолях в совокупности с клиническими данными позволяет спрогнозировать их биологическое поведение и создать новую схему стратификации на группы риска возникновения рецидива/прогрессии низкозлокачественных глиом у детей. Так, в группу высокого риска возникновения рецидива можно отнести пациентов с нерадикаль-
Таблица 2. Результаты многофакторного анализа данных
Table 2. Results of the multivariate analysis
Параметры Отношение рисков 95% доверительные интервалы p
Радикальность
• R0 1 - -
• R1/2 6,99 1,52-32,18 0,013
Наличие BRAF V600E или delCDKN2a
• нет 1 - -
• есть 5,53 1,65-18,49 0,005
Повторное лечение
• нет 1 - -
• есть 0,53 0,16-1,78 0,305
Примечание. p<0,001
— Благоприятная группа риска, n=54 (77,1%), без событий — 49; 74±17%
— Неблагоприятная группа риска, n=16 (22,9%), без событий — 3; 0%
Note. p<0,001
— Favorable risk group, n=54 (77,1%), without events — 49; 74±17%
— Unfavorable risk group, n=16 (22,9%), without events — 3; 0%
но удаленной опухолью или с повторным лечением и наличием одного из молекулярных маркеров — BRAF V600E или delCDKN2A. Анализ бессобытийной выживаемости Каплана-Майера подтверждает данную гипотезу ^<0,001). Согласно данной схеме стратификации, бессобытийная выживаемость пациентов благоприятной группы риска составляет 77,1%, неблагоприятной — 22,9% (рис. 8).
Дополнительные результаты исследования
С целью определения возможной причины анапластических изменений в ткани астроцитом проводилось дополнительное иммуногистохимиче-ское исследование с антителами к ATRX, ЮН1ти: Н3к27те в подгруппе астроцитом с признаками анаплазии. В ткани данных опухолей часто определялись изменения экспрессии маркеров: в 24 опухолях была выявлена гиперэкспрессия pERK1/2, в 14 — экспрессия VEI-1, в 8 — экспрессия р53, в 3 — утрата экспрессии ATRX, в 7 случаях при цитогенетическом исследовании наблюдалась делеция CDKN2A. Ни в одном случае не было выявлено изменений экспрессии Н3К27те и ЮН1ти: Различия в экспрессии маркеров в зависимости от наличия признаков анаплазии было статистически значимым при оценке с помощью критерия хи-квадрат: при оценке гиперэкспрессии pERK1/2 — р<0,0001, делеции CDKN2A — р<0,0099, BRAF V600E — р<0,0001, ATRX — р<0,001.
ОБСУЖДЕНИЕ
Резюме основного результата исследования
Прогностическая значимость различных факторов изучалась в достаточном количестве исследований, однако на сегодняшний момент,
40
к сожалению, не найдено единого показателя или подобного сочетания, однозначно позволяющих оценить прогноз течения заболевания и риск развития его рецидива, что побудило к проведению данного исследования. Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о том, что в качестве негативных предикторов низкозлокачественных глиом могут рассматриваться мутация BRAF V600E, делеция CDKN2A и нерадикальное удаление опухоли.
Обсуждение основного результата
исследования
В настоящее время предпринимаются активные попытки сопоставить специфические геномные изменения с клиническими исходами пилоцитарных астроцитом. Решающую роль в прогрессировании или злокачественной трансформации астроцито-мы может сыграть аберрантная регуляция каскадов MAPK. Эффекторное звено MAPK-каскада — p44/42 ERK1/2 — участвует в контроле клеточной пролиферации. Было показано, что его устойчивая активация необходима для развития клеточного цикла от фазы G1 к S-фазе. В исследовании C. Pelloski и соавт. гиперактивация ERK1/2 чаще определялась в ткани высокозлокачественных, чем низкозлокачественных, глиом. Кроме того, высокая экспрессия p44/42 ERK1/2 была значительно связана с уменьшением общей выживаемости в высокозлокачественных опухолях [13, 16].
Таким образом, выявленные в нашем исследовании статистически значимо более высокие уровни экспрессии pERK1/2 во фрагментах ткани астроцитом с признаками прогрессирования по сравнению с образцами ткани астроцитом со стабильным течением совпадают с данными, приведенными в современной научной литературе, и позволяют рассматривать гиперэкспрессию pERK1/2 в качестве маркера выхода из состояния клеточного старения и, соответственно, возможного показателя риска развития рецидива детских низкозлокачественных астроцитом.
Результаты исследований влияния мутации BRAF V600E на прогноз противоречивы. При исследовании случаев пилоцитарной астроцитомы в группе из 146 пациентов с помощью многовариантного анализа данных удалось определить, что наличие транслокации KIAA1549-BRAF в отличие от опухолей с мутацией BRAF V600E является наиболее значимым благоприятным прогностическим фактором в педиатрических низкозлокачественных глиомах после субтотальной резекции [17]. Другое исследование, включающее 106 случаев детских низкозлокачественных глиом, не показало достоверной статистической разницы в безрецидивной выживаемости среди опухолей с мутацией BRAF V600E по сравнению с опухолями другой генетической природы [18].
В нашем исследовании удалось установить статистически значимую ассоциацию частоты мутации
BRAF V600E с более низкой безрецидивной выживаемостью детских низкозлокачественных глиом (0 против 71±11%, р<0,0001), что соответствует литературным данным. Некоторые исследователи связывают неблагоприятное влияние мутации BRAF V600E в сравнении со случаями с транслокацией KIAA1549-BRAF с тем, что пилоцитарные астроцитомы с мутацией имеют тенденцию к диффузному росту, что определяет их нерезектабельность и приводит к более частым рецидивам [19].
Как один из вероятных молекулярных факторов, приводящих к злокачественной трансформации глиом, может рассматриваться делеция гена CDKN2A (также известного как p16). CDKN2A — это ген-онкосупрессор, расположенный на коротком плече 9-й хромосомы (9p21), который функционирует как отрицательный регулятор клеточного цикла G1. CDKN2A кодирует у людей p16INK4a и p14ARF. Делеция гена CDKN2A является достаточно частой находкой в ткани высокозлокачественных глиом у взрослых, но может также наблюдается в ткани детских высокозлокачественных астроцитом, хотя и с меньшей частотой [20, 21].
Потеря CDKN2A чаще встречается в ткани опухолей с мутацией BRAF V600E, что говорит о наличии синергического взаимодействия между этими двумя аберрациями, приводящего к прогрессиро-ванию опухоли [20-22]. В нескольких сообщениях показано, что астроцитомы 1-й степени злокачественности с делецией CDKN2A имеют у детей более агрессивное клиническое поведение, соответствующее более высокой степени злокачественности [23-25]. Известно, что сочетание мутации BRAF V600E с делецией CDKN2A характерно для отдельной подгруппы детских высокозлокачественных глиом [26]. Среди исследуемой нами когорты пациентов одновременное наличие делеции CDKN2A и мутации BRAF V600E было выявлено в 4 случаях, при этом у всех больных наблюдались опухолевая прогрессия, агрессивное клиническое поведение, и 2 пациента умерли. Безрецидивная выживаемость пациентов, в опухолях которых были найдены либо мутация BRAF V600E, либо делеция CDKN2A, также была более низкой по сравнению с пациентами без данных маркеров.
Клиническое значение наличия черт анаплазии при светооптическом исследовании остается неизвестным. В одном из последних исследований при изучении 2200 случаев пилоцитарных астроцитом 34 были отнесены к категории анапластических пилоцитарных астроцитом по критериям высокой митотической активности (более 4 митозов на 10 полей зрения), гиперклеточности, выраженной цитологической атипии, наличию очагов некроза. В 24% указанных случаев имелись указания на наличие нейрофиброматоза 1-го типа, в 12% — на предшествующую лучевую терапию. В данной работе биологическое поведение пилоцитарных астроцитом с анаплазией соответствовало поведению анапластических диффузных астроцитом [27].
41
Появление признаков анаплазии связывают с возможными дополнительными молекулярными нарушениями. F. Rodriguez и соавт. определили в ткани пилоцитарных астроцитом с чертами ана-плазии наличие ALT-фенотипа в 69% случаев, мутацию Н3К27 в сочетании с ALT-фенотипом — в 16%, мутация BRAF V600E присутствовала лишь в 31% опухолей, при этом доля пациентов с нейрофибро-матозом 1-го типа составляла 22% [28]. В другом крупном исследовании, которое включало 102 случая анапластических астроцитом с пилоидными чертами, наиболее частыми молекулярными нарушениями были делеция CDKN2A/B (80% случаев), изменения в работе MAPK-сигнального пути, в том числе нейрофиброматоз 1-го типа (75%), и мутации или потеря ATRX (45%) [29]. В нашей работе также выявлена значимая ассоциация признаков анапла-зии с наличием дополнительных генетических маркеров, включающих гиперэкспрессию pERK1/2 во всех случаях, наличие мутации BRAF V600E в 58% случаев, делецию CDKN2A или моносомию хромосомы 9 в 29%, утрату экспрессии ATRX в 12,5%. При этом клинические предпосылки для развития анапластического фенотипа были выявлены лишь в 3 случаях из 24: у 2 пациентов был выставлен диагноз нейрофиброматоза, у 1 больного ранее проводилась лучевая терапия.
лирующие с наличием молекулярных маркеров. Совокупность вышеуказанных признаков (наличие одного из молекулярных маркеров — BRAF V600E или делеции CDKN2A — и нерадикального удаления или повторного лечения опухоли) позволяет выделить группу пациентов с неблагоприятным прогнозом.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Исследование выполнено за счет средств республиканского бюджета в рамках НИР «Разработать и внедрить комплексный метод прогнозирования биологического поведения нейроэпителиальных опухолей у детей, основанный на выявлении моле-кулярно-генетических маркеров» (2016-2019) государственной научно-технической программы «Новые методы оказания медицинской помощи».
FINANCING SOURCE
The study was carried out at the expense of the national budget within the research «Development and implementation a comprehensive method for predicting the biological behavior of neuroepithelial tumors in children, based on the identification of molecular genetic markers» (2016-2019) of the state scientific and technical program «New methods of providing medical care».
Ограничения исследования
Полученные в ходе нашего исследования данные ограничены малым сроком наблюдения за пациентами, что могло привести к уменьшению числа неблагоприятных исходов. Необходимо продолжить наблюдение за пациентами, которым была проведена диагностика исследуемых молекулярных маркеров, а также набор пациентов в исследуемую группу.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенный анализ позволил выявить возможные прогностические факторы, оказывающие влияние на риск возникновения рецидивов пилоци-тарной астроцитомы и плеоморфной ксантоастро-цитомы. К данным факторам относятся гиперэкспрессия pERK1/2 и наличие мутации BRAF V600E, делеция CDKN2A, нерадикальность удаления, проведение повторного лечения, а также признаки анаплазии и участки диффузного роста, корре-
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
CONFLICT OF INTERESTS
Not declared.
ВКЛАД АВТОРОВ
^М. Михалевская — разработка концепции и дизайна статьи, сбор и обработка данных, проведение иммуногистохимического исследования, статистическая обработка данных, анализ и интерпретация данных, написание текста рукописи, составление резюме.
Е.В. Волочник — проведение цитогенетических исследований, анализ и интерпретация данных.
О.И. Быданов — статистическая обработка данных.
Н.Е. Конопля — анализ и интерпретация данных, научное редактирование статьи.
42
ЛИТЕРАТУРА
1. Chalil A, Ramaswamy V. Low grade gliomas in children. J Child Neurol. 2016;31(4):517-522. doi: 10.1177/0883073815599259.
2. Louis DN, Perry A, Burger P, et al. International Society Of Neuropathology-Haarlem consensus guidelines for nervous system tumor classification and grading. Brain Pathol. 2014;24(5):429-435. doi: 10.1111/ bpa.12171.
3. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 2007;114(2):97-109. doi: 10.1007/s00401-007-0243-4.
4. Listernick R, Charrow J, Greenwald MJ, Esterly NB. Optic gliomas in children with neurofibromatosis type 1. J Pediatr. 1989;114:788-792. doi: 10.1212/01. WNL.0000144341.16830.01.
5. Rao AAN, Laack NN, Giannini C, Wetmore C. Pleomorphic xanthoastrocytoma in children and adolescents. Pediatr Blood Cancer. 2010;55(2):290-294. doi: 10.1002/pbc.22490.
6. Schindler G, Capper D, Meyer J, et al. Analysis of BRAF V600E mutation in 1,320 nervous system tumors reveals high mutation frequencies in pleomorphic xanthoastrocytoma, ganglioglioma and extra-cerebellar pilocytic astrocytoma. Acta Neuropathol. 2011;121(3):397-405. doi: 10.1007/s00401-011-0802-6.
7. Sievert AJ, Fisher MJ. Pediatric low-grade glio-mas. J Child Neurol. 2009;24:1397-1408. doi: 10.1177/0883073809342005.
8. Wisoff JH, Sandford RA, Heier LA, et al. Primary neurosurgery for pediatric low-grade gliomas: a prospective multi-institutional study from the Children's Oncology Group. Neurosurgery. 2011;68:1546-1555. doi: 10.1227/NEU.0b013e318214a66e.
9. Gajjar A, Sanford RA, Heideman R, et al. Low-grade astrocytoma: a decade of experience at St. Jude Children's Research Hospital. J Clin Oncol. 1997;15:2792-2799. doi: 10.1200/JCO.1997.15.8.2792.
10. Armstrong GT, Conklin HM, Huang S, et al. Survival and long-term health and cognitive outcomes after low-grade glioma. Neuro Oncol. 2011;13:223-234. doi: 10.1093/neuonc/noq178.
11. Fisher PG, Tihan T, Goldthwaite PT, et al. Outcome analysis of childhood low-grade astrocytomas. Pediatr Blood Cancer. 2008;51:245-250. doi: 10.1002/ pbc.21563.
12. Bergthold G, Bandopadhayay P, Wenya LB, et al. Pediatric low-grade gliomas: How modern biology reshapes the clinical field. Biochim Biophys Acta. 2014;1845(2):294-307. doi: 10.1016/j. bbcan.2014.02.004.
13. Zolota V, Sirinian C, Kefalopoulou Z, et al. Mitogen-activated protein kinases in gliomas and correlation with patients' prognosis. Acta Neurol Scand. 2014;129:226-233. doi: 10.1111/ane.12175.
14. Reis FG, Pekmezci M, Hansen HM, et al. CDKN2A loss is associated with shortened overall survival in lower grade (World Health Organization II-III) astrocytomas. J Neuropathol Exp Neurol. 2015;74(5):442-452. doi: 10.1097/NEN.0000000000000188.
15. Chung CT, Santos GC, Hwang DM, et al. FISH assay development for the detection of p16/CDKN2A deletion in malignant pleural mesothelioma. J Clin Pathol. 2010;63(7):630-634. doi: 10.1136/ jcp.2010.076794.
16. Pelloski CE, Lin E, Zhang L, et al. Prognostic associations of activated mitogen-activated protein kinase and akt pathways in glioblastoma. Clin Cancer Res. 2006;12:3935-3941. doi: 10.1158/1078-0432. CCR-05-2202.
17. Hawkins C, Walker E, Mohamed N, et al. BRAF-KIAA1549 fusion predicts better clinical outcome in pediatric low-grade astrocytoma. Clin Cancer Res. 2011;17:4790-4798. doi: 10.1158/1078-0432. CCR-11-0034.
18. Lin A, Rodriguez FJ, Karajannis MA, et al. BRAF alterations in primary glial and glioneuronal neoplasms of the central nervous system with identification of 2 novel KIAA1549: BRAF fusion variants. J Neuropathol Exp Neurol. 2012;71:66-72. doi: 10.1097/NEN.0b013e31823f2cb0.
19. Bannykh SI, Mirocha J, Nuno M, et al. V600E BRAF mutation in pilocytic astrocytoma is associated with a more diffuse growth pattern but does not confer a more aggressive clinical behavior. Clin Neuropathol. 2014,33(6):388-398. doi: 10.5414/ NP300753.
20. Horbinski C, Nikiforova MN, Hagenkord JM, et al. Interplay among BRAF, p16, p53, and MIB1 in pediatric low-grade gliomas. Neurooncol. 2012;14(6):777-789. doi: 10.1093/neuonc/nos077.
21. Bax DA, Mackay A, Little SE, et al. A distinct spectrum of copy number aberrations in pediatric high-grade gliomas. Clin Cancer Res. 2010;16(13):3368-3377. doi: 10.1158/1078-0432.
22. Schiffman JD, Hodgson JG, Vanden-Berg SR, et al. Oncogenic BRAF mutation with CDKN2A inactivation is characteristic of a subset of pediatric malignant astrocytomas. Cancer Res. 2010;70:512-519. doi: 10.1158/0008-5472.
23. Horbinski C, Hamilton RL, Nikiforov Y, Pollack IF. Association of molecular alterations, including BRAF, with biology and outcome in pilocytic astrocytomas. Acta Neuropathol. 2010;119:641-649. doi: 10.1007/s00401-009-0634-9.
24. Broniscer A, Baker SJ, West AN, et al. Clinical and molecular characteristics of malignant transformation of low-grade glioma in children. J Clin Oncol. 2007;25:682-689. doi: 10.1200/ JCO.2006.06.8213.
25. Ryall S, Tabori U, Hawkins C. A comprehensive review of paediatric low-grade diffuse glioma: pathology, molecular genetics and treatment. Brain Tumor Pathology. 2017;34(20):51-61.doi: 10.1007/ s10014-017-0282-z.
26. Mistry M, Zhukova N, Merico D, et al. BRAF mutation and CDKN2A deletion high grade glioma. J Clin Oncol. 2015;33(9):1015-1022. doi: 10.1200/ JCO.2014.58.3922.
27. Rodriguez FJ, Scheithauer BW, Burger PC, et al. Anaplasia in pilocytic astrocytoma predicts aggressive behavior. Am J Surg Pathol. 2010;34(2):147-160. doi: 10.1097/PAS.0b013e3181c75238.
28. Rodriguez FJ, Brosnan-Cashman JA, Allen SJ, et al. Alternative lengthening of telomeres, ATRX loss and H3-K27M mutations in histologically defined pilocytic astrocytoma with anapla-sia. Brain Pathol. 2019;29(1):126-140. doi: 10.1111/bpa.12646.
29. Reinhardt A, Stichel D, Schrimpf D, et al. Anaplastic astrocytoma with piloid features, a novel molecular class of IDH wildtype glioma with recurrent MAPK pathway, CDKN2A/B and ATRX alterations. Acta Neuropathol. 2018;136(2):273-291. doi: 10.1007/ s00401-018-1837-8.
43
44
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Михалевская Таисия Михайловна, научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минская область, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43, тел.: +375 (17) 265-40-79, e-mail: [email protected], SPIN-код: 8677-3160, ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7134-8923
ВолочникЕлена Викторовна, старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минская область, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43, e-mail: [email protected], SPIN-код: 1557-1144, ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2474-0575
Конопля Наталья Евгеньевна, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований и заместитель директора по клинике Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минская область, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0592-7182
Быданов Олег Иванович, научный сотрудник научного отдела Республиканского научно-практического центра детской онкологии, гематологии и иммунологии
Адрес: 223053, Республика Беларусь, Минская область, д. Боровляны, ул. Фрунзенская, д. 43, e-mail: [email protected], ORCID: https://orcid.org/0000-0003-3232-2322
