Научная статья на тему 'Клиническое значение анализа субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей'

Клиническое значение анализа субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

CC BY
238
54
Поделиться
Журнал
Онкопедиатрия
ВАК
Ключевые слова
СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ / НОРМАЛЬНЫЙ КОСТНЫЙ МОЗГ / Т-ЛИМФОЦИТЫ / NK-КЛЕТКИ / TCRγδ-ЛИМФОЦИТЫ / РАБДОМИОСАРКОМА / ОПУХОЛИ СЕМЕЙСТВА САРКОМЫ ЮИНГА / TCRγδ LYMPHOCYTES

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Горбунова Татьяна Викторовна, Поляков Владимир Георгиевич, Тупицын Николай Николаевич, Серебрякова Ирина Николаевна, Тимошенко Валентина Владимировна, Шведова Тамара Викторовна

В последние годы показана важная роль клеток костного мозга в процессе канцерогенеза и метастазирования. В этой связи изучение иммунологических аспектов функционирования клеток костного мозга представляется особенно интересным. Целью работы явилось изучение клинически значимых особенностей субпопуляционного состава зрелых лимфоцитов костного мозга у детей, больных рабдомиосаркомой и опухолями семейства саркомы Юинга (ОССЮ). Материалы и методы. В исследование включено 49 детей от 1 года до 17 лет. У 34 пациентов диагноз рабдомиосаркомы или ОССЮ подтвержден морфологическими и иммуногистохимическими методами. У 15 детей в ходе проведенного комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был отвергнут (группа сравнения). Всем пациентам выполнено цитологическое и иммунологическое исследование костного мозга. Результаты. Характерным для субпопуляционного состава костного мозга при рабдомиосаркоме у детей при сопоставлении с группой сравнения является повышение уровней активированных Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+HLA-DR+) 37,1 и 12,2%; р = 0,001; повышение популяции зрелых γδT-клеток 15,8 и 9,2%; р = 0,007, а также снижение в два раза популяции Т-хелперных клеток (CD4+), экспрессирующих молекулу адгезии CD62L (Leu8) 17,6 и 33,5%; р = 0,015, соответственно. Субпопуляционный состав костного мозга при ОССЮ у детей отличался от значений в группе сравнения повышением уровня зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов 68,5 и 50,5%; р = 0,000 и снижением CD4+ Т-хелперных клеток 26,9 и 39,3%; р = 0,01, соответственно, что отразилось на более низких уровнях иммунорегуляторного индекса. В группе детей с ОССЮ цитотоксическая субпопуляция зрелых Т-лимфоцитов отличалась признаками активации на основании экспрессии HLA-DR (р = 0,001), но не на основании экспрессии CD25 в сравнении с контрольной группой. Снижение уровней экспрессии молекулы адгезии CD62L (Leu8) на Т-лимфоцитах костного мозга больных саркомой Юинга в сравнении с нормой было обусловлено в основном достоверными различиями в субпопуляции CD4+CD62L+ Т-клеток 13,7 ± 2,4 и 30,5 ± 5,2; р = 0,005. Содержание Т-цитотоксических лимфоцитов CD3+ CD8+CD57+ костного мозга при ОССЮ у детей было повышено при сопоставлении с результатами в группе сравнения (р = 0,028). На основании проведенного анализа установлены достоверные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и ОССЮ у детей. При ОССЮ выявлено преобладание Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) 68,5 и 50,5%; р = 0,001 и более низкие уровни TCRγδ-лимфоцитов 10,0 и 15,8%; р = 0,01, соответственно. При сопоставлении субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме с факторами прогноза установлены достоверные различия. При распространенных стадиях рабдомиосаркомы у детей по сравнению с локализованными опухолями выявлено повышение уровня CD62L-позитивных зрелых Т-лимфоцитов 69,8 и 35,5%; р = 0,016, снижение NK-клеток 18,6 и 6,9%; р = 0,039 и γδT-лимфоцитов 18,5 и 11,0%; р = 0,019, соответственно. Сопоставительный анализ уровня субпопуляций лимфоцитов костного мозга при ОССЮ показал снижение количества активированных (CD38+) Т-цитотоксических клеток 41,7 и 63,2%; р = 0,024 и γδT-лимфоцитов 7,6 и 12,9%; р = 0,016 у пациентов из группы высокого риска. Вывод. Проведенное нами исследование выявило различия субпопуляционного состава лимфоидных клеток у детей при рабдомиосаркоме и ОССЮ от показателей в группе детей без признаков злокачественной опухоли. Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и ОССЮ у детей взаимосвязан с факторами прогноза. Полученные данные свидетельствуют о возможности формирования групп пациентов для проведения иммуномодулирующей терапии.

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Горбунова Татьяна Викторовна, Поляков Владимир Георгиевич, Тупицын Николай Николаевич, Серебрякова Ирина Николаевна, Тимошенко Валентина Владимировна, Шведова Тамара Викторовна,

THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF THE BONE MARROW''S LYMPHOCYTE SUBSET ANALYSIS UNDER RHABDOMYOSARCOMA AND EDWING SARCOMA FAMILY OF TUMORS IN CHILDREN

Resume. In recent years the important role of bone marrow cells in carcinogenesis and metastasis has been displayed. In this regard, the study of the immunological aspects of the functioning of bone marrow cells is particularly interesting. The purpose of this study was to analyze clinically significant specificity of composition of mature lymphocyte subsets in bone marrow from children with rhabdomyosarcoma and Ewing’s sarcoma family of tumors (ESFT). Materials and methods. A total of 49 children aged 1 to 17 years were enrolled in this study. The diagnosis of rhabdomyosarcoma or ESFT was verified morphologically or immunohistochemically in 34 cases. Malignancywas excluded basing on complex assessment in 15 cases (comparator group). All patients underwent cytological and immunological study of bone marrow. Results. Children with rhabdomyosarcoma as compared with the comparator group demonstrated elevated levels of activated T-cytotoxic cells (CD3+CD8+HLA-DR+) (37,1 vs 12,2%, p = 0,001), increased proportion of mature γδT-cells (15,8% vs 9,2%, p = 0,007) and 2-fold decreased population of T-helpers (CD4+) expressing adhesion molecule CD62L (Leu8) (17,6 vs 33,5%, p = 0,015) in their bone marrow. Bone marrow subset composition in patients with ESFT was different from that of the comparator group by elevated levels of mature T-cytotoxic lymphocytes (68,5 vs 50,5%, p = 0,000) and decreased proportion of CD4+ T-helpers (26,9 vs 39,3%, p = 0,01) as also reflected bellower levels of immunoregulatory index. In children with ESFT the cytotoxic mature T-lymphocyte subset was characterized by activation signs basing on HLA-DR expression (p = 0,001) rather than on CD25 expression as compared with the control. Significant differences in CD4+CD62L+ T-cell subset mainly accounted for the decreased expression of adhesion molecule CD62L (Leu8) on bone marrow T-lymphocytes (13,7 ± 2,4 vs 30,5 ± 5,2%, p = 0,005). Children with ESFT presented with elevated levels of bone marrow T-cytotoxic lymphocytes CD3+CD8+CD57+ as compared to the control (p = 0,028). The analysis discovered significant differences in bone marrow lymphocyte subsets between children with rhabdomyosarcoma and with ESFT. Cases with ESFT were characterized by predominance of T-cytotoxic cells CD3+CD8+ (68,5 vs 50,5%, p = 0,001) and lower levels of TCRγδ-lymphocytes (10,0 vs 15,8%, p = 0,01). Significant correlation was discovered between bone marrow lymphocyte subset composition and prognostic factors in rhabdomyosarcoma. Children with advanced rhabdomyosarcoma as compared with localized disease had elevated levels of CD62L+ mature T-lymphocytes (69,8 vs 35,5%, p = 0,016), decreased levels of NK-cells (18,6 vs 6,9%, p = 0,039) and γδT-lymphocytes (18,5 vs 11,0%, p = 0,019). ESFT patients at high risk demonstrated decreased levels of activated (CD38+) T-cytotoxic cells (41,7 vs 63,2%, p = 0,024) and γδTlymphocytes (7,6 vs 12,9%, p = 0,016). Conclusion. Our findings showed that lymphoid cell subset composition in children with rhabdomyosarcoma or ESFT differed from that in children free from malignancy. Principal bone marrow effector cell subsets were identified in children with rhabdomyosarcoma and ESFT. Our analysis provides basis for stratification of patients for immunomodulating therapy.

Текст научной работы на тему «Клиническое значение анализа субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей»

Т.В. Горбунова, В.Г. Поляков, Н.Н. Тупицын, И.Н. серебрякова, В.В. Тимошенко, Т.В. шведова

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва, Российская Федерация

Клиническое значение анализа субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей

В последние годы показана важная роль клеток костного мозга в процессе канцерогенеза и метастазирования. В этой связи изучение иммунологических аспектов функционирования клеток костного мозга представляется особенно интересным. Целью работы явилось изучение клинически значимых особенностей субпопуляционного состава зрелых лимфоцитов костного мозга у детей, больных рабдомиосаркомой и опухолями семейства саркомы Юинга (ОССЮ). Материалы и методы. В исследование включено 49 детей от 1 года до 17 лет. У 34 пациентов диагноз рабдомиосаркомы или ОССЮ подтвержден морфологическими и иммуногистохимическими методами. У 15 детей в ходе проведенного комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был отвергнут (группа сравнения). Всем пациентам выполнено цитологическое и иммунологическое исследование костного мозга. Результаты. Характерным для субпопуляционного состава костного мозга при рабдомиосаркоме у детей при сопоставлении с группой сравнения является повышение уровней активированных Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+HLA-DR+) — 37,1 и 12,2%; р = 0,001; повышение популяции зрелых убТ-клеток — 15,8 и 9,2%; р = 0,007, а также снижение в два раза популяции Т-хелперных клеток (CD4+), экспрессирующих молекулу адгезии CD62L (Leu8) — 17,6 и 33,5%; р = 0,015, соответственно. Субпопуляционный состав костного мозга при ОССЮ у детей отличался от значений в группе сравнения повышением уровня зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов — 68,5 и 50,5%; р = 0,000 и снижением CD4+ Т-хелперных клеток — 26,9 и 39,3%; р = 0,01, соответственно, что отразилось на более низких уровнях иммунорегуляторного индекса. В группе детей с ОССЮ цитотоксическая субпопуляция зрелых Т-лимфоцитов отличалась признаками активации на основании экспрессии HLA-DR (р = 0,001), но не на основании экспрессии CD25 в сравнении с контрольной группой. Снижение уровней экспрессии молекулы адгезии CD62L (Leu8) на Т-лимфоцитах костного мозга больных саркомой Юинга в сравнении с нормой было обусловлено в основном достоверными различиями в субпопуляции CD4+CD62L+ Т-клеток — 13,7 ± 2,4 и 30,5 ± 5,2; р = 0,005. Содержание Т-цитотоксических лимфоцитов CD3+ CD8+CD57+ костного мозга при ОССЮ у детей было повышено при сопоставлении с результатами в группе сравнения (р = 0,028). На основании проведенного анализа установлены достоверные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и ОССЮ у детей. При ОССЮ выявлено преобладание Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) — 68,5 и 50,5%; р = 0,001 и более низкие уровни ТСНуб-лимфоцитов — 10,0 и 15,8%; р = 0,01, соответственно. При сопоставлении субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме с факторами прогноза установлены достоверные различия. При распространенных стадиях рабдомиосаркомы у детей по сравнению с локализованными опухолями выявлено повышение уровня CD62L-позитивных зрелых Т-лимфоцитов — 69,8 и 35,5%; р = 0,016, снижение NK-клеток — 18,6 и 6,9%; р = 0,039 и убТ-лимфоцитов — 18,5 и 11,0%; р = 0,019, соответственно. Сопоставительный анализ уровня субпопуляций лимфоцитов костного мозга при ОССЮ показал снижение количества активированных (CD38+) Т-цитотоксических клеток — 41,7 и 63,2%; р = 0,024 и убТ-лимфоцитов 7,6 и 12,9%; р = 0,016 у пациентов из группы высокого риска. Вывод. Проведенное нами исследование выявило различия субпопуляци-онного состава лимфоидных клеток у детей при рабдомиосаркоме и ОССЮ от показателей в группе детей без признаков злокачественной опухоли. Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и ОССЮ у детей взаимосвязан с факторами прогноза. Полученные данные свидетельствуют о возможности формирования групп пациентов для проведения иммуномодулирующей терапии. Ключевые слова: субпопуляции лимфоцитов, нормальный костный мозг, Т-лимфоциты, NK-клетки, TCRyS-лимфоциты, рабдомио-саркома, опухоли семейства саркомы Юинга.

T.v. Gorbunova, v.G. Polyakov, N.N. Tupitsyn,i.N. Serebryakova, v.v. Timoshenko, T.v. Shvedova

FSI "N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center", Moscow, Russian Federation

The Clinical Significance of the Bone Marrow's Lymphocyte Subset Analysis under Rhabdomyosarcoma and Edwing Sarcoma Family of Tumors in Children

Resume. In recent years the important role of bone marrow cells in carcinogenesis and metastasis has been displayed. In this regard, the study of the immunological aspects of the functioning of bone marrow cells is particularly interesting. The purpose of this study was to analyze clinically significant specificity of composition of mature lymphocyte subsets in bone marrow from children with rhabdomyosarcoma and Ewing’s sarcoma family of tumors (ESFT). Materials and methods. A total of 49 children aged 1 to 17 years were enrolled in this study. The diagnosis of rhabdomyosarcoma or ESFT was verified morphologically or immunohistochemically in 34 cases. Malignancywas excluded basing on complex assessment in 15 cases (comparator group). All patients underwent cytological and immunological study of bone marrow. Results. Children with rhabdomyosarcoma as compared with the comparator group demonstrated elevated levels of activated T-cytotoxic cells (CD3+CD8+HLA-DR+) (37,1 vs 12,2%, p = 0,001), increased proportion of mature убТ-cells (15,8% vs 9,2%, p = 0,007) and 2-fold decreased population of T-helpers (CD4+) expressing adhesion molecule CD62L (Leu8) (17,6 vs 33,5%, p = 0,015) in their bone marrow. Bone marrow subset composition in patients with ESFT was different from that of the comparator group by elevated levels of mature T-cytotoxic lymphocytes (68,5 vs 50,5%, p = 0,000) and decreased proportion of CD4+ T-helpers (26,9 vs 39,3%, p = 0,01) as also reflected bellower levels of immunoregulatory index.

In children with ESFT the cytotoxic mature T-lymphocyte subset was characterized by activation signs basing on HLA-DR expression (p = 0,001) rather than on CD25 expression as compared with the control. Significant differences in CD4+CD62L+ T-cell subset mainly accounted for the decreased expression of adhesion molecule CD62L (Leu8) on bone marrow T-lymphocytes (13,7 ± 2,4 vs 30,5 ± 5,2%, p = 0,005). Children with ESFT presented with elevated levels of bone marrow T-cytotoxic lymphocytes CD3+CD8+CD57+ as compared to the control (p = 0,028). The analysis discovered significant differences in bone marrow lymphocyte subsets between children with rhabdomyosarcoma and with ESFT. Cases with ESFT were characterized by predominance of T-cytotoxic cells CD3+CD8+ (68,5 vs 50,5%, p = 0,001) and lower levels of ТСЯуб-lymphocytes (10,0 vs 15,8%, p = 0,01). Significant correlation was discovered between bone marrow lymphocyte subset composition and prognostic factors in rhabdomyosarcoma. Children with advanced rhabdomyosarcoma as compared with localized disease had elevated levels of CD62L+ mature T-lymphocytes (69,8 vs 35,5%, p = 0,016), decreased levels of NK-cells (18,6 vs 6,9%, p = 0,039) and убТ-lymphocytes (18,5 vs 11,0%, p = 0,019). ESFT patients at high risk demonstrated decreased levels of activated (CD38+) T-cytotoxic cells (41,7 vs 63,2%, p = 0,024) and убТlymphocytes (7,6 vs 12,9%, p = 0,016). Conclusion. Our findings showed that lymphoid cell subset composition in children with rhabdomyosarcoma or ESFT differed from that in children free from malignancy. Principal bone marrow effector cell subsets were identified in children with rhabdomyosarcoma and ESFT. Our analysis provides basis for stratification of patients for immunomodulating therapy.

Key words: lymphocyte subsets, normal bone marrow, T-lymphocytes, NK-cells, TCRy6 lymphocytes, rhabdomyosarcoma, ESFT.

ВВЕДЕНИЕ

Лечение распространенных стадий сарком костей и мягких тканей у детей представляет сложную проблему детской онкологии. Несмотря на эскалацию интенсивности химиотерапевтических режимов, прогноз при наличии отдаленных метастазов при этих опухолях остается неблагоприятным, и общая выживаемость больных не превышает 25-30% [1, 2]. Проведение иммунной терапии у этой категории больных остается сложной и нерешенной задачей. В этой связи изучение иммунологических аспектов функционирования клеток костного мозга представляется особенно интересным.

В экспериментальных работах Г.И. Дейчман и соавт. были показаны возможности клеток костного мозга тормозить развитие метастазов. Введение суспензии клеток нормального костного мозга хомячкам с метастатическими опухолями приводило к уменьшению количества и размера легочных метастазов или к их полной редукции [3]. Дальнейшие исследования проведены на собаках: выявлена регрессия легочных метастазов при введении клеток костного мозга животным при остеосаркоме и увеличение общей выживаемости животных [4]. Н.Н. Трапезников и соавт. провели клиническое исследование у 24 больных остеосаркомой, которым после радикальной операции была выполнена трансфузия суспензии клеток аллогенного костного мозга. Период наблюдения за пациентами составил 8 лет. Более чем у 50% пациентов не выявлено метастазов через 4 года наблюдения. В этих работах сделано предположение, что клетки естественной резистентности играют роль эффекторов противоопухолевого иммунитета [5].

В последние годы открыта важная роль Т-лимфоцитов, естественных киллерных клеток (ЫК-клеток), а также некоторых особых субпопуляций лимфоцитов (например, 0028+, 0057+-клеток) в противоопухолевом иммунитете. Анализ этих субпопуляций в костном мозге детей с саркомами мягких тканей и костей не проводился.

Необходимо отметить, что в литературе недостаточно работ по сравнительной характеристике иммунокомпе-тентных клеток костного мозга у здоровых детей и детей с солидными опухолями. Проведение анализа лимфоцитарных субпопуляций костного мозга при саркомах у детей может быть использовано для разработки и совершенствования иммунотерапевтических подходов у этих больных.

цель работы — анализ клинически значимых особенностей субпопуляционного состава зрелых лимфо-

А Б

4 ю (N

Ж ■ _£Z гш (D I 6 сл сл

^ , о

100 101 102 103 104 100 101 102 103 104

Рис. 1. А — определение процентного содержания Т- (003+),

В- (0019+), ЫК-клеток (003-0056+) и 005-позитивных В-лимфоцитов в гейте зрелых лимфоцитов (0045++).

Б — субпопуляции Т-лимфоцитов в гейте 003-позитивных клеток

цитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга (ОССЮ) у детей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Иммунологическое исследование субпопуляций лимфоцитов костного мозга проведено у 49 детей, проходивших обследование и лечение в НИИ Детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н. Блохина» в период с декабря 2005 по февраль 2011 г. По результатам комплексного обследования больные были распределены на 3 группы — с рабдомиосаркомой; опухолями семейства саркомы Юинга; дети с подозрением на онкологическую патологию, у которых в ходе комплексного обследования диагноз злокачественной опухоли был исключен (группа сравнения).

Мы использовали результаты исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей группы сравнения для сопоставления с результатами, полученными у больных злокачественными опухолями. Средний возраст детей в группе сравнения составил 8,4 года (медиана 9 лет), диапазон — от 1 до 17 лет. В анализируемой группе преобладали мальчики — 11 (73,3%). Причинами обращения родителей с детьми в поликлинику НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» были воспалительные заболевания, доброкачественные опухоли, пороки развития органов и тканей. Дифференциальный диагноз у этой группы пациентов проводился в первую очередь с лимфомами, для чего и было необходимо цитологическое и иммунологическое исследование костного мозга.

Всем детям проведено комплексное обследование, включающее визуализирующие и лабораторные методы. Диагноз во всех случаях был верифицирован на основании морфологического или иммуногистохимического исследования материала первичной опухоли в отделе патологической анатомии опухолей человека. Всем больным проведено морфологическое и иммунологическое исследование костного мозга.

Математические расчеты проведены с помощью программы SPSS 15 и включали корреляционный анализ (коэффициент Пирсона), сравнение средних (критерий Стьюдента) и точный критерий Фишера с доверительным интервалом 95%. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05 (95% точности).

Иммунологические исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга. Костный мозг собирали в пробирки, импрегнированные гепарином, в объеме не более 0,5 мл во избежание контаминации периферической кровью. Сбор клеток осуществляли на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, BD; США), последующий анализ проводили с помощью программы WinMDI 2.8.

Ядросодержащие клетки костного мозга выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов (использован FACS Lysing solution, BD; США). Окраску лимфоидных популяций костного мозга проводили с использованием широкой панели моноклональных антител (трехцветная флуоресценция; BD США). Панель антител представлена в табл. 1.

При помощи проточно-цитометрического анализа определяли процент Т-, В- и NK-клеток среди зрелых лимфоцитов (CD45++; рис. 1 А). Субпопуляции Т-лимфоцитов определяли среди зрелых CD3+ Т-клеток (рис. 1 Б).

Таблица 1. Панель моноклональных антител для изучения субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей

№ пробирки Регистрируемые флюорохромы Примечание

fitc PE PE/Cy5 (PerCP)

І IgG2a IgG! №І Контроль

2 IgG2a IgG! CD45 Контроль

3 CD3 CD56 CD45 Т-клетки и ЫК-клетки

4 CD!9 CD5 CD45 В-лимфоциты

5 IgG2a IgG! CD3 Контроль в пределах Т-клеток

6 CD4 CD62L CD3 Т-хелперы, в том числе 00621_

7 CD8 CD38 CD3 Т-цитотоксические клетки, в том числе 0038

В CD8 HLA-DR CD3 Т-цитотоксические лимфоциты, в том числе Н1_А-0Р+

9 CD57 CD8 CD3 Т-цитотоксические лимфоциты, в том числе 0057

І0 CD8 CD28 CD3 Т-цитотоксические лимфоциты, в том числе 0028

ІІ TCRap CD25 CD3 ТСВар Т-лимфоциты, в том числе 0025

І2 TCRy6 CD2 CD3 ТСВуб Т-лимфоциты

Таблица 2. Результаты лечения больных рабдомиосаркомой

Результат* Количество пациентов (%)

Полный эффект В (44,5)

Частичный эффект 5 (27,В)

Стабилизация 3 (І6,7)

Отказ от лечения І (5,5)

Прогрессирование заболевания в период лечения І (5,5)

Всего ІВ (І00)

Примечание. * — рецидив после окончания лечения наступил у 1 больного, летальный исход — в 4 случаях.

Таблица 3. Распределение больных опухолями семейства саркомы Юинга в зависимости от наличия факторов риска

факторы риска Количество больных (%)

Метастазы 4 (25)

Аксиальные опухоли В (50)

Возраст старше 15 лет 4 (25)

Низкий ответ на индуктивную химиотерапию 4 (25)

Объем опухоли более 100 см3 или протяженность поражения длинной трубчатой кости более 8 см 7 (43,В)

Наличие мягкотканного компонента В (50)

Повышение уровня лактатдегидрогеназы 3 (ІВ,В)

В группу пациентов с рабдомиосаркомой включены 18 детей в возрасте от 1 года до 15 лет, из них 8 (44,4%) мальчиков и 10 (55,6%) девочек; средний возраст

7 лет. Из них первичная локализация опухоли в области головы и шеи определена у 10 (параменингеальная локализация — у 8, в том числе у 4 с интракраниальным ростом; в области орбиты — у 1, мягких тканей лица — у 1); в области малого таза — у 4 (предстательная железа — у 1); в области конечностей — у 2; паравер-тебральная локализация — у 1; не выявлена первичная локализация опухоли — у 1. Стадии заболевания соответствовали международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM (tumor, nodus

и metastasis): I — у 3, II — у 7, III — у 3, IV — у 5 пациентов. Наличие метастазов: в регионарные лимфатические узлы — у 7 (38,9%), отдаленные (легкие, костный мозг, мягкие ткани спины) — у 5 пациентов (26,6%).

Лечение пациентов проведено по международным протоколам и протоколам, утвержденным на ученых советах НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Последний пациент включен в исследование 21.02.2011. Анализ результатов лечения приведен на 24.05.2011. Эффективность лечения оценивалась соответственно стандартным критериям эффективности лечения. Результаты лечения пациентов с рабдомиосаркомой представлены в табл. 2.

Таблица 4. Результаты лечения больных опухолями семейства саркомы Юинга

Результат Количество пациентов (%)

Полный эффект 11 (68,8)

Частичный эффект 3 (18,8)

Стабилизация заболевания 1 (6,2)

Прогрессирование заболевания в период лечения 1 (6,2)

Таблица 5. Субпопуляция лимфоцитов костного мозга у детей, не имеющих онкологической патологии (группа сравнения)

30

№ маркер Количество в %, м ± m Количество пациентов*

1 003 60,8 ± 5,0 15

2 003+008+ 50,5 ± 2,4 14*

3 003+004+ 39,3 ± 2,8 14*

4 003+004+/003+008+ 0,8 ± 0,09 14*

5 005 59,2 ± 5,4 13*

6 0019 27,8 ± 4,5 15

7 0019+005+ 14,6 ± 4,2 13*

8 0020+ 25,3 ± 3,8 15

9 003- 0056+ 9,4 ± 1,7 12*

10 003+0056+ 12,6 ± 5,5 13*

11 ТСВар 86,4 ± 1,5 13*

12 ТСВуб 9,2 ± 1,4 11*

13 008+Н_Д-0Р+ 8,9 ± 1,4 11*

14 003+Н_Д-0Р+ 12,2 ± 1,9 13*

15 0025+ТСВар+ 5,6 ± 1,1 10*

16 003+0038+ 66,0 ± 7,3 11*

17 008+0038+ 34,6 ± 3,7 10*

18 008+0028+ 49,1 ± 10,3 11*

19 003+0057+ 16,9 ± 5,6 11*

20 008+0057+ 11,6 ± 5,0 10*

21 003+1_еи8+ 47,9 ± 7,5 11*

22 004+_еи8+ 17,6 ± 3,5 10*

Примечание. * — в ряде случаев обследование проведено не всем детям группы сравнения, так как количество клеток костного мозга было недостаточным для изучения всех маркеров.

В группе детей с ОССЮ (п = 16) в возрасте от 2 до 16 лет мальчиков было 11 (68,7%), девочек — 5 (31,2%); средний возраст 10,5 лет. У детей преобладала классическая саркома Юинга — у 12 (75%), примитивная нейроэктодермальная опухоль выявлена в 3 случаях (18,7%), опухоль Аскина — в 1 (6,2%). Распределение больных ОССЮ в зависимости от наличия факторов риска показано в табл. 3.

По протоколу лечения больных группы высокого риска ОССЮ лечение проведено 13 пациентам, лечение больных группы стандартного риска ОССЮ — 3 (протокол СЮ-Стандарт-2000). Результаты лечения больных ОССЮ представлены в табл. 4.

Результаты иммунологического исследования костного мозга детей группы сравнения (п = 15) представлены в табл. 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В костном мозге детей группы сравнения, не имеющих злокачественных опухолей, преобладают зрелые Т-клетки (в среднем 60,8%; см. табл. 5). Количество 003+ и 005+-лимфоцитов практически совпадает. Интересно отметить, что наименьшее содержание Т-клеток (по маркерам 003 и 005) отмечено у 1 ребенка в возрасте одного года. Это хорошо согласуется с данными литературы [6, 7]. Второй по величине (26,7%) субпопуляцией лимфоцитов костного мозга у детей являются В-клетки (0019+), третьей (в среднем 9,4%) — ЫК-клетки (0056+003-). Сумма средних процентов Т-, В- и ЫК-клеток в пределах зрелых лимфоцитов равна 96,1%, что свидетельствует о методической правильности проточно-цитометрического метода обнаружения этих популяций.

Дальнейший анализ субпопуляций Т-лимфоцитов проведен нами в гейте С03-позитивных клеток. Изучены Т-хелперные (С04+) и Т-киллерные (С08+) лимфоциты, ТСВав и ТСВуб Т-клетки, активированные лимфоциты (0025, Н1_Д-0Р, С038), а также некоторые особые субпопуляции — С057, 0028 (рис. 2).

субпопуляции лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме у детей. Сопоставление иммунологических данных у детей при рабдомиосаркоме с показателями в группе сравнения представлено в табл. 6.

Выявлены достоверные различия в уровнях активированных Т-клеток (С03+Н1_Д-0Р+); активированных Т-киллерных клеток (С03+С08+Н1_Д-0Р+); Т-клеток (003), коэкспрессирующих С04 и 1_еи8 (С0621_), а также Т-клеток (003), имеющих уб Т-клеточные рецепторы. Различия, в первую очередь, состояли в значимом увеличении при рабдомиосаркоме субпопуляции активированных Т-клеток и Т-цитотоксических клеток, а также в увеличении пропорции зрелых Т-клеток, экспрессирующих на мембране ТСВуб. При рабдомиосар-

Таблица 6. Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей, больных рабдомиосаркомой, и детей без онкологической патологии

№ маркер Группа сравнения, в %, м ± m Количество пациентов, п Рабдомиосаркома, в %, м ± m Количество пациентов, п р

1 СЭ3 60,8 ± 5,0 15 59,9 ± 4,3 18 0,89

2 С03+С08+ 50,5 ± 2,4 14 50,5 ± 3,9 16 0,99

3 С03+С04+ 39,3 ± 2,8 14 33,0 ± 2,7 15 0,12

4 С03+С04+/С03+СЭ8+ 0,8 ± 0,09 14 0,7 ± 0 ,09 15 0,39

5 СЭ5 59,2 ± 5,4 13 62,8 ± 5,1 15 0,63

6 СЭ19 27,8 ± 4,5 15 21,4 ± 4,4 18 0,4

7 С019+С05+ 14,6 ± 4,2 13 8,5 ± 2,4 14 0,17

8 СЭ20+ 25,3 ± 3,8 15 22,9 ± 6,2 5 0,52

9 СЭ3- СЭ56+ 9,4 ± 1,7 12 14,2 ± 3,5 14 0,26

10 С03+С056+ 12,6 ± 5,5 13 8,6 ± 3,3 17 0,19

11 ТСВар 86,4 ± 1,5 11 83,1 ± 1,9 11 0,19

12 ТСВуб 9,2 ± 1,4 11 15,8 ± 1,6 11 0,007

13 С08+Н1_Д-0Р+ 8,9 ± 1,4 11 28,7 ± 6,1 10 0,004

14 С03+Н1_Д-0Р+ 12,2 ± 1,9 13 37,1 ± 6,3 14 0,001

15 СЭ25+ТСРар+ 5,6 ± 1,1 10 10,6 ± 2,7 10 0,77

16 С03+С038+ 66,0 ± 7,3 11 60,0 ± 7,9 14 0,6

17 С08+С038+ 34,6 ± 3,7 10 46,0 ± 4,8 9 0,08

18 С08+С028+ 49,1 ± 10,3 11 17,8 ± 4,9 9 0,32

19 С03+С057+ 16,9 ± 5,6 11 19,6 ± 8,3 8 0,78

20 С08+С057+ 11,6 ± 5,0 10 12,2 ± 6,2 7 0,94

21 С03+1_еи8+ 47,9 ± 7,5 11 35,5 ± 7,7 11 0,08

22 С04+1_еи8+ 17,6 ± 3,5 10 13,6 ± 2,5 10 0,015

31

Примечание. Полужирным шрифтом выделены достоверные различия.

Б

СР57 ПТС

35,8%

4,6%

10е

10-1

10^ СР57 ПТС

10~

30,6% ■ Ш

--■'А/ 21,2%

10н

10и

10-1

10^ СР8 ПТС

10~

Рис. 2. Гетерогенность СЭ8+-лимфоцитов костного мозга детей по экспрессии антигенов СЭ57 (А — низкая, Б — высокая экспрессия) и СЭ28 (В). Представлены клетки в гейте СЭ3+-лимфоцитов

10ч

В

коме отмечено снижение почти в два раза процентного содержания зрелых Т-клеток, коэкспрессирующих CD4 (Т-хелперы/индукторы) и адгезионную молекулу CD62L (Leu8). Повышение процента HLA-DR+ Т-цитотоксических клеток (в три раза) следует рассматривать как проявление активации клеток иммунной системы костного мозга при рабдомиосаркоме.

Еще один интересный результат связан с установлением факта увеличения субпопуляции ТОуб-позитивных клеток у больных рабдомиосаркомой.

При сопоставлении субпопуляций лимфоцитов костного мозга с факторами прогноза при рабдомиосаркоме у детей значимые различия отмечены лишь для одной Т-клеточной субпопуляции (Leu8, CD62L). Клетки этого типа преобладали при наличии метастазов в регионарные лимфатические узлы — 69,8 ± 8,0 и 35,5 ± 7,7%, соответственно; p = 0,016. Та же тенденция сохранялась и в отношении CD4-позитивных Т-клеток, экспрессирующих CD62L: 27,0 ± 9,2 и 13,6 ± 2,5%, соответственно; p = 0,08. Важно отметить, что Т-лимфоциты костного мозга с маркером Leu8 (особенно CD4-позитивные) были существенно снижены при рабдомиосаркоме при сопоставлении с группой сравнения. Проведенный нами анализ показал, что это обусловлено, в первую очередь, показателями у больных, не имеющих поражения регионарных лимфатических узлов. Не менее интересные данные получены и при анализе отдаленного метастазирова-ния (индекс М): значимыми оказались три субпопуляции костномозговых лимфоцитов — NK-клетки (CD56+CD3-), TCRaP-лимфоциты и ТОуб-лимфоциты.

Количество NK-клеток костного мозга при наличии отдаленных метастазов было значимо более низким — 6,9 ± 1,9 и 18,6 ± 4,8%, соответственно; p = 0,039. Эти данные могут иметь важное практическое значение, так как позволяют выявить NK-клеточный иммунодефицит при прогрессировании рабдомиосаркомы.

Повышенное содержание уровня уб Т-клеток в костном мозге больных при диагностике рабдомиосарко-мы в сравнении с аналогичными показателями у детей, не имеющих онкологической патологии, по-видимому, отражает компенсаторный механизм иммунитета у больных. При развитии отдаленных метастазов содержание TCRYб-клеток падает: 18,5 ± 1,7 (у 7) и 11,0 ± 1,7% (у 4); p = 0,019.

Субпопуляции лимфоцитов костного мозга у детей с опухолями семейства саркомы Юинга. Сопоставляя результаты исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга при опухолях семейства саркомы Юинга с группой сравнения, не установлено различий в уровнях содержания зрелых Т-клеток, оцениваемых по маркерам CD3 и CD5, а также в уровнях В-лимфоцитов (CD19+). Не было различий и в некоторых популяциях В- (CD19+CD5+) и Т-клеток (CD3+CD56+), а также в уровнях Т-клеток, экспрессирующих ав- и y6 Т-клеточные рецепторы. Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей при ОССЮ и в группе сравнения представлена в табл. 7.

Субпопуляционный состав зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) костного мозга больных саркомой Юинга существенно отличался от результатов в группе сравнения значи-

тельным повышением пропорции С08+-цитотоксических лимфоцитов (68,5 ± 3,1 и 50,5 ± 2,4; р = 0,000) и снижением 004+ Т-хелперных клеток (26,9 ± 3,5 и 39,3 ± 2,8; р = 0,01). Это, в свою очередь, отразилось на значениях (вдвое более низких) иммунорегуляторного индекса — соотношения С04/С08 — у больных саркомой Юинга при сопоставлении с группой сравнения: 0,4 ± 0,08 и 0,8 ± 0,09; р = 0,002.

Нами детально изучена структура пула Т-цито-токсических клеток костного мозга (С03+С08+) у больных саркомой Юинга в сравнении с детьми, не имеющими онкологической патологии, при этом установлен ряд важных различий. В первую очередь, отмечены более высокие уровни активации Т-клеток (С03+), в частности Т-цитотоксических клеток (С03+С08+); результат получен на основании возрастания более чем в три раза Н1_Д-0Р-позитивной фракции (р = 0,001).

Специфической особенностью Т-цитотоксических лимфоцитов костного мозга больных саркомой Юинга стало достоверное возрастание, в сопоставлении с группой сравнения, пропорции С08+С038+-клеток среди С03-позитивных лимфоцитов — 55,5 ± 4,8 и 34,6 ± 3,7%; р = 0,004. Важно отметить, что процент С038+-клеток среди всех зрелых лимфоцитов (С03+) не отличался от такового в группе сравнения, то есть отклонения касались лишь С08-позитивной субпопуляции.

Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает увеличение количества С057-позитивных Т-клеток (р = 0,022), в частности Т-цитотоксических (С03+С08+) клеток (р = 0,028), в костном мозге больных саркомой Юинга в сравнении с нормой. Данной субпопуляции придается важное значение у больных солидными опухолями, и возрастание количества этих клеток, как правило, ассоциируется с неблагоприятным прогнозом [8].

У больных саркомой Юинга увеличено процентное содержание ЫК-клеток (С03-С056+) среди лимфоцитов костного мозга при сопоставлении с результатами в группе сравнения (18,0 ± 3,7 и 9,4 ± 1,7), различия статистически значимы: р = 0,049. Особое значение имеют достоверные различия в функционально значимых субпопуляциях зрелых (С03+) Т-лимфоцитов. Так, снижение уровней экспрессии молекулы адгезии С0621_ (1_еи8) на Т-лимфоцитах костного мозга больных саркомой Юинга при сопоставлении с уровнями в группе сравнения было обусловлено в основном достоверными различиями в субпопуляции С04+С0621_+ Т-клеток — 13,7 ± 2,4 и 30,5 ± 5,2; р = 0,005. Молекула 1_-селектина (С0621_) играет важную роль в хоминге Т-лимфоцитов, и ее снижение при саркоме Юинга может препятствовать проникновению зрелых Т-клеток в периферические лимфоидные органы, а также в костный мозг.

При сопоставлении уровней субпопуляций лимфоцитов костного мозга при ОССЮ с клиническими факторами прогноза мы выявили, что нарастание объема опухолевой массы (более 100 см3 или протяженности поражения кости более 8 см) сопровождается снижением количества активированных Т-цитотоксических клеток (С03+С08+С038+) в сравнении с больными, у которых опухолевая масса была меньшего размера: 41,7 ± 8,2 (у 5) и 63,2 ± 4,3% (у 9), соответственно; р = 0,024.

Таблица 7. Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей, больных саркомой Юинга, и детей, не имеющих злокачественных опухолей

№ Маркер Норма, %, М ± m Количество пациентов, n ОССЮ, %, М ± m Количество пациентов, n р

1 CD3 60,8 і 5,0 15 54,3 і 4,6 16 0,3

2 CD3+CD8+ 50,5 і 2,4 14 68,5 і 3,1 16 0,000

3 CD3+CD4+ 39,3 і 2,8 14 26,9 і 3,5 16 0,01

4 CD3+CD4+/CD3+CD8+ 0,8 і 0,09 14 0,4 і 0,08 16 0,002

5 CD5 59,2 і 5,4 13 48,7 і 4,7 14 0,16

б CD19 27,8 і 4,5 15 21,8 і 3,5 16 0,3

7 CD19+CD5+ 14,6 і 4,2 13 13,2 і 2,4 14 0,78

8 CD20+ 25,3 і 3,8 15 11,9 1 -

9 CD3- CD56+ 9,4 ± 1,7 12 18,0 ± 3,7 14 0,049

10 CD3+CD56+ 12,6 і 5,5 13 7,5 і 2,0 15 0,38

11 TCRap 86,4 і 1,5 13 85,1 і 2,4 12 0,65

12 TCRy6 9,2 і 1,4 11 10,0 і 1,2 11 0,69

13 CD8+HLA-DR+ 8,9 ± 1,4 11 33,8 ± 5,4 14 0,001

14 CD3+HLA-DR+ 12,2 ± 1,9 13 37,5 ± 6,3 15 0,001

15 CD25+TCRap+ 5,6 і 1,1 10 11,0 і 3,7 12 0,8

16 CD3+CD38+ 66,0 і 7,3 11 75,0 і 5,3 15 0,32

17 CD8+CD38+ 34,6 ± 3,7 10 55,5 ± 4,8 14 0,004

18 CD8+CD28+ 49,1 і 10,3 11 22,4 і 5,5 14 0,27

19 CD3+CD57+ 16,9 ± 5,6 11 38,4 ± 6,4 14 0,022

20 CD8+CD57+ 11,6 ± 5,0 10 25,8 ± 3,7 14 0,03

21 CD3+Leu8+ 47,9 ± 7,5 11 36,0 ± 7,4 14 0,04

22 CD4+Leu8+ 17,6 ± 3,5 10 13,6 ± 2,5 14 0,005

33

Примечание. Полужирным шрифтом выделены достоверные различия.

Следовательно, повышение уровней активированных Т-цитотоксических клеток при саркоме Юинга можно, вероятно, рассматривать как реакцию на опухоль на ранних стадиях ее роста, а при большом размере опухоли этот показатель снижается.

Интересное наблюдение получено в отношении низких уровней TCRYб-клеток костного мозга у больных саркомой Юинга с поражением осевого скелета в сравнении с больными, у которых были поражены конечности:

7,6 ± 0,9 (у 6) и 12,9 ± 1,6% (у 5), соответственно; р = 0,016. В целом по группе саркомы Юинга уровни Т-клеток с Yб-рецептором не отличались от нормы. Известно, что опухоли семейства саркомы Юинга с локализацией в области осевого скелета имеют менее благоприятный прогноз. При сопоставительном анализе уровней субпопуляций костного мозга при ОССЮ с клиническими признаками мы отметили следующее: субпопуляция Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+CD38+) снижалась при увеличении объема опухолевой массы более 100 см3 или нарастании протяженности поражения длинной трубчатой кости более 8 см. Уровень TCRYб-лимфоцитов был

ниже у пациентов с поражением осевого скелета по сравнению с их уровнем при поражении конечностей.

Сравнительный анализ субпопуляций лимфоцитов костного мозга у детей при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга. Сопоставив уровни субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолях семейства саркомы Юинга у детей, мы выявили, что содержание Т-цитотоксических клеток (CD3+, CD8+) было достоверно более высоким у больных с саркомой Юинга по сравнению с уровнем этих клеток у больных рабдомиосаркомой — 68,5 і 3,1 (у 16) и 50,5 і 3,9% (у 16), соответственно; р = 0,001. Наличие на клетках саркомы Юинга выраженной экспрессии молекул HLA-I и связывание с ними CD8+-цитотоксических клеток может объяснять высокий уровень этих клеток в костном мозге.

Уровень TCRYб-лимфоцитов был выше при рабдоми-осаркоме (15,8 і 1,б%) по сравнению с больными ОССЮ (10,0 і 1,2%; р = 0,01). Отсутствие прямого тесного взаимодействия мягкотканной опухоли (рабдомиосаркомы) с клетками костного мозга обусловливает иные иммунологические механизмы взаимодействия организма с опу-

холью, что, по-видимому, отражает различия в эффекторах противоопухолевого иммунитета при этих заболеваниях.

Интересное наблюдение повышения уровня маркеров активации Т-клеток (HLA-DR) как при рабдомиосаркоме, так и при саркоме Юинга по сравнению с нормой — 37,1 і 6,3 и 37,5 і 6,3 против 12,2 і 1,9%, соответственно; р = 0,001. При этом, по нашим результатам, отмечено снижение уровня CD3+CD4+ при ОССЮ по сравнению с данными в группе контроля — 26,9 і 3,5 и 39,3 і 2,8%, соответственно; р = 0,01. Также отмечено снижение вдвое иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 у пациентов с ОССЮ по сравнению с результатами 3-й группы — 0,4 і 0,08 и 0,8 і 0,09, соответственно; р = 0,002. Результаты сопоставления лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и ОССЮ представлены в табл. 8.

обсуждение полученных результатов

Приведенные иммунологические исследования выявили ряд характерных особенностей, отличающих субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга детей при рабдомиосаркоме и ОССЮ от лимфоцитов костного мозга детей, не имеющих онкологической патологии.

Особое внимание привлекают клетки врожденного иммунитета, в первую очередь NK-клетки, моноциты/ макрофаги и Т-цитотоксические лимфоциты.

В научных публикациях обсуждается роль NK-клеток как врожденных эффекторных агентов, способных уничтожать опухолевые клетки. Cho и соавт. сообщили о высокой чувствительности клеточной линии саркомы Юинга к аллогенным NK-клеткам [9].

Для успешной элиминации опухолевых клеток необходимо взаимодействие клеток как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. В работах Fan и соавт., A. Shanker и соавт. показано, что в опухоли происходит «перекрест» между NK-клетками и CD8+ T-лимфоцитами. По мнению авторов, недостаточно прямого действия NK-клеток на опухоль, но необходимо вовлечение CD8+ T-клеток [10, 11]. При опухолевой прогрессии происходит как истощение NK-клеток, так и нарушение CD8+ T-клеточного ответа [10]. Наши данные подтверждают взаимосвязь между NK-клетками и CD8+ T-лимфоцитами. В представленной работе мы выявили значимое повышение по сравнению с нормой субпопуляции Т-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ (68,5 і 3,1 и 50,5 і 2,4; р = 0,000) и NK-клеток CD56+CD3- (18,0 і 3,7 и 9,4 і 1,7; р = 0,049) при ОССЮ.

В научных публикациях последнего десятилетия растет интерес к субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов — TCRYб-клеткам. Они составляют небольшую популяцию среди CD3+-лимфоцитов крови (2-5%) и распознают

Таблица 8. Сопоставление субпопуляций лимфоцитов костного мозга при рабдомиосаркоме и опухолями семейства саркомы Юинга (ОССЮ)

№ Маркер Рабдомиосаркома, %, М ± m Количество пациентов, n ОССЮ, %, М ± m Количество пациентов, n р

1 CD3 59,9 і 4,3 18 54,3 і 4,6 16 0,38

2 CD3+CD8+ 50,5 ± 3,9 16 68,5 ± 3,1 16 0,001

3 CD3+CD4+ 33,0 і 2,7 15 26,9 і 3,5 16 0,18

4 CD3+CD4+/CD3+CD8+ 0,7 і 0,09 15 0,4 і 0,08 16 0,024

5 CD5 62,8 і 5,1 15 48,7 і 4,7 14 0,054

б CD19 21,4 і 4,4 18 21,8 і 3,5 16 0,95

7 CD19+CD5+ 8,5 і 2,4 14 13,2 і 2,4 14 0,18

8 CD20+ 22,9 і 6,2 5 11,9 1 -

9 CD3- CD56+ 14,2 і 3,5 14 18,0 і 3,7 14 0,45

10 CD3+CD56+ 8,6 і 3,3 17 7,5 і 2,0 15 0,8

11 TCRap 83,1 і 1,9 11 85,1 і 2,4 12 0,54

12 TCRy6 15,8 ± 1,6 11 10,0 ± 1,2 11 0,01

13 CD8+HLA-DR+ 28,7 і 6,1 10 33,8 і 5,4 14 0,55

14 CD3+HLA-DR+ 37,1 і 6,3 14 37,5 і 6,3 15 0,96

15 CD25+TCRap+ 10,6 і 2,7 10 11,0 і 3,7 12 0,9

16 CD3+CD38+ 60,0 і 7,9 14 75,0 і 5,3 15 0,12

17 CD8+CD38+ 46,0 і 4,8 9 55,5 і 4,8 14 0,19

18 CD8+CD28+ 17,8 і 4,9 9 22,4 і 5,5 14 0,57

19 CD3+CD57+ 19,6 і 8,3 8 38,4 і 6,4 14 0,09

20 CD8+CD57+ 12,2 і 6,2 7 25,8 і 3,7 14 0,06

21 CD3+Leu8+ 47,5 і 7,9 11 36,0 і 7,4 14 0,28

22 CD4+Leu8+ 17,6 і 3,5 10 13,6 і 2,5 14 0,36

Примечание. Полужирным шрифтом выделены достоверные различия.

антигены (в том числе и опухолевые) с помощью иных механизмов, нежели те, что используются Т-клетками с ав-лимфоцитами. TCRYб-клетки так же, как и клетки врожденного иммунитета, относятся к первой линии защиты. Нами установлена их роль при мелкоклеточных саркомах, а также взаимосвязь с гематогенным метастазированием. TCRYб-клетки являются одной из популяций туморинфильтрирующих лимфоцитов при колоректальном раке, раке молочной железы, раке предстательной железы, раке яичников и почечно-клеточном раке [12, 13].

Важно то, что y6 Т-клетки преимущественно уничтожают опухолевые клетки и практически не проявляют реактивности в отношении нетрансформированных клеток. Возможно, в этом и есть ключ к разгадке высокоэффективного протективного действия аллогенного костного мозга на развитие метастазов мелкоклеточных сарком в легких.

Существуют две основные субпопуляции TCRy6-лимфоцитов, различающиеся используемыми в них V-областями б-цепей: V61 и V62. Обе эти субпопуляции лимфоцитов распознают антигены эпителиальных опухолей [14]. V61 Т-клетки распознают молекулы, родственные антигенам I класса HLA, называемые MICA и MICB, а также 1^16-связывающие белки 1-3 (1^ВР1-3) [15]. V62 TYб-клетки составляют 50-90% всех y6 Т-клеток. Эти лимфоциты распознают фосфоантигены и эктопически экспрессированную митохондриальную АТФазу. Хорошо известно, что эта популяция V62Vy9 периферических TCRYб-лимфоцитов сильно активируется разнообразными бактериями и паразитами [16].

Были синтезированы соответствующие аналоги с мощной и стимулирующей Y6 Т-клетки способностью, такие как бромогидрин пирофосфат (фосфотим) [13, 17, 18]. Эукариотические клетки используют мевалонатный путь биосинтеза изопреноидов. В результате образуется изопентенил пирофосфат (IPP), который также активирует V62Vy9 Т-клетки, но лишь в невысоких нефизиолологич-ных концентрациях. Однако определенные опухолевые клетки синтезируют высокие концентрации IPP, которые могут быть распознаны TCR V62Vy9 как опухолевые антигены [19-21].

Особенностью лимфоцитов костного мозга детей, больных рабдомиосаркомой, в сравнении с детьми, не страдающими злокачественными заболеваниями, является повышение особой популяции зрелых Т-клеток, экспрессирующих Т-клеточные рецепторы Yб-типа: 15,8 и 9,2%, соответственно; р = 0,007. Отличия субпопуля-ционного состава лимфоцитов костного мозга детей, больных рабдомиосаркомой, от лимфоцитов костного мозга детей с опухолями семейства саркомы Юинга также состояли в преобладании TCRYб-лимфоцитов — 15,8 и 10,0%, соответственно; р = 0,01. При анализе выявлен пик подъема TCRYб-лимфоцитов при рабдомиосаркоме в группе больных с локализованными стадиями болезни, а при развитии отдаленных метастазов уровни этих клеток достоверно снижаются.

Вероятно, при ранних стадиях опухолевого процесса эти клетки выполняют функцию сдерживания, однако с ростом опухолевой массы защитные резервы истоща-

ются, и необходимы иные механизмы реагирования — в обход молекул главного комплекса гистосовместимости. Это выражается в снижении TCRy6 у пациентов с неблагоприятными локализациями опухоли, которые в целом не отличались от нормы. Заболевание прогрессирует (развиваются отдаленные метастазы), а уровни TCRYб-клеток снижаются. Следовательно, первичная стимуляция гамма/дельта клеток опухолевыми антигенами ведет к активации и пролиферации, однако данного варианта Т-клеточного ответа не достаточно для элиминации опухоли.

Логично предположить, что повышение уровня этих клеток может благоприятно сказаться на течении заболевания, так как к традиционной химиотерапии будет добавлен иммунотерапевтический компонент — цито-токсическое действие TCRYб-лимфоцитов на опухоль. Возможно также влияние на внутриклеточный уровень IPP (мишени действия TCRy6) с помощью терапевтических препаратов. Аминобифосфонаты, используемые в клинике для лечения остеопороза и костных метастазов, являются мощными ингибиторами IPP-процессирующего энзима фарнезилпирофосфат синтетазы; использование этих средств приводит к внутриклеточному накоплению IPP и мощной активации V62Vy9 Т-клеток, перспективным является применение синтетических фосфоантиге-нов (фосфостим) и аминобифосфонатов для активации и увеличения количества V62Vy9 Т-клеток.

В анализируемой нами группе больных рабдомиосаркомой подобный лечебный подход мог бы быть реализован у диссеминированных больных, у которых уровни TCRy6 Т-клеток достоверно снижаются в сравнении с больными, не имеющими отдаленных метастазов (11,0 и 18,5%; р = 0,019). Нельзя исключить подобные исследования у больных саркомой Юинга с поражением осевого скелета, так как именно у этих больных отмечались более низкие уровни TCRYб-лимфоцитов в сравнении с больными, у которых были поражены конечности:

7,6 и 12,9% (р = 0,016).

В нашей работе мы впервые изучили уровни кости-муляционных и активационных молекул у детей в группе сравнения и группе с саркомами. Небольшое количество наблюдений в нашей работе и недостаток информации об активационных маркерах не позволяют сделать однозначное заключение о роли CD25+, CD28+, CD38+, CD57+ и CD62L+ при рабдомиосаркоме и ОССЮ у детей. Тем не менее уточнение времени появления этих маркеров на Т-лимфоцитах в ходе развития опухоли может быть полезным для изучения корреляции со стадией заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализируя полученные результаты, можно сделать заключение, что TCRYб-лимфоциты при рабдомиосаркоме у детей не только обеспечивают элиминацию злокачественных клеток вне контекста классических молекул главного комплекса гистосовместимости 1-го и 2-го класса, но и осуществляют цитотоксическое действие в отношении опухоли, а также, по нашим данным, отражают напряжение иммунной системы при локализованных стадиях рабдомиосаркомы у детей.

Значительное снижение NK-клеток при наличии отдаленных метастазов рабдомиосаркомы у детей указывает на NK-клеточный иммунодефицит.

Мы отметили снижение уровня Т-цитотоксических клеток при увеличении объема опухоли более 100 см3 или протяженности поражения длинной трубчатой кости более

8 см у пациентов при ОССЮ. У пациентов с поражением осевого скелета обнаружено снижение уровня ТСВуб-лимфоцитов по сравнению с группой больных, у которых поражены конечности. Полученные данные свидетельствуют о возможности формирования групп пациентов для применения иммуномодулирующих препаратов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Galindo C., Tiebin L., Krasin M. et al. Analysis of prognostic factors in Ewing sarcoma family of tumors. Cancer. 2007; 110 (2): 375-378.

2. Walterhous D. Optimal management strategies for rhabdomyosarcoma in children. Pediatric Drags. 2007; 9 (6): 391-400.

3. Дейчман Г.И., Кашкина Л.М., Ключарева Т.Е. и др. Влияние клеток костного мозга, селезенки и перитонеального экссудата на метастазирование опухолевых клеток в легкие сибирских хомячков. Бюл. экспирем. биологии и медицины. 1982; XdV (10): 102-105.

4. Козловская Н.Г. Профилактика легочных метастазов остеосаркомы у собак путем предоперационной трансфузии костного мозга здоровых доноров. Автореф. дис. ...канд. биол. наук. 14.00.14. М., 2002. 21 с.

5. Esartia H.T., Deichman G.I., Kluchareva T.E. еt al. Allogeneic bone-marrow transfusion suppresses development of lung metastases in osteogenic sarcoma patients after radical surgery. Int J Cancer. 1993; 54: 907-910.

6. Козинец Г.И., Макарова В.А. Исследование системы крови в клинической практике. М.: Триада-Х. 1998. 104 с.

7. Луговская С.А., Морозова И.Т., Почтарь М.Е. и др. Лабораторная гематология. М.: Кафедра КЛД. 2006. 214 с.

8. Serrano D., Monteiro J., Allen S. et al. Clonal expansion within the CD4+CD57+ and CD8+CD57+ T cell subsets in chronic lymphocytic leukemia. J Immunol. 1997; 158 (3): 1482-1489.

9. Cho D., Shook D., Shimasak N. et al. Cytotoxicity of activated natural killer cell against pediatric solid tumors. Clin Cancer Res. 2010; 16: 3901-3009.

10. Fan Z., Yu P., Wang Y. еt al. NK-cell activation by LIGT triggers tumor-specific CD8+ T-cell immunity to reject established tumors. Blood. 2006; 107 (4): 1342-1351.

11. Serrano D., Monteiro J., Allen S. et al. Clonal expansion within the CD4+CD57+ and CD8+CD57+ T cell subsets in chronic lymphocytic leukemia. J Immunol. 1997; 158 (3): 1482-1489.

12. Li Z., Xu Q., Peng R. et al. IFN-y enhances HOS and U2OS cell lines susceptibility to y6 T cell-mediated killing through the Fas/Fas ligand pathway. Int Immunopharmacol. 2011; 11 (4): 496-503.

13. Viey E., Fromont G., Escudier B. et al. Phosphostim-activated y6 T-cells kill autologous metastastic renal cell carcinoma. J Immunology. 2005; 174: 1338-1347.

14. Groh V., Rhienehart R., Secrist H. et al. Broad tumor-associated ex pression and recognition by tumor-derived y6-T cells of MIC-A and MIC-B. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 6879-6884.

15. Allison J. The immunobiology of gamma delta+ T-cells. Semin Immunol. 1990; 2 (1): 59-65.

16. Hayday A., Roberts C, Ramsburg E. Gammadelta cells and the regulation of mucosal immune responses. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 162: 161-163.

17. Chiplunkar S., Dha S., Wesch D. et al. Gammadelta T cells in cancer immunotherapy: current status and future prospects. Immunotherapy. 2009; 1 (4): 663-678.

18. Caccamo N., La Mendola C., Orlando V. et al. Differentiation, phenotype, and function of interleukin-17-producing human Vy9V62 T cells. Blood. 2011; 118 (1): 129-138.

19. Bonneville M., Scotet E. Human V-gamma-9 V-delta-2 T cells: promising new leads for immunotherapy of infections and tumors. Curr Opin Immunol. 2006; 18 (5): 539-546.

20. Caccamo N., Dieli F., Meraviglia S. et al. T y6-cell modulation in anticancer treatment. Cur Cancer Drug Targets. 2010; 10: 27-36.

21. Gober H.J., Kistowska M., Angman L. et al. Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 2003; 197 (2): 163-168.

36

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Горбунова Татьяна Викторовна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник хирургического отделения № 1 НИИ ДОГ «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина»

Адрес: 115487, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: wasicsol@mail.ru

Поляков Владимир Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, академик PAK заместитель директора НИИ ДОГ «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина»

Адрес: 115487, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: vgp-04@mail.ru

Тупицын Николай Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина»

Адрес: 115487, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: nntca@yahoo.com

Серебрякова Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник группы гемоцитологии клинико-диагностической лаборатории центрального клинико-лабораторного отдела НИИ КО «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Адрес: 115487, Москва, Каширское ш., д. 24

Тимошенко Валентина Владимировна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина»

Адрес: 115487, Москва, Каширское ш., д. 24

Шведова Тамара Викторовна, биолог группы гемоцитологии клинико-диагностической лаборатории центрального клинико-лабораторного отдела НИИ КО «ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина»

Адрес: 115487, Москва, Каширское ш., д. 24