CC BY
90
МИКРОБИОЛОГИЯ
MICROBIOLOGY
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 579.842.14.83.136
Шепелин А.П.1, Полосенко О.В.1, Марчихина И.И.1, Шолохова Л.П.1, Ажермачева Н.И.1, Ершова М.Г.2, Полетаева Е.Д.2
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, пос. Оболенск, Серпуховский район, Московская область;
2ГБУЗ Ярославской области «Инфекционная клиническая больница» ,150040, Ярославль
Сальмонеллёзные инфекции остаются серьёзной проблемой современной медицины. Являясь возбудителями кишечных инфекций, представители рода Salmonella проявляют себя как патогенные бактерии, особенно при развитии внутрибальничных инфекций. Если учесть полиморфизм клинических проявлений сальмонеллёзов, лабораторные исследования с применением бактериологических и серологических методов являются важным звеном в их диагностике. Профилактика сальмонеллёза включает мероприятия по выявлению бактерионосителей, обеспечению контроля над заболеваемостью сельскохозяйственных животных и птиц, контролю пищевых продуктов и т. д. Перечень питательных сред для выделения и идентификации сальмонелл обширен и неуклонно расширяется, выбор конкретных сред во многом определяется исходя из характера исследуемого материала и представления о возможном содержании в нём бактерий рода Salmonella. При этом учитывают исследования, диагноз или эпидемическую ситуацию. В ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора разработаны две питательные среды, предназначенные для накопления и выделения сальмонелл из различных образцов клинического материала: питательная среда для накопления сальмонелл сухая (магниевая среда) и питательный агар с бриллиантовым зелёным, феноловым красным, лактозой и сахарозой сухой (БФЛС-ГРМ-агар)». Проведена сравнительная оценка ростовых и ингибиторных свойств новых питательных сред производства ФБУН «ГНЦ ПМБ» с коммерческими отечественными и зарубежными аналогами с использованием клинического материала. Доказано соответствие отечественных питательных сред: магниевой среды и БФЛС-ГРМ-агара коммерческим аналогам при использовании этих сред с целью селективного накопления, выделения и учёта сальмонелл из клинического материала и получения объективных результатов бактериологического контроля.
Ключевые слова: питательные среды; БФЛС-ГРМ-агар; магниевая среда; энтеробактерии.
Для цитирования: Шепелин А.П., Полосенко О.В., МарчихинаИ.И., ШолоховаЛ.П., АжермачеваН.И., ЕршоваМ.Г., Полетаева Е.Д. Клинические испытания питательных сред для накопления сальмонелл. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63 (9): 557-563. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-9-557-563
Shepelin A. P.1, Polosenko O. V.1, Marchikhina1.1.,1 SholokhovaL. P.,1 AzhermachevaN. I.,1 ErshovaM. G., 2PoletaevaE. D.2 CLINICAL TRIALS OF SALMONELLA ENRICHMENT MEDIUM
1FederalState Institution of Science State Research Center for Applied Microbiology & Biotechnology, Rospotrebnadzor,
142279, Obolensk, Serpukhov district, Moscow region, Russian Federation
2State budgetary institution of health care Infectious disease hospital, 150040 yaroslavl, Russia
Salmonella infections continue to be a serious problem in modern medicine. Being intestinal infections-associated pathogens, representatives ofthe genus Salmonella manifest themselves as pathogenic bacteria, especially in developing nosocomial infections. Given the polymorphism of clinical symptoms of salmonellosis, laboratory studies using bacteriological and serological methods are an important link in the diagnosis. In addition, the general prevention of salmonellosis includes measures to identify bacteria carriers, to ensure control over the incidence in farm animals and birds, food safety, etc. The list of nutrient media to isolate and identify Salmonella is lengthy and steadily extending, and the choice of specific media is largely relies on the nature of the material under study as well as on the idea of the potential availability of Salmonella bacteria in it, with research, diagnosis or epidemic situation being taken into account. The SRCAMB (Rospotrebnadzor) has designed two nutrient media allowing the enrichment and isolation Salmonella from various clinical samples. These are "Nutrient Medium for Enrichment of Salmonella, Dry (Magnesium medium) and "Nutrient Agar with Brilliant Green, Phenolic Red, Lactose and Sucrose, Dry (BPLS-FMH agar)." Growth and inhibitory properties of the new culture media produced by the SRCAMB and commercial domestic and foreign counterparts have been compared by using clinical material. Domestic nutrient media such as Magnesium medium and BPLS-FMH agar were proved to correspond to their commercial analogues when being used for enrichment, isolating and counting Salmonella bacteria in clinical specimens to have bacteriological control real data.
Keywords: nutrient media; BPLS-FMH agar; Magnesium medium; enterobacteria.
For correspondence: Polosenko O. V., candidate of biological sciences, leading researcher of the sector for microbiology; email: [email protected]
For citation: Shepelin A. P., Polosenko O. V., Marchikhina 1.1., Sholokhova L. P.,Azhermacheva N. 1., ErshovaM. G., Poletaeva E. D.Clinical trials of salmonella enrichment medium. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2018; 63 (9): 557-563 (inRuss.) DO1: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-9-557-563
Для корреспонденции: Полосенко Ольга Вадимовна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. сектора микробиологических исследований; e-mail: [email protected]
МИКРОБИОЛОГИЯ
Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The work was carried out within the .sectoral program of Rospotrebnadzor.
Received 02.04.2018 Accepted 25.05.2018
Ежегодно большое количество людей страдает пищевыми отравлениями и инфекциями пищевого происхождения, вызванными сальмонеллами.
По статистической информации о состоянии здравоохранения по Российской Федерации в целом и по субъектам Российской Федерации за 2016 г., заболеваемость населения сальмонеллёзными инфекциями составила 38,1 тыс. человек, что по сравнению с предыдущим годом увеличилось на 1,2 тыс. человек [4].
В этиологической структуре доля сальмонеллы группы D (Salmonella enteritidis) составляет 78-81% всех диагностированных случаев. В последние годы появились данные о возрастающей роли сальмонелл группы С (S. infantis), что свидетельствует о формировании новых резервуаров возбудителя в природе и требует дальнейших исследований для определения возможных источников инфекции, не имевщих большого значения в предыдущие годы [9].
Большинство сальмонелл патогенны как для человека, так и для животных и птиц, но в эпидемиологическом отношении наиболее значимы для человека лишь несколько из них: Salmonella enterica subsp. typhimurium, S. enterica subsp. enteritidis, S. enterica subsp. panama, S. enterica subsp. infantis, S. enterica subsp. london и некоторые другие вызывают 85-91% случаев сальмонеллёзов. При этом на долю первых двух приходится 75% всех изолятов, выделяемых в настоящее время от больных людей.
Серьёзной проблемой современной медицины являются сальмонеллёзные, нозокомиальные инфекции. В подавляющем большинстве случаев (более 80%) возбудителем нозокомиального сальмонеллёза как в России, так и за рубежом является S. enterica subsp. typhimurium [1].
Механизм передачи сальмонеллёзной инфекции фекально-оральный, основной путь передачи - пищевой и главным образом через продукты животного происхождения.
Санитарные правила (СП 3.1.7.2836-11 «Профилактика сальмонеллёза») [12] устанавливают основные требования к комплексу организационных, санитарно-противо-эпидемических (профилактических) мероприятий, направленных на предупреждение возникновения и распространения сальмонеллёза среди населения.
Несмотря на стремительное развитие ускоренных методов диагностики (молекулярно-генетические, им-мунохроматографические методы, иммуноферментный анализ и другие) различных заболеваний, в соответствии с санитарными правилами в качестве основного метода для подтверждения наличия сальмонелл является куль-туральный [2, 8, 13].
Культуральный метод основан на выделении и идентификации чистой культуры возбудителя из исследуемого материала. Его эффективность зависит от правильного и адекватного выбора питательных сред, что позволяет определить таксономически значимые признаки клинических изолятов и правильно их идентифицировать.
К числу общепризнанных питательных сред для накопления сальмонелл относятся магниевая среда, селе-
нитовый бульон, бульон Раппопорта - Вассилиадиса, среда Мюллера - Кауфмана и другие.
Магниевая среда используется для выделения сальмонелл в обычной концентрации (для исследования малых объёмов - испражнений, пищевых продуктов, сточных вод), в двойной концентрации (для исследования больших объёмов - сточных вод, воды открытых водоёмов), в виде концентрированных растворов («экспедиционная» модификация) [5].
Из плотных селективных дифференциально-диагностических питательных сред, производимых в РФ, широко применяются среда Левина, агар Эндо, агар Плоски-рева, висмут-сульфит-агар, XLD-агар и другие.
Высокая питательная ценность селективного питательного агара с бриллиантовым зелёным, феноловым красным, лактозой и сахарозой (БФЛС-ГРМ-агар) обеспечивает хороший рост сальмонелл и их чёткую дифференциацию от лактозо- и сахарозополо-жительных микроорганизмов, увеличенная концентрация бриллиантового зелёного и дополнительное содержание малахитового зелёного в значительной степени подавляют рост грамположительных бактерий.
Следует отдавать предпочтение отечественным сухим питательным средам известных производителей, имеющим регистрационные удостоверения и разрешённым к применению на территории Российской Федерации для лабораторной диагностики [10].
Перечень питательных сред для выделения и идентификации возбудителей кишечных инфекций, в частности энтеробактерий, неуклонно расширяется. Практически весь ассортимент питательных сред ФБУН «ГНЦ ПМБ» внесён в ГОСТы и МУК для бактериологических исследований в клинической и санитарной микробиологии. Эти среды широко используются бактериологическими лабораториями России для выделения и идентификации энтеробактерий, диагностики особо опасных инфекций, дисбиозов, дифтерии, гнойных бактериальных менингитов, при контроле микробной загрязнённости нестерильных лекарственных средств и др. [3, 14-16].
Цель работы - внедрить в практику бактериологических исследований для выделения сальмонелл отечественные сухие питательные среды: питательную среду для накопления сальмонелл, сухую (магниевая среда) и питательный агар с бриллиантовым зелёным, феноловым красным, лактозой и сахарозой сухой (БФЛС-ГРМ-агар), не уступающих по качеству импортным коммерческим аналогам.
Материал и методы. В микробиологической лаборатории Инфекционной клинической больницы г. Ярославля в рамках Соглашения о научно-техническом сотрудничестве между ФБУН «ГНЦ ПМБ» и ГБУЗ ЯО «ИКБ» от 06.06.2016 совместно с сотрудниками ФБУН «ГНЦ ПМБ» проведены исследования образцов клинического материала с применением питательной среды для накопления сальмонелл сухой (магниевая среда) по ТУ 9385-228-78095326-2015, БФЛС-ГРМ-агара по ТУ 9385-201-78095326-2013 производства ФБУН «ГНЦ ПМБ» для подтверждения возможности использования данных сред по назначению.
MOOBЮLOGY Таблица 1
Сравнительная характеристика питательных сред по биологическим показателям на контрольных тест-штаммах микроорганизмов
Тест-штамм Разведе- Питательный БФЛС-ГРМ-агар ФБУН «ГНЦ ПМБ» BPLS - аgar for the isolation of Salmonella фирмы «MERCK»
ние число колоний, диаметр в мм
S. enterica subsp. 10-6 87 85
typhimurium 79 2,5-3,2 Колонии круглые, гладкие, розового цвета 1,6-1,8 Колонии круглые, гладкие, розового цвета
S. enterica subsp. 10-6 105 Нет роста-
gallinarum 665 1,6-1,8 Колонии круглые, гладкие, розового цвета
S. enterica subsp. 10-6 125 103
paratyphi A 225 1,4-1,8 Колонии круглые, гладкие, розового цвета 1,8-2,0 Колонии круглые, гладкие, розового цвета
S. enterica subsp. 10-6 79 45
typhi H-901 ГДР/ 1,0-1,8 0,6
ГИСК Колонии круглые, гладкие, розового цвета Колонии круглые, гладкие, бледно-розового цвета
S. flexneri 1 a 8516 10-6 92 1,4-1,6 Колонии круглые, гладкие, розового цвета Нет роста
E. coli О55:К59 3912/41 10-6 46 47
1,0-1,8 Колонии круглые, гладкие, жёлтого цвета 1,0-1,6 Колонии круглые, гладкие, жёлтого цвета
E. coli 25922 10-6 49 1,6-2,0 Колонии круглые, гладкие, жёлтого цвета 38 1,2—1,4 Колонии круглые, гладкие, жёлтого цвета
P. vulgaris HX 10-6 125 85
19222 1,8—2,0 Колонии круглые, гладкие, жёлтого цвета, роения нет 1,0—1,2 Колонии круглые, гладкие, жёлтого цвета, роения нет
S. aureus209-P 10-5 Нет роста Нет роста
Проанализировано 520 образцов патогенных биологических агентов (ПБА). Клинический материал представляет собой 436 образцов испражнений (кал), 74 образца мочи, 5 мазков из гнойных ожоговых ран, 5 образцов крови.
Препараты сравнения для магниевой среды - селенитовый бульон, предоставленный ГУЗ ЯО «ИКБ N° 1», для БФЛС-ГРМ-агара - SS-агар, среда Левина-ГРМ, BPLS -аgar for the isolation of Salmonella фирмы «MERCK».
В качестве вспомогательных сред и сред сравнения для выделения энтеробактерий использованы:
- питательный бульон для накопления сальмонелл по Раппопорту - Вассилиадису сухой (RVS-бульон);
- транспортная питательная среда Кэри - Блэра;
- питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (агар Клиглера-ГРМ);
- питательная среда для выделения энтеробактерий сухая (агар Эндо-ГРМ);
- питательная среда с эозин-метиленовым синим сухая (среда Левина-ГРМ);
- питательная среда для выделения сальмонелл и шигелл сухая (SS-агар);
- селенитовый бульон для накопления сальмонелл;
- питательная среда для контроля микробной загрязнённости (цитратный агар Симмонса) (питательная среда № 14 ГРМ);
- среда Гисса с сорбитом, с индикатором;
- питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Гисса с глюкозой);
- питательная среда для идентификации энтеробактерий сухая (Гисса с лактозой);
- среда с лизином;
- Ornitin Decarboxylase Broth HiMedia 0000238812;
- Gram Stain Kit REF 212539 LOT 4140910 2015 - 1031 «Becton, Dickinson»;
- сыворотки ПЕТСАЛ СПбНИИВС диагностические сальмонеллёзные адсорбированные для реакции агглютинации (РА), лиофилизат для диагностических целей.
Взятие исследуемого материала и посев на питательные среды проводили в соответствии с нормативными документами [6, 7, 11].
Результаты и обсуждение. ФБУН «ГНЦ ПМБ» выпускает среды для накопления и выделения сальмонелл и шигелл, такие как RVS-бульон, агар Плоскирева, SS-агар, агар Мак-Конки, висмут-сульфит-агар, XLD-агар. При разработке новых сред, в частности при планировании целенаправленных и организованных экспериментов по оптимизации состава, например БФЛС-агара, использован статистический метод с варьированием нескольких факторов, влияющих на качество питательной среды. Магниевая среда и БФЛС-ГРМ-агар - питательные среды, предназначенные для накопления и выделения сальмонелл из различных материалов, полностью адаптированы к сырьевой базе ФБУН «ГНЦ ПМБ» [10]. По результатам экспериментальных работ определён оптимальный компонентный состав отечественного БФЛС-агара, обладающего стабильными физико-химическими и биологическими свойствами. Качество разработанных сред оценивалось по основным биологическим показателям с использованием набора тест-штаммов из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН «ГНЦ ПМБ». Проведена сравнительная оценка качества разработанной питательной среды с коммерческим аналогом BPLS - аgar for the isolation of Salmonella фирмы «MERCK» (табл. 1).
Совокупность компонентов разработанной питательной среды для накопления сальмонелл (магниевой среды) обеспечивает питательные потребности для роста и накопления сальмонелл из исследуемых образцов различ-
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 2
Показатели эффективности магниевой среды и RVS-бульона через 6 ч инкубации
при 37,0 ± 1°С
Тест-штамм, разведение Магниевая среда
рост на ГРМ-агаре Показатель
(число колоний, морфология, диаметр в мм) эффектив-
до подращивания после подращивания ности
S. enterica subsp. typhimurium 79, 20 1500 75
10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. abony IHE 8 820 102
103/39, 10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. enteritidis 11272, 33 1500 45
10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. typhi «bismuth», 17 85 5
10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. paratyphi B 15 1000 66
8006, 10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. enterica 22 517 24
meunchen O6, Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
10-6 2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. typhimurium 79, 46 1200 26
10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. abony IHE 21 1000 47
103/39, 10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. enteritidis 11272, 40 1000 25
10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. typhi «bismuth», 12 4 -
10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. paratyphi B 27 45 16
8006, 10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
S. enterica subsp. enterica 25 390 15
meunchen O6 10-6 Круглые, бесцветные Круглые, бесцветные
2,0-2,5 2,0-2,5
ной степени биологического загрязнения с показателем эффективности не менее 10. Селективные свойства среды основаны на низком значении рН и ингибирующем действии хлористого магния, малахитового зелёного, бриллиантового зелёного в отношении ряда грамотри-цательных и грамположительных бактерий. Разработанная магниевая среда по своим ингибирующим свойствам идентична RVS-бульону и обеспечивает визуальное отсутствие роста сопутствующих микроорганизмов в первые 6 ч инкубации посевов при 37 ± 1°С. Сравнительная характеристика эффективности накопления сальмонелл в магниевой среде и RVS-бульоне представлена в табл. 2.
В соответствии с ТУ эффективность магниевой среды должна быть не менее 10, что подтверждается экспериментальными данными.
В микробиологической лаборатории Инфекционной клинической больницы г. Ярославля проведены клинико-лабораторные испытания на трёх сериях каждой из вышеуказанных питательных сред - БФЛС-ГРМ-агаре и магниевой среде. Образцы питательных сред предоставлены ФБУН «ГНЦ ПМБ» по акту передачи образцов. Средами сравнения для БФЛС-ГРМ-агара служили
SS-агар и среда Левина-ГРМ, для магниевой среды - селенитовый бульон, предоставленные ГУЗ ЯО «ИКБ № 1».
Испытания проводились в 2 этапа.
1-й этап: входной контроль предоставленных для испытания трёх серий каждой из испытуемых сред на соответствие требованиям, заложенным в ТУ и описанным в паспортах качества (внешний вид, растворимость, прозрачность и цветность раствора), определяли визуально, рН -потенциометрическим методом.
2-й этап: проводили испытания медицинских изделий БФЛС-ГРМ-агар по ТУ 9385201-78095326-2013 и магниевой среды по ТУ 9385-228-780953262015 производства ФБУН «ГНЦ ПМБ» с целью подтверждения возможности использования их по назначению.
Подготовка и исследование образцов клинического материала с использованием БФЛС-ГРМ-агара проведена в соответствии с приказом Минздрава СССР от 22.04.1985 № 535 и приказом Минздрава СССР от 16.08.1989 № 475.
Исследовано в двух повтор-ностях 520 образцов ПБА, поступивших в лабораторию для исследования от 520 пациентов, госпитализированных в различные отделения ГБУЗ ЯО «ИКБ». Клинический материал представлен 436 образцами испражнений (кал), 74 образцами мочи, 5 мазками из гнойных ожоговых ран, 5 образцами крови. Каждый образец зашифрован (номера всех образцов, указанных в протоколе, соответствуют номерам, присвоенным этим образцам в журнале регистрации ПБА, поступающих для исследования при эн-теропатогенных инфекциях по форме 512/у (ГБУЗ ЯО «ИКБ»)). Каждый образец сопровождался направлением от лечащего врача с указанием предварительного диагноза (острые кишечные инфекции, пищевые ток-сикоинфекции, сепсис и т. д.) и необходимости культу-рального исследования на патогены, в том числе сальмонеллы. Посевы и учёт результатов проводились параллельно двумя специалистами (врач-бактериолог ГБУЗ ЯО «ИКБ» и сотрудник ФБУН «ГНЦ ПМБ») в разных помещениях одной лаборатории.
Доставленный в транспортной питательной среде Кэри - Блэра клинический материал засевали на питательные среды Левина-ГРМ, SS-агар и испытуемый БФЛС-ГРМ-агар. Равные количества транспортных сред Кэри - Блэра с оставшимися в них образцами залиты соответственно селенитовым бульоном и магниевой средой для инкубации посевов с целью селективного накопления сальмонелл.
MOOBЮLOGY
Таблица 3
Ферментативные свойства клинических изолятов, подозрительных на сальмонеллы, выросших на БФЛС-ГРМ-агаре
Подозрительные колонии на БФЛС-ГРМ-агаре, № образца Сероводород Лактоза Глюкоза (газ) Сахароза Мочевина Подвижность Индол Фенилаланиндезаминаза Цитрат Симмонса Лизиндекарбоксилаза Орнитиндекарбоксилаза Сорбит Мальтоза Маннит Дульцит Рамноза Ксилоза Арабиноза Инозит Предварительная идентификация (род) Серовар
253 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
345 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
684 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
823 + - + - - + - - + + + + + + + + + Salmonella london
955 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
1229 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
1249 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
1251 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
1663 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
1803 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
343 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
371 + - + - - - - + + + + + + Salmonella stanley
455 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
771 + - + - - - - + + + + + + Salmonella bovismorbificans
865 + - + - - + - - + + + + - + + + + + Salmonella enteritidis
1163 + - + - - - - + + + + + + Salmonella virchow
Через 24 ч инкубации посевов на плотных дифференциально-диагностических питательных средах учитывали рост колоний с характерной для искомых микроорганизмов морфологией: - круглые, гладкие, розового цвета диаметром от 1,5 до 3,0 мм на БФЛС-ГРМ-агаре и бледно-розовые с почернением или без него на SS-агаре и розовые на среде Левина.
По культуральным свойствам отобраны 112 чашек с ростом на SS-агаре, среде Левина-ГРм, БФЛС-ГРМ-агаре, где обнаружены лактозоотрицательные колонии. Отобранные чашки с ростом - посев 59 образцов кала на SS-агаре, 59 образцов кала на среде Левина и 58 образцов на БФЛС-ГРМ-агаре.
По истечении срока накопления образцов в селенитовом бульоне и магниевой среде во всех посевах клинических образцов визуально наблюдался рост в виде диффузного помутнения с обесцвечиванием среды или без него. Из всех пробирок бактериологической петлёй проводились штриховые пересевы на плотные среды: - среду Левина-ГРМ, SS-агар, агар Эндо-ГРМ. Посевы инкубировались 24 ч при 37 ± 1°С. Для дальнейшей идентификации отобрано 105 чашек с характерной для искомых микроорганизмов морфологией лактозоотри-цательных колоний.
После накопления в селенитовом бульоне выявлено 62 образца кала, а после накопления в магниевой среде -53 образца кала, обсеменённые лактозоотрицательными микроорганизмами.
На чашках с посевами остальных образцов кала, мочи, гноя, крови подозрительных колоний не обнаружено ни на чашках с прямым посевом образцов, ни на чашках после накопления в магниевой среде и селенитовом бульоне. Отрицательный результат посевов крови подтверждён на анализаторе Бай/Акт!: 3D 60.
Подозрительные на принадлежность к роду Salmonella колонии по 1-6 с чашки идентифицировались по культуральным, морфологическим, тинкториальным, ферментативным и антигенным свойствам. Рост колоний на SS-агаре, среде Левина-ГРМ, БФЛС-ГРМ-агаре представлен на рис. 1., см. обложку.
На отобранных чашках Петри с исследуемой и контрольными питательными средами обнаружены сформированные колонии с типичной для сальмонелл морфологией. На SS-агаре наблюдался рост розовых, бесцветных колоний и колоний с чёрным центром, на среде Левина-ГРМ - розовых, бесцветных колоний и колоний тёмно-фиолетового цвета без металлического блеска, на БФЛС-ГРМ-агаре - розовых колоний и колоний жёлтого цвета. Рост колоний на SS-агаре после накопления в магниевой среде и селенитовом бульоне представлен на рис. 2 и 3, см.обложку.
После накопления в магниевой среде выявление сальмонелл упрощается, поскольку сопутствующая микрофлора после культивирования в средах накопления в значительной степени подавлена.
Ферментативные свойства бактерий, подозрительных на принадлежность к сальмонеллам, определялись на среде Клиглера и средах длинного «пестрого ряда». После дополнительных тестов для всех лактозоотрица-тельных микроорганизмов, выросших на испытуемых средах, родовая и видовая принадлежность к сальмонеллам подтверждена только у 16 изолятов, остальным отобранным образцам дано отрицательное заключение «патогенные энтеробактерии не обнаружены» (табл. 3).
Антигенные свойства определяли в РА на стекле с агглютинирующими моно- и поливалентными О- и Н-сальмонеллёзными сыворотоками по четырёхкрест-ной системе (рис. 4, см. обложку).
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 4
Выявляемость искомых микроорганизмов на испытуемой и контрольных средах при посеве клинического материала
Показатель БФЛС-ГРМ-агар Контрольная
среднее значение среднее значение среда(SS-агар**)
1-й спе- 2-й спе-
циалист циалист
Количество посевов клини- 520 520 520
ческих образцов
Количество положительных 58 54 59
образцов*:
S. enterica subsp. enteritidis 12 12 12
S. enterica subsp. london 1 1 1
S. enterica subsp. Stanley 1 1 1
S. enterica subsp. bovismor- 1 1 1
bificans
S. enterica subsp. virchow 1 1 1
Лактозоотрицательные 42 38 43
Выявляемость и % ± m 95 ± 2 95 ± 2
совпадений результатов ис-
следования положительных проб*
Примечание. * - при доверительной вероятности 90%, учёте среднего результата, полученного двумя специалистами на БФЛС-ГРМ-агаре; ** - на контрольной среде Левина-ГРМ получен аналогичный результат.
Сравнительная оценка выявляемости сальмонелл с использованием испытуемой и контрольных питательных сред из клинического материала представлена в табл. 4.
Выводы. Испытуемые среды: питательная среда для накопления сальмонелл сухая (магниевая среда) и питательный агар с бриллиантовым зелёным, феноловым красным, лактозой и сахарозой сухой (БФЛС-ГРМ-агар) полностью соответствуют заявленным в ТУ требованиям по внешнему виду, растворимости, прозрачности, цветности и рН раствора.
Сравнительная оценка качества испытуемых сред и коммерческих аналогов по биологическим показателям на расширенном наборе тест-штаммов микроорганизмов доказывает полное соответствие назначению каждой из этих питательных сред и ряд преимуществ по показателям чувствительности и эффективности. БФЛС-ГРМ-агар в отличие от BPLS^gar for the isolation of Salmonella фирмы «MERCK» обеспечивает рост, а, следовательно, и выделение из исследуемых образцов S. gallinarum 665 и S. flexneri la 8516. Количество прорастаемых от посевной дозы колоний в отношении S. typhi H-901 ГДР/ГИСК на БФЛС-ГРМ-агаре более чем на 40% выше.
Магниевая среда превосходит контрольный селенитовый бульон по показателю эффективности накопления сальмонелл при инкубации посевов контрольных тест-штаммов микроорганизмов в течение 6 ч при 37 ± 1°С и соответствует требованиям ТУ для данной среды с показателем эффективности более 10.
При исследовании 520 образцов клинического материала в микробиологической лаборатории Инфекционной клинической больницы г. Ярославля при посеве на БФЛС-ГРМ-агар и после инкубации посевов образцов в магниевой среде с целью накопления сальмонелл выявлено 16 изолятов для дальнейшей идентификации. При
использовании контрольных питательных сред также выделено 16 изолятов сальмонелл.
Выявляемость результатов исследования положительных проб на контрольном БФЛС-ГРМ-агаре и контрольных SS-агаре и среде Левина-ГРМ составила 95 ± 2%.
Питательный БФЛС-ГРМ-агар и питательная магниевая среда производства ФБУН «ГНЦ ПМБ» полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к средам аналогичного назначения.
Доказана возможность использования БФЛС-ГРМ-агара производства ФБУН «ГНЦ ПМБ» с целью выделения сальмонелл наряду со средами аналогичного назначения.
Многолетний опыт производства и система контроля качества питательных сред гарантируют потребителям полное соответствие требованиям нормативной документации.
Использование разработанных питательных сред по совокупности признаков и достигаемому эффекту при проведении микробиологических исследований не меняют алгоритмы работы диагностических лабораторий практического здравоохранения.
Питательная магниевая среда и питательный БФЛС-ГРМ-агар рекомендуются для выявления сальмонелл в клинической бактериологии.
Обоснованное применение отечественных питательных сред позволит в полном объёме удовлетворить потребности клинической и санитарной микробиологии и отказаться от импортных поставок, не снижая при этом качества микробиологических исследований. Это обеспечит поддержание биобезопасности Российской Федерации на должном уровне и адекватный ответ на возникающие вызовы и новые биологические угрозы.
Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акимкин В.Г. Современные аспекты эпидемиологии и профилактики нозокомиального сальмонеллеза/Акимкин В.Г. Медицинский совет. 2013; 5-6: 33-9.
2. Воробьев А.А., ред. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Учебник для студентов медицинских вузов. 2-е изд., испр. и доп. М.: ООО Медицинское информационное агентство; 2012.
3. Дятлов И.А., Миронов А.Ю., Шепелин В.А., Алёшкин В.А. Состояние и тенденции развития клинической и санитарной микробиологии в Российской Федерации и проблема импортозаме-щения. Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60((8) : 61-5.
4. Здравоохранение в России. Статистический сборник. М., 2017.
5. Методические рекомендации по применению магниевой среды для выявления сальмонелл из испражнений больных и носителей, пищевых продуктов, сточных жидкостей и воды открытых водоемов от 20.06.1973. М.: МЗ СССР; 1973.
6. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями. МУ 04-723/3. М.: МЗ СССР; 1984.
7. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. МУК 4.2.2316-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2008.
8. Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г., Клюкина Т.В. Основы клинической микробиологии и иммунологии: Учебное пособие. Ростов-на-Дону: ГОУ ВПО РостГМУ; 2011.
9. Шепелин А.П., Дятлов И.А. Питательные среды для энтеробак-терий. М.: Династия; 2017.
10. Шепелин И.А., Миронов А.Ю., Шепелин К.А. Питательные среды: Справочник бактериолога . 2-е изд. М: ЗАО А-Принт; 2015.
11. Приказ Минздрава СССР № 535 Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, 1985.
12. СП 3.1.7.2836-11. Профилактика сальмонеллеза. Санитарно-эпидемиологические правила. Изменения и дополнения № 1 к СП 3.1.7.2616-10. Зарег. в Минюсте РФ 14.03.2011 № 20089. М.; 2011.
13. Лабинская А.С., Блинникова Л.П., Ещена А.С. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. Учебное пособие. 2-е изд. СПб: Лань; 2017.
14. Шепелин А.П., Полосенко О.В., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Дятлов И.А. Питательные среды для выявления стафилококков в клинической и санитарной микробиологии. Биопрепараты. Профилактика. Диагностика. Лечение. 2015; 56 (4): 39-43.
15. Шепелин А.П. Современное состояние и направления развития производства питательных сред в России. Современная лабораторная диагностика. 2015; 16 (2): 18-20.
16. Шепелин А.П., Домотенко Л.В., Дятлов И.А., Миронов А.Ю., Алёшкин В.А. Современные подходы к проблеме импортозаме-щения в области производства питательных сред . Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60 ((6) : 63-5.
REFERENCES
1. Akimkin V.G. Modern aspects of epidemiology and prevention of nosocomial salmonellosis. Meditsinskiy sovet. 2013; 5-6: 33-9.( in Russian)
2. Vorob'ev A.A., ed. Medical Microbiology, Virology and immunology [Meditsinskaya mikrobiologiya, virusologiya i immunologiya: Uchebnik dlya studentov meditsinskikh vuzov]. 2nd ed. Moscow: OOO Meditsinskoe informatsionnoe agentstvo; 2012. ( in Russian)
3. Dyatlov I.A. The state and tendencies of development of clinical and sanitary microbiology in the Russian Federation and the problem of import substitution. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika.2015; 60( 8):61-5. ( in Russian)
4. Health in Russia [Zdravoohranenie v Rossii]. Statisticheskij sbornik .Moscow; 2017. ( in Russian)
5. Methodical recommendation of the use of Magnesium medium
MICROBIOLOGY
for identifying Salmonella in feces of patients and carriers, food products, sewage and open reservoir water of 20.06.1973 . Moscow: Minzdrav SSSR; 1973. (in Russian)
6. Guidelines for microbiological diagnosis of enterobacteria-associated diseases. MU 04-723/3. Moscow: Minzdrav SSSR; 1984. ( in Russian)
7. Methods to control bacteriological nutrient media. Methodical instructions. MUK 4.2.2316-08.Moscow: Federal Center for Hygiene & Epidemiology. Rospotrebnadzor; 2008. ( in Russian)
8. Mironov A.Yu., Kharseeva G.G., Klyukina T.V., eds. Fundamentals of clinical Microbiology and immunology [Osnovy klinicheskoj mikrobiologii i immunologii: Uchebnoe posobie]. Rostov-na-Donu: GOU VPO Rostovskiy gosudarstvennyi universitet; 2011. ( in Russian)
9. Shepelin A.P., Dyatlov I.A. Culture media for enterobacteria [Pitatel'nye sredy dlya jenterobakteriy. Monografiya]. Moscow: Dinastiya; 2017. ( in Russian)
10. Shepelin I.A., Mironov A.Yu., Shepelin K.A. Nutrient medium [Pitatel'nye sredy: Spravochnik bakteriologa]. 2 nd ed. Moscow: ZAO A-Print; 2015. ( in Russian)
11. The order of Ministry of Health, USSR No.535 On unification of microbiological (bacteriological) research methods being used by clinical diagnostic laboratories structured into medical-preventive institutions. 1985. ( in Russian)
12. SR 3.1.7.2836-11 Prevention of salmonellosis. Sanitary and epidemiological rules. Moscow; 2011. ( in Russian)
13. Labinskaya A.S., Blinnikova L.P., Eshena A.S.eds. Private medical Microbiology with technique of microbiological researches [Chast-naya medicinskaya mikrobiologiya s tehnikoj mikrobiologicheskih issledovanij :Uchebnoe posobie] 2 rd ed. St. Peterburg: Lan'; 2017. ( in Russian)
14. Shepelin A.P., Polosenko O.V., Marchikhina I.I., Sholokhova L.P., Dyatlov I.A. Nutrient media to identify staphylococci in clinical and sanitary microbiology. Biopreparaty. Profilaktika. Diagnostika. Lechenie.2015; 56 (4): 39-43. (in Russian)
15. Shepelin A.P. Current state and directions of development of culture medium production in Russia. Sovremennaya laboratornaya diagnostika .2015; 16 (2): 18-20. (in Russian)
16. Shepelin A.P. Modern approaches to the problem of import substitution in the production of culture media. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2015; 60(6): 63-5. (in Russian)
Поступила 02.04.18 Принята к печати 25.05.18
