CC BY
195
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.842.17.083.137
А.П. Шепелин1, И.И. марчихина1, О.В. Полосенко1, Г.Е. Складан2
сравнительная оценка дифференциально-диагностических свойств питательной среды эндо разных производителей
1ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 142279, московская область, Серпуховский район, пгт. Оболенск; 2мУз Видновская районная клиническая больница, 142704, московская область, г. Видное
Проведены сравнительные исследования дифференциально-диагностических свойств питательной среды Эндо разных зарубежных производителей, разрешенных к применению в Российской Федерации, с отечественным агаром Эндо-ГРМ на расширенном наборе музейных тест-штаммов и клиническом материале от больных. Установлено, что морфология, размер и количество колоний большинства энтеробактерий, вырастающих на среде Эндо производства Merck, Pronadisa, HiMedia и ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦПМБ), имеют незначительные морфологические отличия и соответствуют заявленным производителями характеристикам. Показатель выявляемости (высеваемости) патогенных энтеробактерий из клинического материала на среде Эндо ФБУН ГНЦПМБ соответствовал показателям, полученным на средах импортного производства. Показано, что питательная среда Эндо производства ФБУН ГНЦПМБ не только не уступает, но и в ряде случаев превосходит импортные аналоги.
Ключевые слова: питательные среды, агар Эндо, выявляемость, дифференциация, идентификация, ин-гибирующие свойства
A.P. Shepelin, I.I. Martchikhina, O.V. Polosenko, G.Ye. Skladan,
THE COMPARATIVE EVALUATION OF DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC CHARACTERISTICS OF ENDO GROWTH MEDIUM OF DIFFERENT MANUFACTURERS
'State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology (SRCAMB) Federal Service of Consumer Right Protection and Welfare Surveillance, '42279 Obolen.sk, Serpukhov district, Moscow region, Russia; Municipal Health Institution, Vidnoe Regional Clinical Hospital (MHI, VRCH), Vidnoe, Moscow region, Russia The article deals with the results of comparative study of differential diagnostic characteristics of Endo growth medium of different foreign manufacturers permitted to be applied in the Russian Federation and the national Endo agar. The enhanced kit of museum test-strains and clinical material from patients were used. It is established that morphology, size and number of clumps of most enterobacteria growing in Tndo medium manufactured by Merck, Pronadisa, HiMedia and the state research center of applied microbiology and biotechnology have minor morphological differences and match the characteristics declared by manufacturers. The indicator of degree of detection (degree of inoculation) ofpathogenic enterobacteria from clinical material onto Endo medium manufactured by the state research center of applied microbiology and biotechnology matched the indicators of media from foreign manufacturers. It is demonstrated that Endo growth medium manufactured by the state research center of applied microbiology and biotechnology not only is equal to import analogues but in particular cases even excels them.
Key words: growth medium, Endo agar, degree of detection, differentiation, identification, inhibition characteristics
Введение. При диагностике заболеваний, вызванных облигатными кишечными патогенами, наиболее важным и ответственным этапом микробиологического исследования являются выделение и идентификация возбудителей, определение их родовой и видовой принадлежности с использованием питательных сред.
В настоящее время на отечественном рынке средств медицинского назначения представлен достаточно широкий спектр питательных сред разных фирм-производителей. Среди разрешенных к применению и широко используемых российскими потребителями питательные среды производства HiMedia (Индия) [6], Merck (Германия) [7] и Pronadisa (Испания) [8], а также отечественные питательные среды производства ФБУН Государственный научный
Для корреспонденции: Шепелин Анатолий Прокопьевич, зам. дир-ра Адрес: 142279, Московская обл., п. Оболенск Телефон: (4967) 36-00-03 E-mail: info@obolensk.org.
центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦПМБ) [2]. Питательные среды независимо от производителя должны в соответствии с заявленными в нормативной документации показателями качества давать достоверные и сопоставимые результаты. Но лабораторная практика показывает, что микробиологические исследования одного и того же биоматериала на аналогичных питательных средах разных фирм-производителей даже при соблюдении идентичных лабораторных условий могут иметь различия в результатах.
Для диагностики заболеваний людей и животных, обсемененности объектов внешней среды и пищевых продуктов патогенными энтеробактериями при первичном посеве биоматериала широко используют среду Эндо.
Цель настоящей работы - сравнительная оценка дифференциально-диагностических свойств питательной среды Эндо разных зарубежных производителей с отечественным агаром Эндо-ГРМ на расширенном наборе тест-штаммов и изучение выявляемости патогенных энтеробактерий из клинического материала.
Материалы и методы. В работе использованы следующие питательные среды: ENDO agar Base (lot 9023262, Pronadisa); EndoAgar, Special (lot 0000085099, HiMedia); ENDO agar (lot VM 140944 015, Merck), агар Эндо-ГРМ производства ФБУН ГНЦПМБ. Подготовку вышеуказанных питательных сред к исследованиям производили в соответствии с инструкцией по приготовлению каждого из препаратов.
Сравнительную оценку качества испытуемых препаратов осуществляли по основным биологическим показателям: чувствительности, стабильности основных биологических свойств микроорганизмов, дифференцирующим, ингибирующим свойствам питательных сред и выявляемости патогенных энтеро-бактерий из клинического материала [4]. Контролем питательных сред служили музейные тест-штаммы, полученные из государственной коллекции патогенных микроорганизмов "ГКПМ-Оболенск". Для проведения исследований использовали стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10
единицам по ОСО 42-28-85, доведенную до требуемой концентрации микробных клеток методом 10-кратных разведений. Посевная доза составила 100 микробных клеток. Для определения дифференцирующих свойств готовили смеси лактозоположительных тест-штаммов эшерихий с лактозоотрицательными тест-штаммами сальмонелл и шигелл в соотношении 1:1.
Учет результатов проводили через 18-20 ч инкубации посевов при температуре 37±1°С и визуально определяли количество, размер, характер роста и дифференциацию выросших колоний.
Взятие и посев клинического материала производили в соответствии с методическими рекомендациями [1] и МУК 04-723/3 [3]. Внутрилабораторный контроль качества питательных сред осуществляли согласно МУК 4.2.2316-08 [4].
Клиническим материалом для исследований служили фекалии от больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ), пищевой токсикоинфекцией (ПТИ), сальмонеллезом, гастроэнтеритом (ГЭ), энтеритом
Таблица 1
сравнительная характеристика питательных сред разных фирм-производителей по биологическим показателям
Агар Эндо
Штамм (разведение 10-6) HiMedia Merck Pronadisa ГНЦПМБ
Количество колоний, диаметр (в мм), морфология
E. coli 055 3912/41 60 (1,0-1,2) 50 (2,5-3,2) 57 (1,2-1,4) 60 (2,0-2,5)
Круглые, малиновые, без SR-форма Круглые, Круглые, малиновые, с Круглые, малиновые, с
металлического блеска бледно-розовые, без металлического блеска металлическим блеском металлическим блеском
E. coli 0111 168/59 21 (0,6-0,8) 21 (0,8-1,0) 21 (0,6-0,8) 29 (0,8-1,0)
Круглые, бледно- Круглые, бледно-розовые, Круглые, малиновые, с Круглые, розовые, со
розовые, без металличе- без металлического блеска металлическим блеском слабым металлическим
ского блеска блеском
E. coli ATCC 25922 20 (0,8-1,2) 57 (1,2-1,4) 40 (1,4-1,6) 53 (2,0-2,5)
Круглые, розовые, без Круглые, бледно-розовые, Круглые, малиновые, с Круглые, малиновые, с
металлического блеска без металлического блеска металлическим блеском металлическим блеском
E. cloacae A-186 80 (0,6-1,4) 76 (1,6-1,8) 76 (0,6-1,4) 97 (1,8-2,2)
Круглые, розовые Круглые, розовые Круглые, малиновые Круглые, розовые
E. aerogenes 10006 95 (1,2-1,4) 92 (1,6-1,8) 98 (1,0-1,2) 89 (1,6-1,8)
Круглые, бледно-розовые Круглые, бледно-розовые Круглые, малиновые Круглые, розовые
K. pneumonia 418 93 (1,6-1,8) 83 (2,0-2,2) 75 (2,5-3,0) 80 (2,5-3,0)
Круглые, розовые Круглые, бледно-розовые Круглые, малиновые Круглые, розовые с прозрачным ободком
S. typhi Н-901ГДР*ГИСК 85 (0,6-0,8) 79 (1,8-2,0) 80 (1,0-1,2) 83 (1,4-1,6)
Круглые, бледно- Круглые, прозрачные, Круглые, прозрачные, Круглые, прозрачные,
розовые бледно-розовые розовые бледно-розовые
S. typhimurium 79 100 (0,6-0,8) Круглые, 98 (2,0-2,5) 94 (0,6-0,8) 93 (2,0-2,2)
бледно-розовые 50% SR-форма Круглые, бледно-розовые Круглые, розовые Круглые, бледно-розовые
S. dysenteriae I 1362 12 (0,6-0,8) Круглые, 19 (0,2-0,4) Круглые, про- Нет роста 19 (1,2-1,6)
бесцветные зрачные, бледно-розовые Круглые, прозрачные, бледно-розовые
S. flexneri 1 a 8516 60 (0,4-0,6) Круглые, 51 (1,0-1,2) Круглые, 63 (0,6-0,8) Круглые, 61 (1,2-1,4) Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
S. sonnei "S-form" 42 (0,8-0,9) 44 (1,2-1,5) 31 (0,8-1,0) 48 (1,8-2,0)
Круглые, прозрачные, Круглые, прозрачные, Круглые, прозрачные, Круглые, прозрачные,
бледно-розовые бледно-розовые бледно-розовые бледно-розовые
S. aureus Wood-46 10-1 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. dysenteriae I 1362 10-6 + Нет дифференциации Нет дифференциации Нет дифференциации Четкая дифференциация
E. coli 055 3912/41 10-6
S. sonnei "S-form" 10-6 + Слабая дифференциация Слабая дифференциация Слабая Четкая дифференциация
E. coli 0111 168/59 10-6 дифференциация
(Эн), энтероколитом (ЭК), доставленных в бактериологическую лабораторию МУЗ Видновская районная клиническая больница. Пробы помещали в транспортную среду и доставляли в бактериологическую лабораторию в течение 1-18 ч [5].
Выделенные энтеробактерии идентифицировали, используя общепринятый комплекс биохимических и иммунологических методов, в том числе системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов производства ФГУП НПО "Микроген" Минздравсоцразвития РФ (г. Москва), пластины биохимические, дифференцирующие энтеробактерии производства НПО "Диагностические системы" (г. Нижний Новгород).
Результаты и обсуждение. Результаты биологического контроля качества испытуемых серий агара Эндо разных производителей представлены в табл. 1.
Лактозоположительные тест-штаммы микроорганизмов образовывали на всех образцах питательных сред розовые либо малиновые колонии с металлическим блеском или без него. Количество колоний различных штаммов эшерихий колебалось от 20 до 60. Диаметр выросших колоний E.coli, как правило, был не менее 1 мм, наиболее крупные колонии эшерихий образовывались на среде Эндо-ГРМ производства ФБУН ГНЦПМБ.
Рост различных штаммов энтеробактеров (E. cloacae А-186, E. aerogenes 10006) и клебсиелл (K. pneumonia 418) на всех питательных средах Эндо имел типичную картину - крупные колонии бледно-розового или розового цвета.
Лактозоотрицательные штаммы энтеробактерий формировали на средах бесцветные или бледно-розовые колонии. Хорошие ростовые свойства показывали следующие штаммы шигелл и сальмонелл: S. typhi Н-901 ГДР/ГИСК, S. typhimurium 79, S. flexneri 1 a 8516, S. sonnei "S-form". Различия в росте лакто-зоотрицательных бактерий наблюдали для S. dysen-teriae I 136, что проявлялось в отсутствии его роста на среде Эндо производства фирмы HiMedia. Низкие ростовые свойства этой среды, как показали результаты дальнейших исследований, приводили и к более низким показателям высеваемости энтеробактерий из клинического материала. В связи с этим целесообразно рекомендовать бактериологическим лабораториям использовать данный штамм как референс-штамм для оценки стандартности питательных сред при внутри-лабораторном контроле питательных сред.
На исследуемых средах полностью подавлен рост грамположительного тест-штамма S. aureus Wood-46.
Выявляемость патогенных энтеробактерий на питательных средах Эндо
Производитель среды Эндо Количество положительных находок Выявляемость патогенных энтеробактерий (%)
S. tuphimurium S. infantis S. enteritidis S. sonnei
Merck 5 1 4 1 8,0
Pronadisa 5 1 4 1 8,0
HiMedia 5 0 4 0 6,5
ФБУН ГНЦПМБ 5 1 4 1 8,0
Среда ВСА 7 1 7 - 10,2
При определении дифференцирующих свойств среды Эндо отметили, что на питательных средах фирмы HiMedia и Merck тест-штаммы Е. coli не имели металлического блеска, что отрицательно сказывалось на дифференциации патогенных шигелл и сальмонелл от непатогенной кишечной палочки. Для импортных препаратов наблюдали слабую дифференциацию энтеробактерий в смеси S. sonnei "S-form" + Е. coli 0111 168/59 и отсутствие таковой для смеси S. dysenteriae I 1362 + Е. coli 055 3912/41. Обнаружили, что среда Эндо фирмы Merck не обеспечивала сохранение морфологических свойств тест-штаммов Е. coli 055 3912/41 и S. typhimurium 79.
В результате проведенных исследований ростовых свойств среды Эндо разных производителей на музейных тест-штаммах установили, что лактозопо-ложительные энтеробактерии вырастали на среде в виде колоний розового или малинового цвета, а лак-тозоотрицательные бактерии образовывали на среде бесцветные или бледно-розовые колонии.
Энтеробактерии из клинического биоматериала выделяли по общепринятой схеме исследования испражнений. Изучили 138 биопроб от больных ОКИ, ПТИ, ГЭ, Эн, ЭК с 10.10.2011 по 30.11.2011 г. За этот период выделили 15 штаммов патогенных энтеробактерий: 14 сальмонелл, 1 шигеллу. 10 сальмонелл и одну шигеллу выделили с первичного посева фекалий на среду Эндо, а 4 сальмонеллы - только со среды ВСА после накопления в среде обогащения.
Как видно из данных, представленных в табл. 2, со среды Эндо производителей Merck, Pronadisa, ФБУН ГНЦПМБ выделено одинаковое количество патогенных энтеробактерий - 11, со среды Эндо HiMedia - 9. Таким образом, показатель высеваемости патогенных энтеробактерий для среды Эндо производства Merck, pronadisa, ФГУН ГНЦПМБ является одинаковым и составляет 8%; для среды Эндо производства HiMedia -6,5%.
Следует отметить, что по морфологии колоний эн-теробактерий, выросших на средах Эндо производства Merck, pronadisa, HiMedia, ФГУН ГНЦПМБ из смеси микроорганизмов, легко выделялись лактозонега-тивные колонии патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Колонии лактозоположительных E.coli были с металлическим блеском, следовательно, морфология колоний соответствовала характеристикам, заявленным в паспорте производителя. На среде Эндо производства HiMedia колонии патогенных и условно-патогенных бактерий были мелкими, не более 1,3 мм в диаметре, в том числе и колонии E.coli, что усложняло работу бактериолога.
Таким образом, результаты сравнительных испытаний среды Эндо разных производителей на музейных тест-штаммах и клиническом материале от больных показали, что питательная среда Эндо производства ФБУН ГНЦПМБ не только не уступает, но и в ряде случаев превосходит импортные аналоги.
Таблица 2
Выводы. 1. Морфология, размер и количество колоний большинства энтеробактерий, вырастающих на среде Эндо производства Merck, Pronadisa, HiMedia и ФБУН ГНЦПМБ, имеют незначительные отличия и соответствуют заявленным производителями характеристикам. Лактозоположительные энтеробактерии вырастали на среде в виде колоний розового или малинового цвета, лактозоотрицательные бактерии образовывали бесцветные или бледно-розовые колонии. На среде Эндо производства HiMedia отсутствовал рост S. dysenteriae I 1362.
2. Показатель выявляемости патогенных энтеробактерий из клинического материала больных ОКИ на среде Эндо производства ФБУН ГНЦПМБ, Merck и Pronadisa составил 8%; на среде Эндо производства HiMedia - 6,5%.
3. Для повышения стандартности бактериологических исследований при внутрилабораторном контроле качества питательных сред Эндо целесообразно биологические свойства среды дополнительно контролировать, используя штамм S. dysen-teriae I 1362.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов А, В и С. Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2008: 14.
2. Диагностические препараты. Каталог продукции. Оболенск: ФБУН ГНЦПМБ 2010: 8-15.
3. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями. МУ 04-723/3. М.: МЗ СССР; 1984: 11.
4. Методы контроля бактериологических питательных сред. МУК 4.2.2316-08. М.: Роспотребнадзор; 2008: 1-67.
5. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории. МУ 4.2.2039-05. М.: Роспотребнадзор; 2005: 1-5.
6. HiMedia Laboratories Pvt Limited. А-406. Bhaveshwar Plaza, LBS Marg, Mumbai 400 086, India; 1993.
7. Microbiology Manual. MERCK, LPRO UBA-V; 1996.
8. Pronadisa. Laboratorios Conda, S.A. 2008-2009.
REFERENCES
1. Bacterial diagnostics of typhoid and paratyphoid forms А, В and С. Methodical recommendations, M., Federal Center for Hygiene & Epidemiology, Rospotrebnadzor. 2008. P.14.
2. Diagnostic formulations. Product Catalogue. SRCAM&B. Obolensk, 2010. P. 8-15.
3. Methodical regulations on microbiological diagnostics of enterobacterial infections. MU 04-723/3. M., MH USSR, 1984. P. 11.
4. Methods of quality control of biological nutrient media, MUK 4.2.2316-08. M.,Rospotrebnadzor, 2008. P. 1-67.
5. Procedure of collection and transportation of biomaterials to microbiological laboratories, MU 4.2.2039-05. M., Rospotrebnadzor, 2005. P. 1-5
6. HiMedia Laboratories Pvt Limited. А-406/ Bhaveshwar Plaza, LBS Marg, Mumbai 400 086, India, 1993.
7. Microbiology Manual, MERCK, LPRO UBA-V. 1996.
8. Pronadisa. Laboratorios Conda, S.A. 2008-2009.
Поступила 28.11.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.98:578.833.28]-078
Н.м. Дрефс1,2, В.А. Антонов12, И.А. Баркова1, Е.А. Снатенков1, Т.В. Булатова1, В.П. Смелянский1
оптимизация алгоритма лабораторной диагностики лихорадки западного нила на территории россии
1ФКУз Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, 2ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет минздравсоцразвития России
Цель настоящей работы - изучение явления антигенных перекрестов между вирусами лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) и клещевого энцефалита (ВКЭ) с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ) в сыворотке крови лиц, проживающих в различных регионах России.
Для получения точного лабораторного диагноза целесообразно использовать предложенный алгоритм исследования, в котором наряду с ТИФМ мы рекомендуем применять такой дифференциальный критерий, как коэффициент позитивности, ускоряющий и упрощающий лабораторную диагностику инфекций, вызываемых ВЛЗН и ВКЭ.
Ключевые слова: лихорадка Западного Нила, IgG, IgM, ТИФМ, коэффициент позитивности
N.M. Drefs, V.A. Antonov, I.A. Barkova, YeA. Snatenkov, T.V. Bulatova, V.P. Smeliyanskiy
THE OPTIMIZATION OF ALGORITHM OF LABORATORY DIAGNOSTIC OF WESTERN NILE FEVER IN
TERRITORY OF RUSSIA
The article deals with results of study of antigenic chiasms between viruses of Western Nile fever and tick-borne encephalitis using binding immunoassay applied to blood serum from patients residing in various regions of Russia. It is established that to get accurate laboratory diagnostic it is reasonable to apply the proposed algorithm of analysis in which alongside with binding immunoassay such differential criterion as positivity rate is to be implemented to speed up and simplify laboratory diagnostic of infections brought on by viruses of Western Nile fever and tick-borne encephalitis.
Key words: Western Nile fever, IgG, IgM, binding immunoassay, positivity rate
