КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФОРМИРОВАНИЯ ПОЛА 46,XY, ОБУСЛОВЛЕННЫМ МУТАЦИЯМИ В ГЕНЕ NR5A1

Калинченко Наталья Юрьевна; Колодкина Анна Александровна; Райгородская Надежда Юрьевна; Тюльпаков Анатолий Николаевич

КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ФОРМИРОВАНИЯ ПОЛА 46,ХУ, ОБУСЛОВЛЕННЫМ МУТАЦИЯМИ В ГЕНЕ

Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии, Москва, Россия 2 Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, Саратов, Россия

Орфанный ядерный рецептор — стероидогенный фактор 1, кодируемый геном NR5A1, является одним из ключевых регуляторов стероидогенеза, формирования стероидных тканей и их регуляции гипоталамо-гипофизарной осью. Изначально считалось, что мутации в гене NR5A1 характеризуются сочетанной надпочечниковой и гонадной недостаточностью, но данный фенотип оказался редким проявлением дефекта NR5A1. В то же время нарушения функции NR5A1 — одна из частых причин изолированных форм нарушения формирования пола (НФП) 46,XY. Мы проанализировали распространенность мутаций в гене NR5A1 среди 310 российских пациентов с НФП 46,XY и выявили изменения в этом гене в 36 случаев (11,6%). Среди обнаруженных мутаций 15 ранее описаны не были. Нами не установлено наличие фенотип-генотипической корреляции даже в пределах одной семьи. Проведенная работа не выявила каких-либо клинических и гормональных маркеров, которые позволили бы заподозрить данный нозологический вариант НФП 46,XY до проведения молекулярно-генетического анализа. Для более объективных выводов необходимо продолжить наблюдение за данной группой пациентов, особенно при достижении ими периода пубертата.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: нарушение формирования пола, гипоспадия, стероидогенный фактор, NR5A1, дисгенезия гонад.

CLINICAL AND MOLECULAR CHARACTERISTICS OF PATIENTS WITH 46,XY DSD DUE TO NR5A1 GENE MUTATIONS

Endocrinology Reserch Centre, Moscow, Russia 2Saratov State Medical University, Saratov, Russia

Steroidogenic factor 1 (SF1, NR5A1) is a nuclear receptor that regulates multiple genes involved in adrenal and gonadal development, steroidogenesis, and the reproductive axis. Human mutations in SF1 were initially found in patients with severe gonadal dysgenesis and primary adrenal failure. However, more recent case reports have suggested that heterozygous mutations in SF1 may also be found in patients with 46,XY partial gonadal dysgenesis and underandrogenization but normal adrenal function. We have analyzed the gene encoding SF1 (NR5A1) in a cohort of 310 Russian patients with 46,XY disorders of sex development (DSD). Heterozygous SF1 variants were found in 36 out of 310 (11.6%) of cases, among them 15 were not previously described. We have not found any phenotype-genotype correlations and any clinical and laboratory markers that would allow to suspect this type of before conducting molecular genetic analysis.

KEYWORDS: SF1; steroidogenic factor 1; gonadal dysgenesis; disorders of sex development; hypospadias; NR5A1.

АКТУАЛЬНОСТЬ

Нарушение формирования пола (НФП) — состояние, связанное с клинико-биохимическим проявлением несоответствия между генетическим, гонадным и/или фенотипическим полом [1]. Частота встречаемости классических вариантов НФП 46,ХУ приблизительно 1:20 000, однако, если учитывать проксимальные формы гипоспадии и двусторонний крипторхизм как варианты НФП, распространенность данной патологии возрастает до 1:300-500 новорожденных [2]. Принимая во внимание клиническую важность правильной постановки диагноза и психологические аспекты, связанные с выбором пола ребенка, ведущую роль в уточнении генеза заболевания отводят молекулярно-генетическим методам как наиболее точным, решающим в выборе тактики ведения

пациента с НФП 46,ХУ. Однако несмотря на то, что уже описано более 400 генов, так или иначе вовлеченных в процесс дифференцировки пола, до настоящего времени лишь в 50-60% случаев НФП 46,ХУ устанавливается генетическая причина заболевания.

Среди генов, регулирующих формирование пола, одну из ключевых ролей занимает ЫН5А1, кодирующий одноименный белок.

Ш5А1 (стероидогенный фактор 1, 5П) — это регуля-торный белок, относящийся к группе орфанных ядерных рецепторов [3].

С момента открытия Ш5А1 в 1992 г. его биологическое значение остается не до конца изученным. Изначально функция Ш5А1 была определена как регулятор экспрессии ферментов стероидогенеза в стероидогенных тканях, однако позже было показано, что белок необходим

для дифференцировки ткани надпочечников и гонад, а также закладки вентромедиального ядра гипоталамуса и гонадотрофов в гипофизе [4].

Первые клинические случаи, ассоциированные с мутациями в гене ЫН5А1, описаны среди пациентов с НФП 46,ХУ и первичной хронической надпочечниковой недостаточностью (ПХНН) [5], но оказалось, что надпо-чечниковая недостаточность развивается в единичных случаях, тогда как большая часть пациентов имеют изолированное нарушение закладки и функции гонад при отсутствии надпочечниковой недостаточности [6].

С накоплением клинического опыта и доступности генетических исследований рядом зарубежных авторов было показано, что гетерозиготные замены в ЫН5А1 составляют до 10-20% всех форм НФП 46,ХУ без ПХНН, т.е. являются второй из основных причин возникновения НФП 46,ХУ после мутаций в гене рецептора к андро-генам [6, 7, 8].

Фенотипические проявления НФП 46,ХУ при дефектах ЫН5А1 характеризуются значительной вариабельностью: от женского строения наружных половых органов (НПО) с незначительной гипертрофией клитора и отсутствием пальпируемых гонад до мошоночной формы гипоспадии и отсутствия крипторхизма. Дериваты мюл-леровых протоков как маркеры дисгенезии гонад могут обнаруживаться в разной степени развития, но не являются облигатными. Более того, несмотря на то, что данное заболевание относится к группе дисгенезий гонад, у некоторых пациентов с мужским паспортным полом в период пубертата отмечается спонтанная маскулинизация [9, 10, 11], которая не всегда коррелирует со степенью нарушения строения НПО.

Все сказанное выше подчеркивает сложности диагностики и ведения пациентов с данным вариантом НФП 46,ХУ.

ОПИСАНИЕ СЛУЧАЯ

В данной статье нами обобщены клинико-лабора-торные характеристики 36 российских пациентов с НФП 46,ХУ и доказанными мутациями в гене Ж5А1.

Информированное согласие было получено от всех обследованных пациентов; если возраст обследованных не достиг 15 лет, информированное согласие было подписано законным представителем в соответствии с протоколом исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включались пациенты с НФП при ка-риотипе 46,ХУ. НФП определялось как несоответствие хромосомного пола фенотипическому полу. Оценка неправильного строения половых органов осуществлялась по шкале Прадера. Из исследования исключались пациенты, у которых имелось сочетание НФП 46,ХУ с син-дромальной патологией.

Пациентам проводилось комплексное обследование, включающее: оценку строения наружных половых органов по Прадеру, ультразвуковое исследование малого таза, паховых каналов, органов мошонки, исследование гормонального статуса — лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тестосте-

рон, эстрадиол (Э2). У части пациентов исследовался уровень антимюллерова гормона (АМГ), проводилась проба с хорионическим гонадотропином.

Молекулярно-генети чески й анализ проводился в лаборатории отделения наследственных эндокринопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферический крови стандартным методом (набор Pure Link, Genomic DNA Mini Kit, Life Technologies, США). Для молекулярно-ге-нетического анализа применялся метод NGS. Использовалась разработанная в отделении наследственных эндокринопатий ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России панель праймеров для мультиплексной ПЦР и секвенирования с применением технологии Ion Ampliseq™ Custom DNA Panel (Life Technologies, США). Панель праймеров «Нарушения формирования пола» охватывает кодирующие области следующих генов: AKRlC2, AKRlC4, AMH, AMHR2, AR, ARX, ATRX, CBX2, CYBSA, CYPllAl, CYPl7Al, DHCR7, DHH, EMX2, ESR2, FGDl, FGF9, FGFR2, FKBP4, FOXF2, FOXL2, HOXAl3, HSDl7B3, HSD3B2, ICK, LHCGR, LHXl, LHX9, MAMLDl, MAP3Kl, MIDl, NRGBl, NRSAl, POR, PTGDS, SOX9, SRDSA2, SRY, STAR, SUPT3H, TSPYLl, WNT4, WTl, ZFPM2. Подготовка библиотек проводилась в соответствии с рекомендациями производителей. Секвенирование осуществлялось на полупроводниковом секвенаторе PGM (Ion Torrent, Thermo Scientific, США) или Illumina MiSeq (Illumina, США). Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась с помощью программных модулей Torrent Suite 4.2.1 (Ion Torrent, Life Technologies, США) или Genome Analysis ToolKit (GATK) ver. 4.1.2.0 (Broad Institute, Cambridge, MA, USA). Для аннотирования вариантов нуклеотидной последовательности использовался пакет программ ANNOVAR ver. 2018Apr16. После анализа полученных данных проводилось подтверждение полученных мутаций на секвенаторе Genetic Analyzer Model 3130 (Life Technologies, США). Оценка пато-генности вариантов нуклеотидной последовательности проводилась согласно международным и российским рекомендациям [12, 13]. Нумерация кодирующей последовательности гена NRSAl дана по референсу NM_0049S9.3 (http:IIwww.ncbi.nlm.nih.govIgenbank).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование были включены 310 пациентов с НФП 46,XY за период с 201S по 2019 гг. По результатам проведенных молекулярно-генетических исследований гетерозиготные нуклеотидные замены в гене NRSAl были выявлены у 36 пациентов, что составило 11,6% от общего числа пациентов с НФП 46,XY. Среди 36 человек было 2 семьи с двумя сибсами с НФП 46,XY. Ни у одного пациента с НФП 46,XY не было выявлено биаллельных мутаций в гене NRSAl.

Из 36 пациентов 19 при рождении были зарегистрированы в женском паспортном поле (ЖПП), 17 — в мужском (МПП). Среди пациентов, зарегистрированных в ЖПП, у 4 отмечалось правильное женское строение НПО, и сомнений в выборе пола не возникало. У 7 отмечались умеренная гипертрофия клитора (длина до 1,S см) и невыраженная складчатость больших половых губ, в которых пальпировались с одной или обеих сторон гонады (степень вирилизации Прадер 2). У 7 отмечались более

Таблица 1. Строение наружных половых органов по шкале Прадер.

Строение НПО пол паспортный Женские/ Прадер1 Прадер 2 Прадер 3 Прадер 4

женский 4 7 7 1

мужской 0 0 11 6

выраженная гипертрофия клитора (длина до 2,5 см), формирование головки, сужение входа во влагалище, мошон-кообразные половые губы с пальпируемыми в них с одной или обеих сторон гонадами (Прадер 3). Аналогичное строение НПО отмечалось и у 10 пациентов, зарегистрированных в МПП. У 6 мальчиков отмечалась мошоночная форма гипоспадии с узким отверстием у основания полового члена (Прадер 4). Строение НПО Прадер 4 было у одного ребенка, зарегистрированного в ЖПП.

Две из 4 пациенток с правильным женским строением НПО при рождении были обследованы в 2 и 4 года в связи с паховыми грыжами, содержимым которых оказались гонады. Две обратились впервые в возрасте 12 и 14 лет в связи с увеличением клитора, низким тембром голоса, ростом волос на теле по мужскому типу, отсутствием развития молочных желез.

Как видно из представленных данных, большая часть пациентов имели нарушения строения НПО, характеризовавшиеся как «неопределенное» строение (Прадер 3). Интересно, что при одинаково неправильном строении НПО в данной группе распределение пациентов по паспортному полу было примерно одинаковым: 8 с ЖПП и 10 с МПП. Если пациент был зарегистрирован в ЖПП, то фенотипически строение НПО характеризовалось гипертрофией клитора, чаще со сформированной головкой, умеренно развитыми кавернозными телами, наличием единого отверстия урогенитального синуса, высокой задней спайкой, при этом нередко в больших мошонкообразных половых губах пальпировались гонады. Если пациент был зарегистрирован в МПП, то фенотип характеризовался как промежностная форма гипоспадии с недоразвитием полового члена, одно- или двусторонним крипторхизмом.

Среди лиц, зарегистрированных в МПП, 5 человек достигли возраста пубертата (13-18 лет, Таннер 3-5) на момент обследования. У всех отмечено спонтанное правильное половое созревание, адекватное развитие вторичных половых признаков (случай семейной формы дефицита Ш5Д1 со спонтанным пубертатом описан нами ранее [11]). По данным проведенного гормонального обследования уровень ФСГ составил 8,0-14 Ед/л (медиана 9,1; норма 0,7-11,1), уровень ЛГ 5,32-8,1 ЕД/л (медиана 5,5; норма 1,3-9,6), уровень тестостерона варьировал от 11 нмоль/л до 26,6 нмоль/л, причем его уровень обратно коррелировал с возрастом пациентов. Клинико-гормональные характеристики представлены в таблице 2.

32 ребенка были обследованы в течение первого года жизни в связи с неправильным строением наружных половых органов. Из них у 12 детей в возрасте 1-12 меся-

цев проводились гормональные исследования: у 8 пациентов отмечено повышение уровня ФСГ от 5 до 14 Ед/л, медиана - 7,2 Ед/л (норма до 1 года жизни <3,3 Ед/л), при этом уровень АМГ у них не превышал 18 нг/мл, у остальных 4 детей с нормальным значением ФСГ уровень АМГ был значительно выше (40-60 нг/мл), что свидетельствует о разной степени нарушения функции клеток Сертоли [14]. Несмотря на снижение уровня АМГ, характерного для данной когорты пациентов, среди 19 пациенток с ЖПП только у 4 были выявлены дериваты мюллеровых протоков (ДМП), причем две из них имели правильный женский фенотип, и по данным УЗИ у них лоцировалась нормально развитая матка, что позже подтверждено при проведении лапароскопии. У 2 пациенток, несмотря на отсутствие ДМП по данным УЗИ, были обнаружены недоразвитые ДМП при проведении диагностической лапароскопии. Среди пациентов с МПП у 3 по данным УЗИ лоцировалось дополнительное тяжистое образование за мочевым пузырем. Однако здесь важно учитывать, что у пациентов с МПП прицельно ультразвуковое исследование малого таза не всегда проводится, и его чувствительность для обнаружения недоразвитых ДМП достаточно низкая.

Уровень ЛГ у всех 12 детей, обследованных в возрасте до 1 года, определялся в пределах нормальных значений (0,2-4,2 Ед/л), что косвенно отражает сохранность стерои-догенеза в яичках в постнатальном периоде. Проба с хо-рионическим гонадотропином была проведена 8 детям в возрасте до 1 года жизни, подъем тестостерона составил от 4,6 до 33 нмоль/л, что также свидетельствует об относительной сохранности функции клеток Лейдига (см. табл. 2).

В период новорожденности и при дальнейшем наблюдении признаков надпочечниковой недостаточности в обследованной группе пациентов отмечено не было. Лишь в одном случае у пациентки с правильным женским фенотипом при рождении отмечена клиническая картина надпочечниковой недостаточности, подтвержденная лабораторно [15]. В течение 4 лет ребенок находился на заместительной терапии глюко- и минералокортико-идами. В возрасте 4 лет терапия была полностью отменена, и на пробе с Синактеном-Депо данных за надпочеч-никовую недостаточность получено не было. Подробное описание клинического случая редкого сочетания НФП и надпочечниковой недостаточности у пациента с гетерозиготной мутацией описано нами в статье [15].

12 пациенткам с ЖПП в разном возрасте было проведено удаление гонад. Результат гистологического исследования удаленных гонад был доступен у 5 пациентов: во всех случаях отмечалось слабое развитие интерсти-циальных клеток, в строме очаговый фиброз, гнездное

Таблица 2. Фенотипические, гормональные и молекулярно-генетические характеристики пациентов.

с Положение гонад Г -5 х л /м IQ l

с с и IQ а m о CQ Феноти Prader ДМП ФСГ/ЛГ Т нмош /после пробы < н Г М < и т е н £ Патоге! ность*

1 ж 4 мес III 10.6/2.2 1.3/7.59 12 c.del1273_1278

2 ж 11 мес III нет нет 14/ 10.6 13.7 c.1152_1153ins П (PP4, PM2, PVS1)

3 ж 1 год III рудимент ЛГ-МТ, ППК 6.72/0.21 0.36 17.6 c.671C>T:p.P224L ВП (PS4, PM2, PP2, PP4)

4 ж 4 года Ж есть c.104G>A:p.G35D

5 ж 13 лет II рудимент c.1025C>T:p.S342L ВП (PS4, PM2, PP2, PP4)

6 ж 13 лет II БГ c.1003A>C:p.T335P ВП (PS4, PM2, PP2, PP4)

7 ж 3 мес II нет ПК 3.93/1.22 1.3/13.3 41 c.848G>T:p.C283F П (PS4, PM2, PM5, PP2, PP4)

8 ж 16 лет II нет ПК 34/27.7 15.7 c.937C>T:p.R313C

9 ж 1 г. 4 мес III нет БГ 0.87/0.2 0.1 20 c.1033C>A

10 ж 10 мес II нет ПК 3.6/1.5 0.22/24 40 c.70C>G:p.H24D

11 ж 1 г. 5 мес III нет ППК, ЛГ- мошонка 10.5/2.16 0.5/4.51 c.37T>C:p.C13R

12 ж 15 лет Ж ПБК, ЛПК 85/43 9.5 c.72C>G:p.H24Q П (PS4, PM2, PM5, PP2, PP4)

13 ж 5 лет III нет ПК c.251G>A p.R84H

14 ж 4 мес Ж есть БГ 7.0/0.5 3.17/4.89 c.102+1G>T

15 ж 10 лет II нет ПК 5.54/0.3 /7.45 8.45 c.106T>C:p.F36L ВП (PS4, PM2, PP2, PP4)

16 ж нет инф. Ж c.245-1G>T

17 ж нет инф. III c.848G>A:p.C283Y П (PS4, PM2, PM5, PP2, PP4)

18 ж 10 лет II нет 10.3/3.2 10 c.732_733ins П (PP4, PM2, PVS1)

19 ж > м 1,5 мес IV ПК 7,2/4,2 3,1/10 18 c.11391 G>T

20 м 2 мес IV 5,03/1,69 4,0/7,8 c.244G>A:p.E81K П (PS4, PM2, PM5, PP2, PP4)

21 м 1 мес III нет в мошонке 18,6/1.0 0,8 18.5 c.721C>T:p R241W ВП (PS4, PM2, PP2, PP4)

22 м 4 г. IV 1,64/0,1 0,09 c.C75A:p.Y25X П (PP4, PM2, PVS1)

23 м 5 мес IV ППК, ЛГ- мошонка 5,0/2,2 5,6/33 44 c.937C>T:p.R313C

24 м 1 мес III ПК 4,3 c.937C>T:p.R313C

25 м 13 лет III нет ППК, ЛГ- мошонка 14,4/5,32 15,9 c.T377A:p.M126K П (PS4, PM2, PM5, PP2, PP4)

26 м 4 мес IV в мошонке 7,2/4,2 2,63 c.C86T:p.T29M

27 м 10 лет III нет ПК 1,7/0,2 0.26 31 c.591C>A:p.Y197X П (PP4, PM2, PVS1)

28 м 1 г. 2 мес III нет ПК 2,4/0,48 0,5/14 c.C909G:p.S303R

29 м 15 лет III нет ЛПК, ПГ-в мошонке 9,1/8,1 26,2 42 c.G938A:p.R313H

30 м 18 лет III нет ПК 8/5,5 18,3 0,6 c.251G>A:p.R84H

31 м 12 мес III нет 1,1/0,2 0,2 c.1289G>A:p.S430N

32 м 11 лет III 2,64/0,19 0,27 c.962G>T:p.G321V

33 м 5 мес IV ПК 2,3/0,2 0,03/4,6 60.4 c.251G>A:p.R84H

34 м 18 лет IV нет ППК, ЛГ-мошонка 9,6/6,9 11/20,8 c.951delC:p. H317QfsX17

35 м 16 лет III нет ПК 8/5,5 15,4 c.951delC:p. H317QfsX17

36 м нет инф. III c.990G>A:p.E330E П (PM2 PVS1 PP4)

Примечания: Т - тестостерон; ЛГ — левая гонада; ПГ — правая гонада; МТ — малый таз; ЛПК — левосторонний паховый крипторхизм; ППК — правосторонний паховый крипторхизм; БГ — большая губа; * — патогенность определена для впервые выявленных вариантных изменений: П — патогенная мутация, ВП — вероятно патогенная, в скобках указаны коэффициенты (РР, РМ и др.) для расчета патогенности [12, 13]; ж > м - смена пола с женского на мужской; АМГ >28 нг/мл — норма для мальчиков до 1 года [23].

скопление клеток Лейдига, наличие в разном количестве клеток Сертоли. Ни в одном случае не описывалось стре-ковое или овотестикулярное строение гонад.

Смена с женского на мужской пол была проведена в одном случае после проведения комплексного обследования и проведения врачебного консилиума. У ребенка при рождении отмечалось строение наружных половых органов ближе к мужскому (Прадер 4), расположение яичек в нижней трети паховых каналов, при обследовании в возрасте 1,5 мес выявлены нормальные уровни гонадотропинов, при проведении пробы с хори-оническим гонадотропином подъем тестостерона составил 15 нмоль/л, что свидетельствовало о сохранности стероидогенеза в гонадах. С учетом вышеизложенного и согласия родителей была рекомендована смена пола.

Характеристика мутаций в гене ЫЙ5Л1

У 36 пациентов был выявлен 31 вариант в гене ЫН5А1, 15 из которых ранее описаны не были.

Известная ранее мутация р^313С была обнаружена у 3 неродственных пациентов, фенотип которых значительно варьировал от умеренной гипертрофии клитора (Прадер 2) до хорошо сформированной мошонки с мошоночной формой гипоспадии (Прадер 4). Одна пациентка с ЖПП и нарушением строения НПО Ргас1ег 2 была впервые обследована в возрасте 12 лет по поводу прогрессирующей вирилизации. Два пациента с данной мутацией имели НПО Прадер 3-4 и зарегистрированы в МПП, на момент написания статьи они еще не достигли возраста полового созревания, что не позволяет оценить сохранность функции яичек. У одного пациента выявлена мутация в том же кодоне (р^313И), описанная ранее. Несмотря на значительное нарушение строения НПО (при рождении Прадер 3), в периоде пубертата у него отмечено спонтанное половое созревание с адекватной маскулинизацией, увеличением размеров полового члена, при этом уровень гонадотропинов в 15 лет незначительно превышал верхнюю границу нормы, а уровень тестостерона соответствовал возрасту при объеме тестикул на нижней границе возрастной нормы (10-12 мл).

Значительная фенотипическая вариабельность также отмечена у трех больных с ранее описанной мутацией р^84И: у 2 пациенток с ЖПП строение НПО соответствовало Прадер 3, что сочеталось с расположением гонад в паховом канале, и у 1 пациента с МПП имела место степень Прадер 4 без крипторхизма. Два сибса, зарегистрированные в МПП, при одной и той же известной мутации р.И3170/зХ17 имели различную степень нарушения строения НПО: Прадер 3 и Прадер 4. У обоих отмечено самостоятельное спонтанное половое созревание. На момент обследования (16 и 18 лет) у обоих уровень гонадотропинов, как и в вышеописанном случае, умеренно превышал верхнюю границу нормы, при низко-нормальном значении уровня тестостерона размер яичек соответствовал нижней границе нормы (см. табл. 2).

Среди впервые выявленных вариантов изменений в гене ЫН1А1 два приводят к образованию стоп-кодона -р.У197Х и р.У25Х, два к сдвигу рамки считывания — p.N385fs и p.L245fs, что не позволяет сомневаться в их патогенности

Среди ранее неописанных вариантных изменений 5 миссенс-мутаций (р.С283У, р.С283Р, р.И240, р.М126К,

p.E81K) и 1 синонимичная замена, затрагивающая сайт сплайсинга (E330E), были оценены как патогенные, а 5 других — как вероятно патогенные.

Фенотипические, гормональные и молекулярно-генетические данные пациентов даны в таблице 2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Стероидогенный фактор I является ключевым регулятором стероидогенеза и дифференцировки гонад. Впервые он был идентифицирован в 1992 г. [3] как транскрипционный фактор с тканеспецифической экспрессией, который распознает высококонсервативный регуляторный мотив в проксимальной промоторной области генов, кодирующих стероидные Р450-гидрок-силазы. Позже в исследованиях in vitro с адренокорти-кальными клетками было показано, что NR5A1 также стимулирует экспрессию рецептора к АКТГ (MCR2) и всех, а не только цитохром-Р450-зависимых ферментов стероидогенеза [16].

Неожиданным открытием оказалась роль NR5A1 в закладке и дифференцировке надпочечников и гонад. Так, у новорожденных NR5A1-/' мышей с кариотипом XY наряду с инверсией мужского пола на женский и наличием ДМП отсутствовали гонады и надпочечники. Также благодаря данной модели выяснилось, что, помимо агенезии гонад и надпочечников, у мышей отмечались признаки первичного нарушения гонадотропной функции и агенезия вен-тромедиальных ядер гипоталамуса [16]. Изучая данный феномен, Halvorson и соавт. показали, что NR5A1 также регулирует экспрессию ß-субъединицы ЛГ и рецептора гонадотропин-рилизинг-гормона [17]. Таким образом, к настоящему времени установлена роль NR5A1 в формировании, дифференцировке и функционировании гипота-ламо-гипофизарно-надпочечниковой и гонадной систем.

Белок NR5A1 состоит из 461 аминокислот и кодируется геном NR5A1, который располагается на длинном плече 9 хромосомы (9q33). Ген состоит из 7 экзо-нов, из которых 6 являются кодирующими. В строении NR5A1 выделяют несколько ключевых доменов: А-box — ДНК-связывающий домен с двумя цинковыми пальцами, отвечающий за специфичность связывания, менее консервативная hinge (шарнирная) область, лиганд-связы-вающая область и два домена, отвечающие за активацию функции NR5A1: AF1 и AF2. До сих пор остается неизвестным, что является регулятором транскрипции самого гена NR5A1. В настоящее время имеются два основных гена-кандидата, WT1 и CBX2, но прямых подтверждений данного взаимодействия пока не получено.

Учитывая данные, полученные на мышах, изначально проводился поиск мутаций в гене NR5A1 среди пациентов, имевших сочетание дисгенезии гонад 46,XY с надпочечниковой недостаточностью. Но данный фенотип оказался редким. В литературе встречается лишь несколько описаний случаев НФП 46,XY с женским фенотипом, наличием ДМП, дисгенезией гонад в сочетании с первичной надпочечниковой недостаточностью, обусловленных мутацией в гене NR5A1 [5, 8, 15]. Одним из возможных объяснений редкости данного фенотипа может быть то, что мутации, возникающие в критических участках гена, приводят к агенезии надпочечников, по аналогии с мышиной моделью, что несовместимо с жизнью.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В 2004 г. ряд независимых групп описали гетерозиготные мутации в гене NR5A1 как причину изолированного нарушения формирования пола 46,XY, без нарушения функции надпочечников [6, 18], свидетельствующие о наличии гаплонедостаточности при мутациях в гене NR5A1.

В дальнейшем было показано, что гетерозиготные мутации в NR5A1 являются частыми причинами (до 20%) НФП 46,XY без ПХНН [2, 7, 8].

К настоящему времени описано более 190 мутаций в гене NR5A1, которые распределены относительно равномерно по всему гену [19]. При проведении фенотип-ге-нотипического анализа оказалось, что фенотип пациентов с дефектами NR5A1 вариабелен и может проявляться различной степенью нарушения строения НПО — от правильного женского строения до правильного мужского [7, 8, 19]. С учетом такого разнообразия Fabbri-Scallet и соавт. определили 10 фенотипов при мутациях в гене NR5A1, которые включают весь спектр состояний, ассоциированных с нарушениями в данном гене: чистая дис-генезия гонад ± надпочечниковая недостаточность (НН), смешанная дисгенезия гонад ± НН, овотестикулярное НФП, 46,ХХ-тестикулярное НФП, изолированная НН, синдром исчезнувших яичек, синдром поликистозных яичников, мужское бесплодие [19].

Помимо вариабельности фенотипических проявлений при одной и той же мутации у неродственных пациентов, различные клинические проявления встречаются и в одной семье. Philibert и соавт. описали пациента с гипоплазией яичек и микропенисом с гетерозиготной мутацией (p.V355M) в гене NR5A1, выявленной при анализе 24 пациентов с анорхизмом. Однако у его брата-близнеца, носителя аналогичной мутации, никаких отклонений при рождении не отмечалось, и в период пубертата половое развитие соответствовало норме [20]. Данный случай свидетельствует о наличии дополнительных неизвестных факторов, влияющих на экспрессию мутант-ного аллеля и, соответственно, предопределяющих вариабельность фенотипа.

С учетом такой полиморфности клинической картины нам представилось интересным проанализировать частоту встречаемости, фенотипические особенности и тактику ведения пациентов с мутациями в гене NR5A1 среди когорты российских пациентов с НФП 46,XY. Как видно из представленных нами данных, частота распространенности патологических замен в гене NR5A1 в нашей группе составила 11,6% от общего числа пациентов с НФП 46,XY, что сопоставимо с зарубежными данными.

По распределению выбора паспортного пола ребенка при рождении основным критерием было внешнее строение НПО. Так, в группе с нарушением строения НПО Прадер 2 все пациенты зарегистрированы в ЖПП, в группе с Прадер 4, все, кроме одного пациента, — в МПП, тогда как среди группы пациентов с Прадер 3 примерно одинаковое количество пациентов с ЖПП и МПП, что говорит о субъективности выбора пола.

Проведенные в нашей когорте обследования детям в период мини-пубертата показали относительную взаимосвязь между уровнем ФСГ, АМГ и степенью нарушения строения НПО. Так, среди детей с повышенным ФСГ уровень АМГ был ниже, и строение НПО у них было ближе к женскому. У всех обследованных детей отсутствовали характерные для «классических вариантов» дисгенезий

гонад высокие уровни гонадотропинов в этот период. Необычной для «классических вариантов» ДГ является и положительная проба с хорионическим гонадо-тропном, более того, у двух пациентов ответ был более 20 нмоль/л (гиперергический ответ), что более характерно для нарушения чувствительности к андрогенам. Таким образом, исследование гормонального фона в данной возрастной группе не позволяет заподозрить нарушения в NR5A1, но может указывать на сохранность стеро-идогенной функции клеток Лейдига, что, в свою очередь, может помочь в выборе паспортного пола ребенка.

Интересные данные получены по пациентам, достигшим полового созревания. У всех 5 пациентов с МПП, независимо от степени нарушения строения НПО при рождении, отмечено спонтанное половое развитие с удовлетворительным развитием вторичных половых признаков. Несмотря на малочисленность данной группы, интересно отметить, что на стадиях пубертата 3-4 (пациенты 13, 15 и 16 лет) уровень тестостерона соответствует стадии полового созревания, но к 18 годам он не достигает средних значений стадии 5 по Таннеру. При этом уровни гонадотропинов у пациентов оставались на верхней границе или чуть выше нормы. Это позволяет предполагать наличие сочетанного первичного и вторичного гипогонадизма, что можно объяснить важностью правильного функционирования NR5A1 как на уровне гонад, так и на уровне гипофиза. Важным наблюдением является развитие вирилизации у 3 пациенток с ЖПП с интактными гонадами в период полового созревания. У 2 из них (по 1 пациентке информация отсутствует) уровень тестостерона на момент обследования достигал нормальных значений для мальчиков данного возраста. Это свидетельствует о сохранности (восстановлении) стероидогенеза в клетках Лейдига несмотря на значительные нарушения строения НПО при рождении (Прадер 1-2), что важно учитывать при выборе пола воспитания ребенка. Одним из возможных объяснений может быть то, что после рождения происходит смена фетальных клеток Лейдига на клетки «взрослого» типа, которые являются другой клеточной популяцией [21]. На мышиных моделях было показано, что «взрослый» тип клеток Лейдига менее зависит от регуляторного влияния NR5A1, так как в них повышается экспрессия гена NR5A2, печеночного гомолога рецептора NR5A1, частично компенсирующего его функцию [22]. Единичные случаи спонтанной маскулинизации у фенотипических девушек с мутациями в гене NR5A1 описаны и рядом зарубежных авторов [9, 10]. Adachi и соавт. также привели анализ литературных данных гистологического материала удаленных гонад у таких девушек, так как риск малигнизации гонад при дисгенезии гонад 46,XY значительно выше, чем при других формах НФП [10]. В 8 случаях из 9 отмечалась выраженная гиперплазия клеток Лейдига на фоне гипо-и аплазии герминативных клеток. Ни в одном случае не описывались признаки малигнизации. Однако Cool и соавт. описали 2 пациентов с удалением гонад в период пубертата, у одного из которых был выявлен рак in situ [9]. Среди наших пациентов при воспитании в ЖПП удаление гонад производилось в большинстве случаев в раннем возрасте, и ни в одном гистологическом описании данных за малигнизацию получено не было. Среди 3 пациенток с вирилизацией в период пубертата также

не было гистологически выявлено признаков малигни-зации. Таким образом, в настоящее время не накоплено достаточно материала для объективной оценки риска малигнизации гонад у данной группы пациентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты свидетельствуют о высокой частоте мутаций в гене ЫН5А1 среди данной группы пациентов и отсутствии каких-либо фенотипических, биохимических маркеров, позволяющих предположить этиологию заболевания до проведения молекулярно-генетического анализа. Для более объективных выводов необходимо продолжить наблюдение за данной группой пациентов, особенно при достижении ими пубертата.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Публикация настоящей работы поддержана благотворительным фондом филантропии КАФ, программа «Альфа-Эндо».

Согласие пациента. Информированное согласие было получено от всех обследованных пациентов; если возраст обследованных не достиг 15 лет, информированное согласие было подписано законным представителем.

Участие авторов. Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES

1. Калинченко Н.Ю., Тюльпаков А.Н. Новая классификация заболеваний, связанных с нарушением формирования пола. Обсуждение международного консенсуса по пересмотру терминологии и классификации гермафродитизма // Вестник репродуктивного здоровья. — 2008. — №3-4. — С. 48-51. [Kalinchenko NY, Tyulpakov AN. Novaya klassifikatsiya zabolevaniy, svyazannykh s narusheniyem formirovaniya pola. Obsuzhdeniye mezhdunarodnogo konsensusa po peresmotru terminologii

i klassifikatsii germafroditizma. Bulletin of reproductive health. 2008;(3-4):48-51. (In Russ.)].

2. Lee PA, Nordenstrom A, Houk CP, et al. Global disorders of sex development update since 2006: perceptions, approach and care. Horm Res Paediatr. 2016;85(3):158-180. doi: 10.1159/000442975.

3. Lala DS, Rice DA, Parker KL. Steroidogenic factor I, a key regulator of steroidogenic enzyme expression, is the mouse homolog

of fushitarazu-factor I. Mol Endocrinol. 1992;6(8):1249-1258. (doi: ЮЛ210/гте^.6.8.1406703.

4. Horn F, Windle J, Barnhart, Mellon PL. Tissue-Specific gene expression in the pituitary: the glycoprotein KM hormone alpha-subunit

gene is regulated by a gonadotrope-specific protein. Mol Cell Biol. 1992; 12(5):2143-2153. doi: 10.11 1

5. Achermann JC, Ito (VI, Ito M, et al.A mutation in the gene encoding steroidogenic factor-1 cavses xy sex reversal and adrenal failure in humans. Naf Genet. 1999;22(2):125-126:do¡: 10.1 03819629.

6. Correa RV, Domnnice S, Bingham NC, et aL A microdeletion in

the ligand binding domain ofhuman steroidogenic factor 1 causes XY sex reversal withoutadrenal insufficiency. JClinEndocrinolMetab. 2004;89(4):1767-1 h72. doi: 10.1210/jc.2003-031240.

7. Kohler B, Lin L, Mazen I , et al.The spectrum ofpfienotypes aosociated with mutationsin steroidogenic factor 1 (Sf-1, Nr5a1, Ad4bp)includes severe inenoscrotal hypospadias In 4-Éf^,hy males without adrene1 insufficiency Eur JEndocnnoL 2009;161(2):237-242. doi: 10.1 530/nje-09-0067.

8. Mal¡hova J, Camats N, Fernandez-Cancio M, et al. Human NR5A1/SF-1 mutationj showdecreased a.tivity on TONF (brain-denved oeurotroph¡c factor), en important regulator ofenergy balance: resting impact ofnovel SF-1 mutations be^ od steroidogenesis. PLOSOnm. 2014;9(a):e104838.do¡: 10.1371/jonrnsLpone.0104838.

9. Cools M, Hoebeke P, Wolffenbuttel KP, et aL Pubertal androgenization Cod g onadal Nstology in two 46,XY Pdolescente with NR5A1 mutations and predomin antly female phenotype at birth.

mur JEndocrinoL 20и;166(2):341 -349. doi: U.1530nEJE-11 -0392.

10. Adachi M, HasegawaT,Tanaka Y, et al. .pontaneous virilization around. pubeity in NR5A1-Related 46,XY sex repyrsal: additional case an d aliteratnre review. Eadocr J.2018;65f12):1 18П-1192. doi: 10.1507/endocrjiEJ18-0218.

11. 3ал:инченко Н.Ю., Аносова Т.А., Иоутси В.А., Тюльпаков А.Н. Дефектстероидогенного фактора 1 (SF1) какпричина нарушения Аор мирокт нитя пола 4е XY (первое описание в отечествен ной литературе) // Проблемы эндолринологии. — 2016. — Т.62. — №1. — С. 55-59. [Kalinchenko NY, Anosova TA, Ioutsi VA, K¡ulpakov AN.The first clinicalpresentation ofJ¡eorderf or sex development46 XYdue to mutation in steioidogeni cfactor 1 (SF1)

in Russian literature. Problemyendokririologii. 2016;62(1):55-59. (In Russ.)].Uoi:10.1'4341^|Drobl22016j6j2155-59.

12. Ric RrircSs S,Aziz N, Bale S,et al. Standards an(U guidelines for thie interpretztion oasequení^e vanantd a joint uonsensus recommendation of the Amnon Colle^g e of Medical Genetics and Genomics and the Aseociation forMolecular Pathotagy. Genet Med. G0)5;1 7(5)405-424. doi: 10.1038/gim:201 5.3 IP.

13. Рыжко7а О.П., Карды ivíoh ОЛ., Прохорчук Е.Б., и др. Руководство по интер претации данны1х лоследоватулсности ДНКУ человека, полученный методами массового оараллелсного секвелирования (М0Л1) (редакмия 2018, версия 0) 0/ Медиленсная оенетика. — а019. — Т.18. — №2. -и С. 3-23. [Ry^ova OP, Karctymon OL, Prohor^huk

EES, et al . Rukovod st-o po iy/arera/a/sii dannykh eoslaUova/ê;Lnos/i DN e cheluveka, poluc hennykh metoci ami massovo^^h |11vrrill(^Гnotз o sekKenírovaníya(MPS) (raUal</siya 2018,versiya 2). Medieal Genntics. 2019;1 8(2)3-ya. (In Russ.)]. doii 10.25557/2073-2^98.2019.0'23-'23.

14. 2osso N, fRey 2A, Picard JO. Ant¡-Müller¡/n hormone: a valu3ble aUUitionto the toolbox of the pediatric endocrinologist. jntJEndochinol. 2013;201 Œ5:674i 05. doi: 10.1155/2013/674105.

15. Otekhova A, Kalinchenko N, (Morozdv I, et al. A novel m7tation in s he critical p-box residue ofsteroidogenic factor-1 |e1ess/nting vnith XO sex reversal and transi ent odrena! failure. Horm^ Pandiatr. 2018;89 (6)450-454. doi: 10г11 5Г/00048 17 76.

16. PK1ker, Keith L, Schimme r №. Steroidogenic factor 1: a key determinant ofendocrine development and fuhction| andocrRev. 1997;18(3):36 1-377. doi: 1 0^ 210/edrv.18.3.U301.

17. Hal/oreon l_M, Kaiser UB, Chin WW. Stimulatioк of luteinizing hormone beta gene promoter act.vity by the orphan nuclegr receptor, sterol dogenic factor-1. JBiolChem. 1 996;271 02):6645-6650. doi: i0.1074/jbu.2nT12.6645.

18. Hasegawa T, Fukami M, Sato N, et al. Testicular dysgenesis without adrenal insufficiency in a 46,XO patient with a heterozygous inactive mutation of steroidogenic factor-1. J Clin Endocrinol Metab. 2004;8e(12):5930-U935. doi: 10.1210/(c2004-0935.

19. Fabbri-Scallet H, de Sousa LM, Maciel-Guerra AT, et al. Mutation update for the NR5A1 gene involved in DSD and infertility. Hum Mutat. 2020;41(1):58-68. doi: 10.1002/humu.23916.

20. Philibert P, Zenaty D, Lin L, et al. Mutational analysis of steroidogenic factor 1 (NR5a1) in 24 boys D with bilateral anorchia: a french collaborative study. Hum Reprod, 2007;22(12):3255-3261.

doi: 10.1093/humrep/dem278.

21. O'Shaughnessy PJ, Baker PJ, Johnston H. The foetal leydig cell -differentiation, function and regulation. Int JAndrol. 2006;29(1):90-95. doi: 10.1111/j.1365-2605.2005.00555.x.

22. Oazawa T, Inanoka O, Mizutani T, et al. Liver receptor homolog-1 regulates the transcription of steroidogenic enzymes and induces the differentiation of mesenchymal stem cells into steroidogenic cells. Endocrinology. 2009;150:3885-3893. doi: 10.1210/en.2008-1310.

23. Ahmed SF, Rodie M. Investigation and initial management of ambiguous genitalia. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2010;24(2):197-218. doi: 10.1016/j.beem.2009.12.001.

Рукопись получена: 28.05.2020. Одобрена к публикации: 29.06.2020. Опубликована online: 10.08.2020. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ [AUTHORS INFO]

*Калинченко Наталья Юрьевна, к.м.н. [Natalia Yu. Kalinchenko, MD, PhD,] адрес: Россия, 117036, Москва,

ул. Дм. Ульянова, д. 11 [address: 11 Dm Ulyanova street, 117036 Moscow, Russia];

ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2000-7694; eLibrary SPIN: 6727-9653; e-mail: [email protected]

Анна Александровна Колодкина, к.м.н. [Anna A. Kolodkina, MD, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7736-5372; SPIN-код: 6705-6630; e-mail: [email protected]

Надежда Юрьевна Райгородская, д.м.н. [Nadezda Y. Raygorodskaya, MD, PhD];

ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0361-5329 SPIN-код: 4227-4358; e-mail: [email protected]

Анатолий Николаевич Тюльпаков, д.м.н. [Anatoly N. Tiulpakov, MD, PhD] Russia];

ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8500-4841; SPIN-код: 8396-1798; e-mail: [email protected]

ЦИТИРОВАТЬ:

Калинченко Н.Ю., Колодкина А.А., Райгородская Н.Ю., Тюльпаков А.Н. Клинические и молекулярно-генетические характеристики пациентов с нарушением формирования пола 46,XY, обусловленным мутациями в гене NR5A1 // Проблемы эндокринологии. — 2020. — Т. 66. — №3. — С.62-69. doi: https://doi.org/10.14341/probl12445

TO CITE THIS ARTICLE:

Kalinchenko NY, Kolodkina AA, Tiulpakov AN. Clinical and molecular characteristics of patients with 46,XY DSD due to NR5A1 gene mutations. Problems of Endocrinology. 2020;66(3):62-69. doi: https://doi.org/10.14341/probl12445