CC BY
18
Хирургия органов эндокринной системы
© Коллектив авторов, 2009 УДК 616.441-006:575
А.Ф.Романчишен, А.С.Кузьмичев, А.А.Богатиков, Е.Б.Морозова, А.Б.Чухловин, А.А.Тотолян
КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ ПРИ РАКЕ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Кафедра госпитальной хирургии с курсами травматологии, военно-полевой хирургии (зав. — проф. А.Ф.Романчишен) Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии Росздрава; Санкт-Петербургский центр хирургии и онкологии органов эндокринной системы
(зав. и руков. — проф. А.Ф.Романчишен), Научный центр по молекулярной медицине (руков. — проф. А.А.Тотолян) Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П.Павлова
Ключевые слова: рак щитовидной железы, генный полиморфизм, матриксные металлопротеиназы, ангиотензинпревращающий фермент.
Введение. Опухоли щитовидной железы (ЩЖ) составляют примерно 1% от всех злокачественных опухолей в экономически развитых странах. Рак щитовидной железы (РЩЖ) является наиболее частой злокачественной опухолью эндокринных органов.
В настоящее время хирургическое лечение больных с РЩЖ остается основным. Главными требованиями, выдвигаемыми практической хирургией, являются раннее выявление опухоли, прогнозирование течения опухолевого процесса, определяющие выбор оптимальной тактики лечения каждого больного. Существенную роль в решении этого вопроса отводят опухолевым маркерам, которые определяют возникновение и развитие опухолевого процесса.
В диагностике РЩЖ основное внимание уделяется различным онкогенам [9]. В то же время модифицирующие влияния других факторов, определяющих течение РЩЖ, пока мало изучены. Так, одной из важных особенностей опухолей щитовидной железы считается обильное кровоснабжение, обеспечиваемое сосудистой сетью, формирующейся de novo под влиянием факторов, секретируемых опухолью [11]. Это обстоятельство может свидетельствовать о важной роли обмена коллагена в процессах опухолевого неоангиогенеза. По данным большинства
авторов, активация различных видов матриксных металлопротеиназ (ММР) при онкологических заболеваниях является важным фактором опухолевой инвазии и метастатических процессов, поскольку эти ферменты расщепляют коллаген и другие молекулы внеклеточного вещества, способствуя дальнейшему росту злокачественной опухоли [4]. В частности, ММР активно участвуют в процессах реструктурирования межклеточного матрикса.
В последние годы появились целый ряд работ, которые говорят об противоопухолевых эффектах активации ММР [7]. Эти данные подчеркивают важность анализа как про-, так и антибластомных эффектов отдельных видов ММР при злокачественных новообразованиях. Среди энзимов этого класса особую роль играет матриксная металлопротеиназа типа 1 (ММP-1), которая осуществляет первичную деградацию молекул коллагена. Дальнейшая деградация внеклеточного вещества происходит при участии остальных ММР, в частности стромелизина-1 (ММР-3).
Одним из факторов, регулирующих продукцию молекул ММР, может быть полиморфизм регуля-торных участков соответствующих генов. При наличии у больных того или иного варианта гена может существенно изменяться продукция мРНК и соответственно — специфического белка-проэн-зима. В связи с этим у носителей «гиперактивных» промоторных вариантов усиливается склонность к различным заболеваниям.
Одним из важных регулирующих факторов опухолевого роста признан хорошо изученный полиморфизм гена ангиотензин-конвертирующего энзима (АСЕ-1), который регулирует активность ММР-1 [2].
Таким образом, процессы ремоделирования межклеточного вещества и неоангиогенеза в злокачественных опухолях имеют большое значение для контроля их роста и диссеминации в организме.
В доступной литературе отсутствуют систематические сведения о влиянии различных функциональных вариантов генов ММР-1 и ММР- 3, а также АСЕ-1 и PAI-1 на развитие, темпы роста и риск метастазирования рака щитовидной железы.
В связи с этим целью настоящей работы явилось изучение диагностической значимости генов системы протеолиза при РЩЖ, а также оценка их модифицирующей роли в течение заболевания.
Материал и методы. В исследование были включены 105 больных с РЩЖ, лечившихся с 2004 по 2007 г. в Санкт-Петербургском городском центре хирургии и онкологии органов эндокринной системы. Большинство больных были женщины, 90 (86,5%), мужчин было 15 (13,5%). Соотношение мужчин и женщин составило 1:6. Возраст больных на момент установления диагноза колебался от 17 до 80 лет и в среднем составил (51,6±1,9) года. Более половины пациентов (51, или 51,0%) были в возрасте 40-60 лет.
У 91 пациента был диагностирован папиллярный рак, у 14 — фолликулярный РЩЖ. Морфологическая верификация диагноза проводилась по образцам операционного материала. Степень дифференцировки опухоли была высокой в 50% случаев, умеренной — у 44% больных и низкой — в 6% случаев.
Прогноз выживаемости оперированных больных оценивался по системе AMES (возраст, метастазы, первичная опухоль, размеры), разработанной в клинике F.Lahey.
Оценка распространенности опухолевого процесса осуществлялась в соответствии с Международной классификацией РЩЖ по системе TNM и была следующей: Т1 — 32,0%, Т2 — 23,0%, Т3 — 33%, Т4 — 12,0%. У 10 больных выявлен многофокусный рост опухоли, у 9 из них имела место папиллярная и у 1 — фолликулярная карциномы.
Метастазы в шейных лимфатических узлах обнаружены у 35 (34,6%) больных. В 21 (20,1%) наблюдении метастазы были с одной стороны (N1a) и у 14 (13,4%) — отмечалось двустороннее поражение шейных лимфатических узлов (N1b). Отдаленных метастазов РЩЖ в момент первичного осмотра не было.
У 11 пациентов в анамнезе были указаны кровные родственники с диагностированной узловой патологией ЩЖ.
С целью изучения молекулярно-биологических аспектов патогенеза рака ЩЖ проводилось генотипирование промо-торных аллелей генов MMP-1 (1G/2G) и MMP-3 (5А/6А), PAI-1 (4G/5G), а также гена АСЕ-I I/D (инсерционный и делеционный варианты).
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов крови больных и доноров после лизиса, иммобилизации и очистки ДНК на сорбенте, с применением набора «ДНК-Сорб» («Литех», Москва). Генотипы MMP-1 (1G/2G), MMP-3 (5A/6A) опре-
деляли с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Подбор соответствующих прай-меров осуществляли с помощью программы Primer Express (Applied Biosystems, Германия), причем искомый точечный полиморфизм располагали на 3'-конце передних праймеров.
Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5хПЦР-буфер («Амплисенс», Москва); смесь дезоксинуклеотидов (MBI Fermentas, Каунас, Литва), прай-меры (от 0,05 до 0,3 pM) производства «Синтол» (Москва), ДНК-Taq полимеразу («ДНК-Технология», Москва), 1,0 МЕ в пробе) и геномную ДНК (2,5 мкл на реакцию), в общем объеме 20 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе ICycler («Bio-Rad», США). Режимы ПЦР были следующими: 94 °C, 5 мин; 40 циклов ПЦР; денатурация: 94 °C, 30 с; отжиг в течение 30 с: 67 °C (АСЕ), 55 °C (MMР-1), 54 °C (MMP-3/5A), 49 °С (MMP-3/6A); элонгация: 72 °C, 30 с (40 циклов); 72 °C, 7 мин. Продукты ПЦР оценивали после электрофореза в 1,5% агарозном геле при окраске этидий-бромидом. Визуализацию специфических продуктов осуществляли с помощью УФ-трансиллюминатора. Изображения фиксировали с помощью цифровой фотокамеры Canon PowerShot A70. Статистический анализ проводился путем непараметрического анализа (тест X2), с помощью пакета программ Winstat.
Результаты и обсуждение. Согласно сводным данным нашего исследования, выборка больных с РЩЖ не отличалась по исследованным генетическим маркёрам (ММР-1, ММР-3, PAI-1 и АСЕ-1) от показателей контрольной группы. Изученные варианты всех 4 генов распределялись в популяции больных практически в соотношении 1:2:1, что соответствует показателям контрольных групп из населения Санкт-Петербурга. Поэтому в дальнейшем мы изучали корреляции между частотой этих аллелей и клиническими особенностями заболевания.
В процессе анализа данных была обнаружена достоверная связь между определенными генетическими маркерами и возрастом больных РЩЖ. В частности, средний возраст больных с носи-тельством аллеля ММР-3/5А составлял 48 лет, а с генотипом ММР-3/6А — 59 лет (р<0,01). Аналогичная взаимосвязь обнаружена с комбинированным генотипом ММР-3/SA/AŒ-D. Известно, что ММР-3 (стромелизин) является активным фактором деградации межклеточного вещества и поэтому участвует в его перестройке и ремоделировании сосудистых структур, что является существенным фактором роста первичной опухоли. Генотип АСЕ-D является фактором повышенной активации молекул про-ММР. Это может объяснять их сочетанное влияние, выражающееся в более раннем развитии у больных с РЩЖ.
В группе пациентов с папиллярным раком (n=90) выявлена ассоциация между ММР-3/5А (более активным аллелем) и размером опухоли. Этот генный вариант встретился у 27 из 28 (97%) больных с размером опухоли до 2 см и у 48 из 62
Том 168 • № 1
Металлопротеиназы при раке щитовидной железы
(77%) пациентов с размером опухоли более 2 см (р=0,04), что также возможно свидетельствует о протективной роли ММР-3/5А в ограничении роста опухоли.
В группе женщин с метастатическими формами папиллярного рака отмечена достоверно сниженная частота гиперактивного генотипа ММР-1/2G (59%) по сравнению с больными без метастазов (82%) (р=0,04). Это может говорить о защитном действии аллеля в метастазировании опухоли (рисунок).
Возникновение папиллярного РЩЖ многие авторы связывают с мутациями RAS, BRAF и других онкогенов [1, 9]. Помимо этого, известно, что гиперактивные генные варианты матриксных металлопротеиназ могут увеличивать частоту целого ряда злокачественных новообразований [4]. В нашем исследовании была показана выраженная связь между наличием гиперактивного аллеля 5 А гена ММР-3 (стромелизина) и более ранним возрастом появления клинически значимых форм РЩЖ. Не исключено, что при наличии у больных гиперактивного аллеля 5А гена ММР-3 патологические изменения коллагеновой стромы щитовидной железы проходят более быстрыми темпами, что способствует раннему развитию клинически выявляемой опухоли.
Связь генотипа ММР с ростом и инвазив-ностью опухоли. Темпы злокачественного роста и риск метастазирования карциномы ЩЖ во многом определяются уровнем дифференцировки и другими свойствами самой опухоли. Папиллярный РЩЖ у обследованных нами больных характеризовался относительно медленной прогрессией. Одной из причин такого течения заболевания может быть контроль роста опухоли со стороны иммунной системы организма [10]. Клеточные популяции (лимфоциты, макрофаги), осуществляющие противоопухолевые иммунные реакции, могут регулировать рост опухоли путем прямого цитотоксического эффекта либо посредством гуморальных факторов, подавляющих пролиферацию злокачественных форм. В работе E.Kebebew и соавт. [6] было показано, что у больных с папиллярным РЩЖ в сочетании с хроническим аутоиммунным тиреоидитом и лимфоцитарной инфильтрацией продолжительность жизни значительно дольше, а частота рецидивов заболевания была достоверно меньшей, что может говорить об участии иммунных факторов, препятствующих диссеминации опухоли.
В связи с этим можно предположить важную роль ММР в усилении противоопухолевых реакций организма при РЩЖ. Ранее предполагалось, что усиление активности коллагенолиза приводит к более агрессивному росту опухолей [4]. В последнее время появились также данные о том,
100-
8 за ? 60£ 40° 200-
Есть Нет
Наличие регионарных
Зависимость между наличием регионарных метастазов (по оси абсцисс) и носительством аллеля 20 гена ММР-1 (по оси ординат).
что активация матриксных металлопротеиназ на поздних стадиях развития различных опухолей может тормозить рост опухоли, и это может быть причиной неудач в экспериментальной терапии онкологических заболеваний препаратами, подавляющими активность коллагеназ [5]. Кроме того, активация ММР нередко связана с усилением цитотоксических иммунных реакций в организме.
В нашей работе было выявлено, что «гиперактивный» генотип ММР-3/5А ассоциирован с меньшими размерами опухоли, а наличие ММР-1/2G связано с меньшим риском развития регионарных метастазов. В связи с этим не исключена взаимосвязь между усиленным лизисом внеклеточного матрикса и облегченным поступлением иммунных клеток в зону опухоли. Показано, что повышенная экспрессия гена ММР-1 локализуется именно в зоне фиброзной капсулы опухоли [5]. Таким образом, биологические эффекты генов ММР могут быть существенным фактором ограничения темпов злокачественного роста и инвазивных свойств опухоли. Такие клинические данные появились в последнее время при изучении злокачественных заболеваний различных локализаций.
Таким образом, можно предположить, что повышенная продукция коллагеназ при гиперактивных генных вариантах ММР у больных может приводить к облегчению миграции иммунных клеток в зону опухоли и, тем самым, к торможению ее роста и диссеминации.
Выводы. 1. Показана достоверная взаимосвязь между более ранним возрастом развития РЩЖ и повышенной частотой генотипа ММР-3/5А ^=0,01).
2. В общей группе больных женщин РЩЖ выявлена обратная зависимость между гипер-
□ Есть аллель 2G ■ Неталлели 2G
активным генотипом MMP-1/2G и частотой появления регионарных метастазов (р=0,04). Поэтому гиперактивность генотипа MMP-1/2G можно учитывать как дополнительный фактор в определении хирургической тактики при лечении РЩЖ.
3. Наличие у больных аллеля 5А гена ММР-3 ассоциировано с меньшими размерами опухоли.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Берштейн Л.М. Рак щитовидной железы: эпидемиология, эндокринология, факторы и механизмы канцерогенеза // Практ. онкол.—2007.—№ 1.-С. 1-8.
2. Aust G., Hofmann A., Laue S., Rost A. et al. Human thyroid carcinoma cell lines and normal thyrocytes: expression and regulation of matrix metalloproteinase-1 and tissue matrix metalloprotein-ase inhibitor-1 messenger-RNA and protein // Thyroid.—1997.— Vol. 7, № 5.—P. 713-724.
3. Cady B. Staging in thyroid carcinoma // Cancer.—1998.—Vol. 83, № 5.—P. 844-847.
4. Fingleton B. Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis // Front. Biosci.—2006.—Vol. 11, № 1.—P. 479-491.
5. Kameyama K. Expression of MMP-1 in the capsule of thyroid cancer relationship with invasiveness // Pathol. Res. Pract.—1996.— Vol. 192, № 1.—P. 20-26.
6. Kebebew E., Treseler P.A., Ituarte P.H.G., Clark O.H. Coexisting chronic lymphocytic thyroiditis and papillary thyroid cancer revisited // World J. Surgery.—2001.—Vol. 25, № 5.—P. 632-637.
7. Martin M.D., Matrisian L.M. The other side of MMPs: protective roles in tumor progression // Cancer Metastasis Rev.—2007.— Vol. 26, № 3-4.—P. 717-724.
8. Mazzafferi E.L. An overview of the management of papillary and follicular thyroid carcinoma // Thyroid.—1999.—Vol. 9, № 5.— P. 421-427.
9. Riesco-Eizaquirre G., Santisteban P. Molecular biology of thyroid cancer initiation // Clin. Transl. Oncol.-2007.-Vol. 9, № 11.-P. 686-693.
10. Scouten W.T., Francis G.L. Thyroid cancer and the immune system: a model for effective immune surveillance // Expert Rev. Endocrinol. Metabolism.-2006.-Vol. 1, № 3.-P. 353-366.
11. Turner H.E., Harris A.L., Melmed S., Wass J.A.H. Angiogenesis in endocrine tumors // Endocrine Reviews.-2003.-Vol. 24, № 5.-P. 600-632.
Поступила в редакцию 26.05.2008 г.
A.F.Romanchishen, A.S.Kuzmichev, A.A.Bogatikov, E.B.Morozova, A.B.Chukhlovin, A.A.Totolyan
CLINICAL SIGNIFICANCE OF FUNCTIONAL VARIANTS OF MATRIX METALLOPROTEINASE GENES IN THYROID CANCER
Under analysis were results of genetic investigations of 105 patients with thyroid cancer (TC) treated from 2004 through 2007 in the St.Petersburg City Center of surgery and oncology of the endocrine system organs. The patients' age was from 17 to 80 years (mean age 51.6±1.9 years). The influence of functional variants of matrix metalloproteinase genes in TC was determined. A reliable correlation was noted between certain gene markers and TC patients' age. An association was revealed between matrix metalloproteinase-3 5A (more active allele) and size of the tumor. A reliably decreased frequency of hyperactive genotype MMP-1 2G was detected in a group of women with metastatic forms of papillary cancer as compared with patients without metastases. It was shown that MMP genes could be a substantial factor of slowing down the rate of malignant growth and invasive properties of cancer of the thyroid gland.
Е.И.Зайцев, А.А.Будко, Г.Б.Шикалов Некоторые юбилейные даты отечественной М6ДИЦИНЫ в 2009 I".
(по материалам Военно-медицинского музея и другим источникам)
150 лет (1859 г.)
Вышли в свет Именные указы:
• «О правилах для военно-медицинских библиотек и для снабжения военных врачей и фармацевтов классическими медицинскими сочинениями»;
• «О прикомандировании военных врачей к университетским и академическим клиникам для научного и практического специального образования».
Перед фасадом главного корпуса Медико-хирургической академии (с 1881 г. — Военно-медицинская академия) в Петербурге в 1859 г. был установлен памятник лейб-медику Якову Васильевичу Виллие (1768-1854), которые более 30 лет (1808-1838) был президентом Медико-хирургической академии (МХА). Я.В.Вилле был известным хирургом и медицинским администратором. Выпускник медицинского факультета Эдинбургского университета с 1790 г состоял на военной службе в России. Первоначально был лекарем Елецкого пехотного полка, а с течением времени стал «главным по армии медицинским инспектором» (1806-1854), директором Медицинского департамента Военного министерства (1812-1836), председателем Военно-медицинского ученого комитета (с 1843 г.). В 1823 г. основал Военно-медицинский журнал, издающийся и ныне. Участвовал как военный врач-администратор почти во всех войнах, которые вела Россия в первой половине XIX в. Во многом способствовал развитию военной медицины в России, умножению числа военных врачей из россиян, совершенствованию учебного процесса в МХА, упрочению материальной базы учебного процесса. Личные значительные средства действительный тайный советник баронет Виллие завещал на постройку в МХА клиник на высшем европейском уровне (Михайловская клиническая больница — Клиника Виллие в ВМА).
В 1949 г. памятник Виллие (скульптор Д.И.Иенсен, архитектор А.И.Штакеншнейдер), стоявший перед Военно-медицинской академией (ВМА), был перемещен во внутренний парк ВМА (к заднему фасаду «Клиники Виллие»), чтобы не смущать жителей Ленинграда «преклонением перед иностранщиной». Теперь перед ВМА стоит памятник богине-покровительнице медицины.
Начало см. на стр. 30, 53 Продолжение см. на стр. 83
