Клеточные технологии с позиций синергетики Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

Раздел I.

БИОЛОГИЯ СЛОЖНЫХ СИСТЕМ. ФИЗИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ И МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ОРГАНОВ И СИСТЕМ ЧЕЛОВЕКА

УДК 616-092.8; 576.37;681.573.7

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ С ПОЗИЦИЙ СИНЕРГЕТИКИ А.А. ХАДАРЦЕВ*, В.М. ЕСЬКОВ**, В.А. ХАДАРЦЕВ***, Д.В. ИВАНОВ***

Ключевые слова: синергетика, клеточные технологии

Современная наука подошла к изучению сложных, многосвязных и неопределенных процессов, когда подходы: детерминистский (причинно-следственный), стохастический (когда многократным повторением опытов находятся параметры порядка -наиболее значимые симптомы, их совокупности, и определяются средние величины), оказываются бесполезными. Динамика поведения молекул, космических тел (при описании движения астероидов), других систем - обусловливает необходимость использования других подходов, учитывающих хаотическую природу изучаемых объектов, в частности - синергетического.

Биосистемы, организм человека - состоят из множества открытых (обменивающихся с окружающей средой, в т.ч. информацией) систем (клетки, ткани, органы, функциональные системы), обеспечивающих целенаправленную деятельность. Эти объекты работают по принципу самоорганизации.

Оказалось ошибочным мнение, что достаточно иметь простые коды, гены и обеспечить считывание информации, чтобы воспроизвести работу ДНК. Имеется сложнейшая самоорганизация ДНК, когда с одного ее участка можно получить разную информацию, зависящую от начала отсчета или конкретной среды клетки. Самоорганизация обеспечивает конечный эффект клетки при делении, фенотипическое развитие организма, всей экосистемы, в которой нарастают хаос, усугубляемый генной инженерией, войнами, деятельностью промышленности. Предложенный Г. Хакеном термин синергетика заостряет внимание на согласованности взаимодействия частей при образовании структуры, как единого целого. Синергетика как наука изучает процессы самоорганизации, возникновения, поддержания устойчивости и распада структур самой различной природы. Исследования ведутся силами и средствами различных наук, имеющих уже сложившуюся терминологию и особые методы.

Синергетика - (от греческого synergetikos, aoKtxnypsvta -совместный, согласованно действующий). Это наука, изучающая связи между элементами структуры (подсистемами), которые образуются в открытых системах (биологических, физикохимических и др.) благодаря интенсивному (потоковому) обмену веществом и энергией с окружающей средой в неравновесных условиях. Классический детерминизм Лапласа с его четкими причинно-следственными отношениями сменился вероятностным подходом. В биологии и медицине - это методы стохастического, вероятностного анализа. В физике это соответствует законам квантовой механики. Им на смену пришло понятие хаоса. В системе «определенность - неопределенность» детерминизм и хаос занимают крайние позиции. Сам хаос может формировать порядок. Броуновское движение молекул суммируется в стохастическую упорядоченность органов и тканей, а затем - в детерминизм функционирования органов и систем. Взаимодействие между хаосом, детерминизмом и стохастикой обусловили развитие синергетики, как науки. Детерминизм оказался справедливым лишь в контексте определенных договоренностей. Хаос - постоянен (броуновское движение молекул и пр.). Хаотическая динамика биосистем из-за обилия дублирующих механизмов и обратных регуляторных связей в организме становится стохастической (имеющей разброс показателей вокруг средних значений). А на коротких интервалах

**ГОУ ВПО «Тульский государственный университет»

**ГОУ ВПО «Сургутский государственный университет»

ГУП ТО НИИ новых медицинских технологий

времени для конкретного организма при описании его изменений можно использовать и детерминистский подход.

В биологических системах возможен переход от детерминизма к стохастичности и к хаотичности. Так, простые детерминированные системы с малым числом компонент могут порождать случайное поведение, которое нельзя предсказать, сколько бы информации не собиралось. Такую случайность стали называть хаосом. И в этом смысле хаос детерминирован. Важным понятием является «гиперцикл» по М. Эйгену - это «принцип естественной самоорганизации, обусловливающий интеграцию и согласованную эволюцию системы функционально связанных самореплицирующихся единиц». Каждая клетка представляет собой переменную, хранящую 8 бит информации, которые разделены на 4 поля по функциональному признаку (комплектация, специализация, рост, связи) - рис. 1.

Spvrial

Рис. 1. Информационное строение клетки

Усложнение эволюционирующей системы в природе достигается при помощи усложнения клетки, а не правил взаимодействия между клетками. Молекула ДНК представляет собой кластер, состоящий из субъединиц (компартментов). Клетка - тоже кластер, содержащий компартменты в своей мембране и внутри клетки (органоиды). Органы - кластеры, содержащие приблизительно одинаковые компартменты - клетки. Организм

- кластер с иерархически организованными компартментами -органами. Один из аспектов самоорганизации живых организмов

- их способность к поддержанию своей структуры путем своевременного определения неисправностей и самовосстановления. Так, молекулы ДНК в клетке постоянно подвергаются различным воздействиям: облучением, химическими агентами, нуклеазами, тепловым движением. В клетке имеется репарирующая система отслеживания повреждений и их исправления. Эта работа выполняется ферментами различных типов: одни ферменты находят поврежденные места и помечают их, другие - вырезают поврежденную часть, третьи - наращивают молекулу в нужном месте.

Синергетика исследует диссипативные структуры - пространственно неоднородные типы упорядоченности, возникающие в нелинейных диссипативных системах вдали от равновесия. Ранее изучался макромасштаб, где можно было оперировать с макропеременными

- концентрациями, температурами, плотностями и т.д. Но для синергетики и нанобиологии важными являются качественные изменения и типы самоорганизации, свойства возникающих структур при уменьшении пространственных масштабов. Диссипация ассоциируется с понятием рассеяния различных видов энергии, затухания движений, с потерей информации. Но в открытых системах диссипация служит источником образования структур: временных, пространственных и пространственно'-временных (автоволн). Именно в них и осуществляются кооперативные явления. При образовании диссипативных структур важна роль коллективных, совместных действий, получивших терминологическое звучание -синергетика. Биосистемы часто трактуют как химические машины. Однако в последнее время подчеркивается принципиальная роль в их самоорганизации - электромагнитных полей. Многие органеллы клетки, и сама клетка, и организм, и сознание являются системами с огромной степенью параллельности, поэтому в синергетике активно развивается парадигма сложности. Одновременно удается построить базовые модели редких катастрофических процессов. Парадигма сложности дает объяснение гигант-

скому усилению в сложных системах, находящихся на кромке хаоса. Она позволяет оперировать с категорией ценности информации, моделировать распространение одного варианта выбора в ходе развития. Развитие этого направления позволяет предложить механизмы «вывода» результатов процессов с наноуровня на макроуровень и найти оригинальные способы решения нанотехнологических проблем. Доказательством самоструктурирования процессов, в частности, в поверхностных слоя воды, является их изучение при тепловизионном исследовании.

Распределение температуры в верхних слоях воды и многокомпонентных водных растворах были изучены при помощи высокочувствительной фокусной инфракрасной микроболометрической (матричной) неохлаждаемой камеры со спектральным окном в 3-5 микрон. Температурная чувствительность была лучше чем 15 тк при 200 положениях в сек. Визуализировались различия между чистой и смешанной водой, наблюдалась динамика неоднородных структур в поверхностных слоях водных и многокомпонентных водных растворов. Из-за относительно высокой энергии испарения поверхностная температура на 0,4-0,6° ниже по сравнению с температурой 0,2-0,5 мм ниже поверхности. Благодаря конвекции воды в поверхностных слоях реалируется механизм самоорганизации, который ассоциируется с хаосом - нарушением порядка в присутствии температурных градиентов (рис. 2, 3).

Рис. 2. Автоволны в поверхностных слоях воды при остывании (макроуровень, размер объекта 10-12 см в диаметре - чашка Петри)

Б)

Рис. 3. Термограммы при остывании воды (А) и тезиограммы при высыхании микрообъекта биологической жидкости (крови) - Б (ув. х360) (Кидалов В.Н., Хадарцев А.А., 2009; Хижняк Е.П., 2009)

Полученные результаты демонстрируют, что поверхностные слои воды можно рассматривать как структуру, которая остается в неравновесной стадии относительно долгий период времени, а тезиограмма является фрактальным отображением на микроуровне автоволновых процессов в макросистемах. В молекулярной биологии изучается сценарий редактирования генома на основе данных о геномах известных организмов и «эволюционных часов», дающих вероятность возникновения мутаций. Предложена согласованная картина структур (материальных носителей той или иной способности) и функций (программ действий структур). В отношении функций в эволюционной биокибернетике на основе теории нейросетей показано естественное усложнение реакций в ходе эволюции от простейшей раздражимости до появления логического мышления, а также возникновение метапрограмм - программ следующего уровня. Развитие клеточных технологий попадает в сферу интересов синергетики, использующей присущую ей терминологию.

Фазовое пространство состояний (ФПС) - это абстрактное пространство, в котором координатами служат компоненты состояния, степени свободы системы. Это ^-мерное пространство, с ^-подпространствами, характеризующими русла.

В ФПС многих объектов, систем - имеются области, называющиеся (в терминах синергетики) областями джокеров, когда любой случайный фактор, как игровой элемент, оказывается решающим и влияет на судьбу системы, или даже может перевести всю систему скачкообразно в другую область фазового пространства. В этих областях определяющими становятся быстрые переменные. Правила, которые описывают такой скачок, и называются джокером. В ФПС существуют также области, характеризующие поведение системы по прошествии длительного времени, которые получили название аттракторов (от англ. tu attract -притягивать). Аттрактор - это то, куда система стремится, к чему притягивается. Существуют хаотические аттракторы, действующие как насос, подкачивающий микроскопические флуктуации в макроскопическое их проявление. Здесь предсказуемости нет. Неопределенность начального измерения покрывает весь аттрактор и делает невозможным предсказания. Но имеется методика воссоздания, реконструкции ФПС, позволяющая искать эти хаотические (странные) аттракторы. В организме человека центральный акцептор действия (по П. К. Анохину), определяющий поведение системы, является многомерным, хаотическим, странным аттрактором, к которому стремится биодинамическая система, осуществляя свою самоорганизацию.

Системный синтез позволяет определить, как происходит самоорганизация в пространстве возможностей, признаков и степеней свободы системы, как человек оперирует нечеткими множествами, определяя свое отношение к окружающему. Системный синтез обусловливает оптимальное построение баз знаний в целях самоорганизации этих знаний и навыков.

Системный синтез использует данные системного анализа для выделения небольшого числа параметров, определяющих вектор развития системы (русел), и взаимосвязи между этими параметрами. Процессы упрощения и выделения главного (методы осреднения в математике, многоуровневый синтез в программировании) уже применяются в науке. Синергетический подход позволяет выделять параметры порядка, русла, определять механизмы их перехода одно в другое, работать с джокерами.

Нашими исследованиями установлено существование синергично работающих систем, управляющих организмом человека. Кроме известной со времен Г. Селье гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, установлена роль ее антагониста - гипоталамо-гипофизарно-репродуктивной системы. Доказана их синергичная работа. Нашла подтверждение фазатонная теория мозга, базирующаяся на взаимодействиях ГАМК и допамина. Установлено также их тройственное (триад-ное) синергичное взаимодействие. Возможности синтоксических программ адаптации, способствующих сопереживанию систем организма с воздействиями внешнего и внутреннего факторов и контролируемой ими системы - ограничены. При их истощении возможна повторная активация кататоксических программ адаптации, направленных на отторжение этих факторов, но с большой вероятностью гибели организма. С позиций синергетики вариации воздействия возмущающих факторов лежат в области джокеров, поэтому их предсказуемость крайне низкая. Целенаправленное применение синтоксинов (экзогенных и/или эндогенных адаптогенов, активирующих синтоксические программы адаптации) способно перевести организм человека в новое русло, с предсказуемостью течения физиологических и патологических процессов. Имеющаяся информация о влиянии ряда компонентов растительного происхождения на активацию эндогенных стволовых клеток, подтверждает наличие интимных механизмов этих адаптогенов, синтоксический (или кататоксический) ответ которых осуществляется не без участия эпигенетических клеток.

Внедрение клеточных технологий в практику здравоохранения неизбежно сопряжено с синергетическими представлениями о процессах детерминированного хаоса в открытых системах, поскольку влияние вносимой извне информации (в т.ч. генетической) может вызывать трансформацию микроскопических флуктуаций в макроскопические, организменные проявления, а в отдельных случаях обеспечивать джокерный эффект. Различные физические поля и излучения человека при модулировании их в процессе физиологического функционирования несут информацию о самом функционировании, а изменение этой информации при направленном модулировании этих физических полей и излучений ведет к изменениям самого функционирования.

Ведутся работы по выделению индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток - недифференцированных клеток,

способных развиться в дифференцированные клетки разного типа. Они получаются в эксперименте из клеток взрослой мыши внедрением 4 дополнительных генов. Осуществляется совместная деятельность кафедры внутренних болезней с учреждениями здравоохранения по организации учебно-методического процесса, оказанию диагностической, лечебной, консультативной помощи и реабилитации больных: НИИ пульмонологии Минздрава РФ, Институт ревматологии, Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, НИИ нормальной физиологии РАМН им. П. К. Анохина. Нами осуществляются экспериментальные исследования по направленной дифференциации плюрипотентных стволовых клеток при воздействии полей и излучений. При этом используется воздействие радиации на биообъекты через частотные «окна» ультрафиолетового диапазона (1=290-390 нм), лучей видимого диапазона (1=390-760 нм), инфракрасного диапазона (1=760-1500 нм). Эти излучения способны вызывать резонансные отклики микроструктур живого организма.

Через радиоволновое «окно» проходят ЭМИ с длинами волн от 1-^50 м (2,39*1012 Гц - соматические клетки; 9,55* 1012 Гц

- ядра соматических клеток; 3,18*1013 Гц - митохондрии клеток печени; 2,5*1013 Гц - геном клетки человека; 7,5*10п Гц - хромосома интерфазная; 1,5*1013 Гц - хромосома метафазная).

Резонансные частоты структур клетки (2-9*109 Гц - ДНК; 4,5*1015 Гц - нуклеосома; 2,65*1015 Гц - рибосома; 5-1010 Гц -клеточные мембраны; 1011 Гц - цитоскелет).

Взаимодействия происходят в жидких средах различных структур организма. Поэтому необходимо учитывать общие закономерности протекания автоволновых процессов, фрактальные соотношения при формировании клеточных структур, зависящих не только от частот воздействия и интенсивности, но и от характера распределения излучения в жидких средах. Представляется перспективным детальное изучение гармонических соотношений при клеточном делении. Клеточные технологии, неразрывно связанные с нанотехнологиями, действительно, могут в определенных условиях стать «ящиком Пандоры» для человечества. Но синергетический принцип самоорганизации систем именно поэтому обусловливает необходимость работы в этих направлениях, чтобы исключить такую вероятность.

УДК 611.018.46

СОПОСТАВЛЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА И МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВЗРОСЛОГО КОСТНОГО МОЗГА В 2-D И 3-D КУЛЬТУРЕ: МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРОМАЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ

И.Н. САБУРИНА *, А.А. ГОРКУН*, Н.В. КОШЕЛЕВА*,

М.Л. СЕМЕНОВА**, А.А. ПУЛИН*, В.С. РЕПИН*

С первых работ Гаррисона и Карреля 2-D- и 3^-культивирование

клеток прогениторных и соматических клеток in vitro используют

для научных целей.

Ключевые слова: прогениторные и соматические клетки

Если монослойная культура позволяет изучать детали диф-ференцировки и фенотипы соматических клеток в монослое, то 3-D-культуры позволяют изучать сборку и морфогенез клеток в клонах/кластерах, прослеживать формирование и морфологию 3D сфер-клонов при регенерации стромы без участия эпителия.

Сравнительное 2-D- и 3^-культивирование стромальных прогениторных клеток используется для: 1) 2-D- и 3-D-клонообразования; 2) моделирования в микромасштабе одиночных кластеров и агрегатов, исключая влияние других клеток); 3) изучения регенерации изолированной стромы. Кроме того, трехмерные культуры МСК и стромальных прогениторных клеток -базис любой технологии получения инженерных тканей. Моно-слойные культуры имеют на порядок меньший потенциал васку-ляризации, гистогенеза и матриксзависимой дифференцировки по сравнению с 3^-культурой или переживаемой тканью [2,4]. В 3-D-суспензионной культуре отмечена дозовая зависимость скорости пролиферации, роста агрегатов и направления дифференци-ровки от размера агрегатов [8,1].

**ГУ РАМН НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова

Например, в суспензионных агрегатах эмбриокарциномы из 1000 клеток превалировала дифференцировка мезодер-мы/кардиомиоцитов, тогда как агрегаты из 4000 клеток в тех же условиях дифференцировались в энтодерму/гепатоциты [3]. Агрегация МСК в сферы в отсутствие матрикса возвращает чувствительность клеток к индукторам гаструлы и индуцирует образование мезо- энто- и нейроэктодермы из МСК-сфер [5,7]. Суспензионные клоны нейросфер были впервые получены в 1992 г. в бессывороточной среде. 90-95% исходных клеток в этих условиях погибало. Нейросферы в среде N2/B27+bFGF+EGF представляли собой интенсивно обновляемую кооперацию клеток из нейропрогениторов, полудифференцированных клеток, нейронов, астроцитов [6]. Первичные нейросферы из нестин+ Soxl+клеток были выделены из эпибласта, нервной пластинки и трубки. После диссоциации часть клеток первичных нейросфер формировали вторичные Soxl+нестин+клоны. Нейросферы, миосферы, другие динамичные агрегаты прогениторных клеток представляют собой прототип регенерационной ткани, возникающей ин ситу в эмбриогенезе.

Материалы и методы. Исследование формирования сфер/агрегатов, прототипа ранней регенерационной ткани, проводили на изолированных стромальных клетках пупочного канатика и мультипотентных стромальных клетках взрослого костного мозга (МСК) в малых плотностях 3-Э-культивирования, в отсуствие матрикса и других дифференцированных клеток. В реальных условиях в тканях формирование стромальных сфер блокировано дифференцированными эпителиальными клетками.

Образцы пупочного канатика были получены для исследования с добровольного согласия рожениц. Пупочный канатик тщательно отмывали от сгустков крови в растворе Хэнкса с антибиотиком (1% пенициллина/стрептомицина), удаляли сосуды и разрезали на фрагменты длиной 1-2 см, каждый фрагмент тщательно измельчали механически с помощью ножниц и подвергали ферментативной обработке (коллагеназы I и IV типа, 370C, 8 ч.). После ферментативной обработки материал процеживали через алюминиевую сеточку (размер пор 1 мм2), из полученных суспензий осаждали клетки центрифугированием (8 мин., 1000 об/мин, g=100 см2/с).

Стромальные клетки пупочного канатика и культуру МСК культивировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2) в полной ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2 мМ L), гентамицина (50 мкг/мл), инсулин-трансферрин-селенита (1:100) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, замену среды производили каждые 2 дня. Все культуры ежедневно микроско-пировали, оценивали степень конфлуэнтности. Когда монослой клеток занимал 80% поверхности чашки, культуры пассировали с использованием 0,25% раствора трипсина, действие трипсина инактивировали добавлением полной ростовой среды, плотность клеток при рассеве составляла >100 тыс.кл./мл. Перед каждым пассированием проводили подсчет клеток в камере Гаряева.

Для сравнительного анализа культур стромальных клеток пупочного канатика и МСК было проведено иммунофенотипиро-вание по следующим мембранным белкам: CD34, CD44, CD45 и CD90. Полученные результаты анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSAria (BD Biosciences, США) с помощью программы BD FACSDiva. Для оценки способности культур к образованию сфер/агрегатов культуры переводили на бессыво-роточную ростовую среду DMEM/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2 мМ L), гентамицина (50 мкг/мл), инсулин-трансферрин-селенита (1:100) на неадгезивный пластик.

Клеточные агрегаты изучали, используя трансмиссионную электронную микроскопию и иммуногистохимию. Для этого клеточные агрегаты фиксировали глютаровым альдегидом (1,5% раствор на 0,1М какодилатном буфере, pH=7,3, 1-2 ч.) дофикси-ровали OSO4 (1% водный раствор, 1-2 ч.). Для дальнейшей обработки отмытые от фиксатора агрегаты переносили в каплю расплавленного полужидкого 1,5% бакто-агара при 560С. Полученные агаровые блоки проводили по ряду восходящих спиртов (2 смены по 10 мин. в каждой), обезвоживали в ацетоне (3 смены по 10 мин. в каждой) и заключали в эпоновую смолу. Блоки резали на ультратоме «Tesla» серийно (толщина среза 1-2 мкм), до максимального диаметра клеточного агрегата. Полутонкие срезы окрашивали 0,5% раствором толуидинового синего в 1% растворе буры по стандартной методике (Детлаф, Бродский, Гаузе, 1974) и фоторегистрировали в видимом световом диапазоне под микроскопом Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) с помощью цифровой камеры AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Ультратонкие