CC BY
73
способных развиться в дифференцированные клетки разного типа. Они получаются в эксперименте из клеток взрослой мыши внедрением 4 дополнительных генов. Осуществляется совместная деятельность кафедры внутренних болезней с учреждениями здравоохранения по организации учебно-методического процесса, оказанию диагностической, лечебной, консультативной помощи и реабилитации больных: НИИ пульмонологии Минздрава РФ, Институт ревматологии, Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, НИИ нормальной физиологии РАМН им. П. К. Анохина. Нами осуществляются экспериментальные исследования по направленной дифференциации плюрипотентных стволовых клеток при воздействии полей и излучений. При этом используется воздействие радиации на биообъекты через частотные «окна» ультрафиолетового диапазона (1=290-390 нм), лучей видимого диапазона (1=390-760 нм), инфракрасного диапазона (1=760-1500 нм). Эти излучения способны вызывать резонансные отклики микроструктур живого организма.
Через радиоволновое «окно» проходят ЭМИ с длинами волн от 1-^50 м (2,39*1012 Гц - соматические клетки; 9,55* 1012 Гц - ядра соматических клеток; 3,18*1013 Гц - митохондрии клеток печени; 2,5*1013 Гц - геном клетки человека; 7,5*10п Гц - хромосома интерфазная; 1,5*1013 Гц - хромосома метафазная).
Резонансные частоты структур клетки (2-9*109 Гц - ДНК; 4,5*1015 Гц - нуклеосома; 2,65*1015 Гц - рибосома; 5-1010 Гц -клеточные мембраны; 1011 Гц - цитоскелет).
Взаимодействия происходят в жидких средах различных структур организма. Поэтому необходимо учитывать общие закономерности протекания автоволновых процессов, фрактальные соотношения при формировании клеточных структур, зависящих не только от частот воздействия и интенсивности, но и от характера распределения излучения в жидких средах. Представляется перспективным детальное изучение гармонических соотношений при клеточном делении. Клеточные технологии, неразрывно связанные с нанотехнологиями, действительно, могут в определенных условиях стать «ящиком Пандоры» для человечества. Но синергетический принцип самоорганизации систем именно поэтому обусловливает необходимость работы в этих направлениях, чтобы исключить такую вероятность.
УДК 611.018.46
СОПОСТАВЛЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА И МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВЗРОСЛОГО КОСТНОГО МОЗГА В 2-D И 3-D КУЛЬТУРЕ: МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРОМАЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ
И.Н. САБУРИНА *, А.А. ГОРКУН*, Н.В. КОШЕЛЕВА*,
М.Л. СЕМЕНОВА**, А.А. ПУЛИН*, В.С. РЕПИН*
С первых работ Гаррисона и Карреля 2-D- и 3^-культивирование клеток прогениторных и соматических клеток in vitro используют для научных целей.
Ключевые слова: прогениторные и соматические клетки
Если монослойная культура позволяет изучать детали диф-ференцировки и фенотипы соматических клеток в монослое, то 3-D-культуры позволяют изучать сборку и морфогенез клеток в клонах/кластерах, прослеживать формирование и морфологию 3D сфер-клонов при регенерации стромы без участия эпителия.
Сравнительное 2-D- и 3^-культивирование стромальных прогениторных клеток используется для: 1) 2-D- и 3-D-
клонообразования; 2) моделирования в микромасштабе одиночных кластеров и агрегатов, исключая влияние других клеток); 3) изучения регенерации изолированной стромы. Кроме того, трехмерные культуры МСК и стромальных прогениторных клеток -базис любой технологии получения инженерных тканей. Моно-слойные культуры имеют на порядок меньший потенциал васку-ляризации, гистогенеза и матриксзависимой дифференцировки по сравнению с 3^-культурой или переживаемой тканью [2,4]. В 3-D-суспензионной культуре отмечена дозовая зависимость скорости пролиферации, роста агрегатов и направления дифференци-ровки от размера агрегатов [8,1].
**ГУ РАМН НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова
Например, в суспензионных агрегатах эмбриокарциномы из 1000 клеток превалировала дифференцировка мезодер-мы/кардиомиоцитов, тогда как агрегаты из 4000 клеток в тех же условиях дифференцировались в энтодерму/гепатоциты [3]. Агрегация МСК в сферы в отсутствие матрикса возвращает чувствительность клеток к индукторам гаструлы и индуцирует образование мезо- энто- и нейроэктодермы из МСК-сфер [5,7]. Суспензионные клоны нейросфер были впервые получены в 1992 г. в бессывороточной среде. 90-95% исходных клеток в этих условиях погибало. Нейросферы в среде N2/B27+bFGF+EGF представляли собой интенсивно обновляемую кооперацию клеток из нейропрогениторов, полудифференцированных клеток, нейронов, астроцитов [6]. Первичные нейросферы из нестин+ Soxl+клеток были выделены из эпибласта, нервной пластинки и трубки. После диссоциации часть клеток первичных нейросфер формировали вторичные Soxl+нестин+клоны. Нейросферы, миосферы, другие динамичные агрегаты прогениторных клеток представляют собой прототип регенерационной ткани, возникающей ин ситу в эмбриогенезе.
Материалы и методы. Исследование формирования сфер/агрегатов, прототипа ранней регенерационной ткани, проводили на изолированных стромальных клетках пупочного канатика и мультипотентных стромальных клетках взрослого костного мозга (МСК) в малых плотностях 3-Э-культивирования, в отсуствие матрикса и других дифференцированных клеток. В реальных условиях в тканях формирование стромальных сфер блокировано дифференцированными эпителиальными клетками.
Образцы пупочного канатика были получены для исследования с добровольного согласия рожениц. Пупочный канатик тщательно отмывали от сгустков крови в растворе Хэнкса с антибиотиком (1% пенициллина/стрептомицина), удаляли сосуды и разрезали на фрагменты длиной 1-2 см, каждый фрагмент тщательно измельчали механически с помощью ножниц и подвергали ферментативной обработке (коллагеназы I и IV типа, 370C, 8 ч.). После ферментативной обработки материал процеживали через алюминиевую сеточку (размер пор 1 мм2), из полученных суспензий осаждали клетки центрифугированием (8 мин., 1000 об/мин, g=100 см2/с).
Стромальные клетки пупочного канатика и культуру МСК культивировали в стандартных условиях (37°С, 5% СО2) в полной ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2 мМ L), гентамицина (50 мкг/мл), инсулин-трансферрин-селенита (1:100) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, замену среды производили каждые 2 дня. Все культуры ежедневно микроско-пировали, оценивали степень конфлуэнтности. Когда монослой клеток занимал 80% поверхности чашки, культуры пассировали с использованием 0,25% раствора трипсина, действие трипсина инактивировали добавлением полной ростовой среды, плотность клеток при рассеве составляла >100 тыс.кл./мл. Перед каждым пассированием проводили подсчет клеток в камере Гаряева.
Для сравнительного анализа культур стромальных клеток пупочного канатика и МСК было проведено иммунофенотипиро-вание по следующим мембранным белкам: CD34, CD44, CD45 и CD90. Полученные результаты анализировали на проточном цитофлуориметре BD FACSAria (BD Biosciences, США) с помощью программы BD FACSDiva. Для оценки способности культур к образованию сфер/агрегатов культуры переводили на бессыво-роточную ростовую среду DMEM/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2 мМ L), гентамицина (50 мкг/мл), инсулин-трансферрин-селенита (1:100) на неадгезивный пластик.
Клеточные агрегаты изучали, используя трансмиссионную электронную микроскопию и иммуногистохимию. Для этого клеточные агрегаты фиксировали глютаровым альдегидом (1,5% раствор на 0,1М какодилатном буфере, pH=7,3, 1-2 ч.) дофикси-ровали OSO4 (1% водный раствор, 1-2 ч.). Для дальнейшей обработки отмытые от фиксатора агрегаты переносили в каплю расплавленного полужидкого 1,5% бакто-агара при 560С. Полученные агаровые блоки проводили по ряду восходящих спиртов (2 смены по 10 мин. в каждой), обезвоживали в ацетоне (3 смены по 10 мин. в каждой) и заключали в эпоновую смолу. Блоки резали на ультратоме «Tesla» серийно (толщина среза 1-2 мкм), до максимального диаметра клеточного агрегата. Полутонкие срезы окрашивали 0,5% раствором толуидинового синего в 1% растворе буры по стандартной методике (Детлаф, Бродский, Гаузе, 1974) и фоторегистрировали в видимом световом диапазоне под микроскопом Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия) с помощью цифровой камеры AxioCam HRC (Carl Zeiss, Германия). Ультратонкие
срезы получали на ультратоме LKB-111 (Швеция), окрашивали в 1% растворе уранилацетата и свинцом по Рейнольдсу [6]. Полученные препараты изучали с помощью электронного трансмиссионного микроскопа JEM-100B.
Перед иммуноокрашиванием фиксированные клетки промывали фосфатно-солевым буфером три раза по 5 мин. и инкубировали во влажной камере при комнатной температуре с первичными антителами к виментину (антитела мыши к человеку, 1/10), коллагенам I и IV типов (антитела кролика к человеку, 1/100). Клетки отмывали от избытка первичных антител (фосфатно-солевой буфер 3 раза по 5 мин.) и инкубировали с вторичными антителами в течение 1,5 ч. в тех же условиях. Использовали вторичные антитела кролика к мыши, конъюгированные с Cyanine Cy2, и антитела мыши к кролику, конъюгированные с Texas red. Затем отмывали клетки фосфатно-солевым буфером от избытка вторичных антител и ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид -Hoechst (0,002 мг/мл, 10 мин, 20°G).
Результаты. Б процессе культивирования стромальных клеток пупочного канатика уже со второго пассажа количество клеток в среднем увеличивалось в 1,5-2,5 раза за 48 ч. Б клеточных культурах было выявлено два типа клеток (рис.1.): I тип -клетки с длинным веретеновидным телом и II тип - клетки, имеющие крупное распластанное по субстрату тело. ^отноше-ние двух типов клеток менялось в процессе культивирования: вначале преобладали клетки II типа, начиная с четвертого пассажа - клетки I типа. Эти качественные отличия согласуются с данными других исследователей по гетерогенности клеток, выделяемых из основного вещества пупочного канатика.
На втором пассаже практически все клетки экспрессировали белок промежуточных филаментов, характерный для клеток мезенхимного происхождения, виментин, который был распределен однородно по всему объему клеток (рис. 2А, Б), и белки внеклеточного матрикса - коллагены I и IV типов. Коллагены, синтезируемые фибробластами, находятся в клетках, как правило, в виде отдельных волокон и гранул проколлагена, в культуре стромальных клеток пуповины коллаген I был распределен по всему объему клеток с преобладанием в околоядерной зоне (Рис. 2Б), коллаген IV типа - по всему объему клеток, в том числе и вокруг ядра, частично был представлен гранулами, возможно, проколлагена (рис. 2Г). По литературным данным, спектр маркеров, экспрессируемых клетками вартонова студня пупочного канатика схож с таковым для ММCК. Провели сравнительный анализ стромальных клеток пупочного канатика и МCК костного мозга методом проточной цитометрии. Из рекомендованных Международным обществом по клеточной терапии дифференци-ровочных маркеров, характеризующих культуры ММCК, изучили уровень экспрессии CD44 (рецептор гиалуроновой кислоты обеспечивает адгезию клеток и внеклеточного матрикса), CD90 (или ТЪу1-гликопротеин, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируется в стволовых клетках лимфатического ряда и фибробластах), CD34 и CD45 (гликозилированные трансмембранные белки, характерные только для клеток гемопо-этического ряда, не экспрессируются в культурах ММCК).
Рис.1. Культура стромальных клеток пупочного канатика А. 1 пассаж; Б. 4 пассаж
По нашим данным, в культуре фибробластоподобных клек-ток пупочного канатика, как и в культуре МСК, экспрессировались СЭ44 (93% клеток в популяции) и СЭ90 (99,8% и 85,3% клеток в популяции, соответственно) и не экспрессировались СЭ34 и СЭ45 (Табл.1). Подобное сходство сравниваемых культур хорошо согласуется с результатами других исследователей.
После пассирования в низкой плотности стромальные клетки пупочного канатика через 14-20 дней формировали активно пролифирировавшие колонии, данное свойство соответствует одному из признаков культур ММСК (клоногенность, то есть способность к колониеобразованию при культивировании в низкой плотности), что подчеркивает сходство обеих культур. Поскольку стромальные клетки пупочного канатика, как и МСК,
формировали колонии после пассирования в низкой плотности, обладали сходными с МСК характеристиками по спектру экспрессируемых маркеров, мы исследовали их способность к формированию трехмерных структур (агрегатов) при изменении условий культивирования (помещение на неадгезивный пластик в бессывороточной среде).
Рис.2. Иммуноцитохимический анализ культуры стромальных клеток пупочного канатика, 2 пассаж. Распределение виментина (красный) (А, Б), коллагена I типа (зеленый) (В) и коллагена IV типа (зеленый) (Г)
Таблица 1
Сравнительный иммунофенотипический анализ культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга и стромальных клеток пупочного канатика
Уровень экспрессии поверхностных маркеров ^роиальные клетки пупочного канатика
CD34 4,8% 5,6%
CD45 2,1% 3,4%
CD44 86% 93%
CD90 85,3% 99,8%
CD 105 91% 98%
Формирование клеточных агрегатов стромальными клетками пупочного канатика. В нашем исследовании стро-мальные клетки пуповины при помещении их на третьем-четвертом пассаже (когда клеточная культура представлена в основном только клеткам I типа) в бессывороточную среду на неадгезивный пластик не прикреплялись к дну чашки Петри, а агрегировали друг с другом, образуя через 3 дня жизнеспособные клеточные агрегаты диаметром от 400 до 1000 мкм (рис.6). В составе клеточных агрегатов обнаружили два типа клеток: поверхностные клетки, имеющие уплощенную форму, и округлые центральные клетки внутренней зоны (рис.3). Поверхностные клетки имели черепицеобразную форму и плотно прилегали друг к другу, во внутренней зоне клетки располагались более рыхло и имели полигональную форму, формировали большое число отростков. Между клетками в составе агрегата формировались контакты, хорошо был представлен внеклеточный матрикс, особенно между клетками внутренней зоны (рис.4А-Д). В клетках внутренней зоны шли активные синтетические процессы, эти клетки, в отличие от поверхностных, содержали высокоразвитую систему эндоплазматического ретикулума (рис.4Е). Такое морфологическое различие между поверхностными и центральными клетками может быть связано с переходом центральных клеток в более дифференцированное состояние под влиянием гипоксии, то есть недостатка кислорода. Подобное воздействие гипоксии на дифференцировку клеток, расположенных внутри трехмерной клеточной культуры, было описано для так называемых эмбри-одных телец (Mueller - Klieser, 1997).
Рис.3. Структура агрегата стромальных клеток пупочного канатика А. гистологический срез, окрашенный толуидиновым синим, с которого в дальнейшем получали ультратонкие срезы для исследования на трансмиссионном электронном микроскопе; Б. краевая зона с черепицеобразными клетками; В. центральная зона с крупными клетками А — 1см=1мкм; Б — 1см=0,4мкм
Данные иммуноцитохимического анализа показали, что как в поверхностных клетках, так и в клетках внутренней зоны агрегатов экспрессировался трасмембранный белок СЭ105-эндоглин,
характерный для активно пролиферирующих клеток, один из маркеров культур ММСК. (рис.5А, Б). Высокий уровень экспрессии этого белка показывает, что фибробластоподобные клетки в агрегате продолжают пролиферировать и полностью не переходят в дифференцированное состояние. В сравнении с клеточной популяцией, прикрепленной к субстрату, клетки агрегата в меньшем количестве экспрессируют виментин, маркер низкодиффи-ренцированных клеток (рис.5В). А экспрессия нестина обнаружена только в поверхностных клетках агрегатов (рис.5Г). Подобная экспрессия нестина характерна, например, и для нейросфер.
Рис.4. Структура агрегата стромальных клеток пупочного канатика. Увеличенное изображение зоны межклеточных контактов поверхностных черепицеобразных клеток (А), межклеточные контакты и внеклеточный матрикс внутренней зоны агрегата (Б-Д). Эндоплазматический ретикулум клетки внутренней зоны (Е). А—1см=1мкм; Е-1см=0,5мкм; В, Д—
1 см =0,4мкм; Б, Г-1см=0,125мкм
Рис.5. Распределение CD105 (А, Б), виментина (В) и нестина (Г) в агрегатах стромальных клеток пупочного канатика. Ядра окрашены красителем Hoechst 33258 (синий).
Рис.6. Общий вид клеточных агрегатов стромальных клеток пупочного канатика на увеличении 10Х (А, Б), 20Х (В) и 40Х (Г)
Заключение. Таким образом, было показано, что стро-мальные клетки пупочного канатика хорошо пролиферировали в культуре (удвоение количества клеток происходило примерно за 48 часов), экспрессировали виментин и коллагены I и IV типов, СЭ90 и СЭ44, не экспрессировали СЭ35 и СЭ45. По скорости пролиферации, способности к колониеобразованию и по спектру экспрессируемых маркеров стромальные клетки пуповины соответствовали культуре МСК. Было обнаружено, что в условиях, когда клетки не могли прикрепиться к субстрату (культивирование на неадгезивном пластике в бессывороточной среде), через 3 дня стромальные клетки пупочного канатика формировали трехмерные структуры, жизнеспособные клеточные агрегаты. В агрегатах присутствовали клетки двух типов: поверхностные уплощенные черепицеобразной формы клетки и рыхло расположенные округлые центральные клетки внутренней зоны, содержавшие, в отличие от поверхностных, развитую сеть эндоплазма-тического ретикулума. В агрегатах большинство клеток экспрессировало СЭ105, в сравнении с клеточной популяцией, прикрепленной к субстрату, меньшее число клеток экспрессировало
виментин, а экспрессия нестина была обнаружена только в поверхностных клетках агрегатов. Полученные результаты позволят расширить представления о природе и механизмах стромальной регенерации.
Литература
1. Сукач АН., Иванов З.Н. // Цитология. 2007. 49.916-26
2. Abbot А // Nature. 2000. 424. 870-74
3. Koike Т., Sakaki S./Amano У. et al. // J Biosci. Bioengineer. 2007. 104.294-99
4. Liu W., CuiL., Сао УУ/Methods Enzymol. 2006.420. 362-84
5. Ong S.Y./ Leong K.W. Inducing hepatic differentiation of hMSCs in pellet culture.Biomaterials. 2006. 27. 4087-97
6. Reynolds В.А Weiss S. // Science. 1992. 255. 1707-10
7. Shiota М./ Heike Т., Haruyama М. // Ехр. СеП Res. 2007. 313. 1008-23
8. WinterR.G. // J Ехр. Zool. 2001. 291. 116-29
УДК 616-008.851.852
ПРОНИКНОВЕНИЕ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ МЫШИ
Е.С. МОЛЧАНОВА, М.Л. СЕМЕНОВА*, Н.В. КОШЕЛЕВА,
И.Н. САБУРИНА**, М.Г. ИВАНОВСКАЯ***
Ключевые слова: стромальные клетки, олигонуклеотиды
Стромальные клетки, полученные из жировой ткани (СКЖТ), по спектру экспрессии, пролиферативному потенциалу и способностям к дифференцировке в различные производные практически не отличаются от МСК и являются перспективными кандидатами для аутологичных трансплантаций [2,11,8]. Одними из претендентов на роль ген-направленных агентов, влияющих на процесс дифферен-цировки клеток, являются антисмысловые олигонуклеотиды (АсОДН), способные образовывать прочные специфические комплексы с внутриклеточными мРНК и ингибировать процесс трансляции целевых белков. В настоящее время клиническое применение АсОДН связано с лечением онкологических заболеваний [5,7], ряда вирусных и бактериальных инфекций [4]. Использование АсОДН, влияющих на уровень и направление дифференцировки клеток, расширит область применения этих соединений в клеточной терапии. Имеются противоречивые сведения об эффективности и механизмах проникновения АсОДН в клетки [1,9].
Цель работы - изучение эффективности проникновения АсОДН вторичной структуры в культивируемые СКЖТ мыши.
Материал и метод. В качестве объекта для исследования проникновения и эффективности действия антисмысловых олигонуклеотидов (АсОДН) были выбраны стромальные клетки подкожной жировой ткани (СКЖТ) трансгенных мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J, содержащих кДНК одного из мутантов GFP (green fluorescent protein) - eGFP (enhanced green fluorescent protein). Мутантный белок eGFP в отличие от природного белка GFP, содержит мутации (S65 на T, и F64 на L), увеличивающие интенсивность его свечения в 35 раз. Этот белок экспрессируется в клетках млекопитающих и характеризуется узким максимумом флуоресценции в зеленой области спектра [3,10]. У мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J клетки всех тканей, кроме эритроцитов и шерсти, продуцируют eGFP, равномерно распределенный в цитоплазме и транспортирующийся в ядро.
Подбор антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей производили при помощи программ Mfold и Genebee, позволяющих предсказывать вероятные вторичные структуры мРНК, и при помощи программы Oligo 6, позволяющей предсказывать вероятные вторичные структуры и свойства коротких олигонуклеотидных последовательностей. Специфичность оли-гонуклеотидных последовательностей проверяли с помощью программы BLAST 2.2, осуществляющей поиск сходных последовательностей в базе данных GeneBee. Мы использовали немо-дифицированные антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды (АсОДН) и флуоресцентномеченые олигодезоксирибонуклеоти-ды (5’-TAMRA-.....3’), специфичные к мРНК гена eGFP. В каче-
стве действующих агентов на мишень нами были подобраны два
**Биологический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова,
***НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН,
Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского
