CC BY
54
характерный для активно пролиферирующих клеток, один из маркеров культур ММСК. (рис.5А, Б). Высокий уровень экспрессии этого белка показывает, что фибробластоподобные клетки в агрегате продолжают пролиферировать и полностью не переходят в дифференцированное состояние. В сравнении с клеточной популяцией, прикрепленной к субстрату, клетки агрегата в меньшем количестве экспрессируют виментин, маркер низкодиффи-ренцированных клеток (рис.5В). А экспрессия нестина обнаружена только в поверхностных клетках агрегатов (рис.5Г). Подобная экспрессия нестина характерна, например, и для нейросфер.
Рис.4. Структура агрегата стромальных клеток пупочного канатика. Увеличенное изображение зоны межклеточных контактов поверхностных черепицеобразных клеток (А), межклеточные контакты и внеклеточный матрикс внутренней зоны агрегата (Б-Д). Эндоплазматический ретикулум клетки внутренней зоны (Е). А—1см=1мкм; Е-1см=0,5мкм; В, Д—
1 см =0,4мкм; Б, Г-1см=0,125мкм
Рис.5. Распределение 00105 (А, Б), виментина (В) и нестина (Г) в агрегатах стромальных клеток пупочного канатика. Ядра окрашены красителем ЫоесЬ$1 33258 (синий).
Рис.6. Общий вид клеточных агрегатов стромальных клеток пупочного канатика на увеличении 10Х (А, Б), 20Х (В) и 40Х (Г)
Заключение. Таким образом, было показано, что стро-мальные клетки пупочного канатика хорошо пролиферировали в культуре (удвоение количества клеток происходило примерно за 48 часов), экспрессировали виментин и коллагены I и IV типов, 0Э90 и 0Э44, не экспрессировали 0Э35 и 0Э45. По скорости пролиферации, способности к колониеобразованию и по спектру экспрессируемых маркеров стромальные клетки пуповины соответствовали культуре МСК. Было обнаружено, что в условиях, когда клетки не могли прикрепиться к субстрату (культивирование на неадгезивном пластике в бессывороточной среде), через 3 дня стромальные клетки пупочного канатика формировали трехмерные структуры, жизнеспособные клеточные агрегаты. В агрегатах присутствовали клетки двух типов: поверхностные уплощенные черепицеобразной формы клетки и рыхло расположенные округлые центральные клетки внутренней зоны, содержавшие, в отличие от поверхностных, развитую сеть эндоплазма-тического ретикулума. В агрегатах большинство клеток экспрессировало 0Э105, в сравнении с клеточной популяцией, прикрепленной к субстрату, меньшее число клеток экспрессировало
виментин, а экспрессия нестина была обнаружена только в поверхностных клетках агрегатов. Полученные результаты позволят расширить представления о природе и механизмах стромальной регенерации.
Литература
1. Сукач АН., Иванов З.Н. // Цитология. 2007. 49.916-26
2. Abbot А // Nature. 2000. 424. 870-74
3. Koike Т., Sakaki S./Amano У. et al. // J Biosci. Bioengineer. 2007. 104.294-99
4. Liu W., CuiL., Сао УУ/Methods Enzymol. 2006.420. 362-84
5. Ong S.Y./ Leong K.W. Inducing hepatic differentiation of hMSCs in pellet culture.Biomaterials. 2006. 27. 4087-97
6. Reynolds В.А Weiss S. // Science. 1992. 255. 1707-10
7. Shiota М./ Heike Т., Haruyama М. // Ехр. СеП Res. 2007. 313. 1008-23
8. WinterR.G. // J Ехр. Zool. 2001. 291. 116-29
УДК 616-008.851.852
ПРОНИКНОВЕНИЕ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ МЫТТТИ
Е.С. МОЛЧАНОВА, М.Л. СЕМЕНОВА*, Н.В. КОШЕЛЕВА,
И.Н. САБУРИНА**, М.Г. ИВАНОВСКАЯ***
Ключевые слова: стромальные клетки, олигонуклеотиды
Стромальные клетки, полученные из жировой ткани (СКЖТ), по спектру экспрессии, пролиферативному потенциалу и способностям к дифференцировке в различные производные практически не отличаются от МСК и являются перспективными кандидатами для аутологичных трансплантаций [2,11,8]. Одними из претендентов на роль ген-направленных агентов, влияющих на процесс дифферен-цировки клеток, являются антисмысловые олигонуклеотиды (АсОДН), способные образовывать прочные специфические комплексы с внутриклеточными мРНК и ингибировать процесс трансляции целевых белков. В настоящее время клиническое применение АсОДН связано с лечением онкологических заболеваний [5,7], ряда вирусных и бактериальных инфекций [4]. Использование АсОДН, влияющих на уровень и направление дифференцировки клеток, расширит область применения этих соединений в клеточной терапии. Имеются противоречивые сведения об эффективности и механизмах проникновения АсОДН в клетки [1,9].
Цель работы - изучение эффективности проникновения АсОДН вторичной структуры в культивируемые СКЖТ мыши.
Материал и метод. В качестве объекта для исследования проникновения и эффективности действия антисмысловых олигонуклеотидов (АсОДН) были выбраны стромальные клетки подкожной жировой ткани (СКЖТ) трансгенных мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J, содержащих кДНК одного из мутантов GFP (green fluorescent protein) - eGFP (enhanced green fluorescent protein). Мутантный белок eGFP в отличие от природного белка GFP, содержит мутации (S65 на T, и F64 на L), увеличивающие интенсивность его свечения в 35 раз. Этот белок экспрессируется в клетках млекопитающих и характеризуется узким максимумом флуоресценции в зеленой области спектра [3,10]. У мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J клетки всех тканей, кроме эритроцитов и шерсти, продуцируют eGFP, равномерно распределенный в цитоплазме и транспортирующийся в ядро.
Подбор антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей производили при помощи программ Mfold и Genebee, позволяющих предсказывать вероятные вторичные структуры мРНК, и при помощи программы Oligo 6, позволяющей предсказывать вероятные вторичные структуры и свойства коротких олигонуклеотидных последовательностей. Специфичность оли-гонуклеотидных последовательностей проверяли с помощью программы BLAST 2.2, осуществляющей поиск сходных последовательностей в базе данных GeneBee. Мы использовали немо-дифицированные антисмысловые олигодезоксирибонуклеотиды (АсОДН) и флуоресцентномеченые олигодезоксирибонуклеоти-ды (5’-TAMRA-.....3’), специфичные к мРНК гена eGFP. В каче-
стве действующих агентов на мишень нами были подобраны два
**Биологический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова,
***НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН,
Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского
АсОДН: 18-звенный АсОДН, образующий вторичную структуру «шпилька», и 17-звенный АсОДН, без вторичной структуры.
Выделение и культивирование СКЖТ. Клетки выделяли из фрагментов ткани подкожного жира по стандартному протоколу с изменениями [11] самцов мышей линии G57BL/6-Tg(AGTB-EGFP)1Osb/J возраста 11 дней. Фрагмент подкожного жира, выделенный в стерильных условиях, измельчали и подвергали ферментативной дезагрегации смесью G,G7% раствора кол-лагеназы 1 типа и G,G2% раствора диспазы (25-3G мин, 37°C, 5% ТО2). После окончания дезагрегации добавляли полную ростовую среду и центрифугировали (8 мин, 1GGG об/мин, g=100см2/с). Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и пропускали через нейлоновый фильтр, чтобы избавиться от крупных фрагментов ткани, полученную суспензию клеток помещали на чашки Петри (35 мм, Greiner) и культивировали в стандартных условиях (37°C, 5% m2) в полной ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением глютамина (2 ммоль/л), 1% пенициллин-стрептомицин и 1G% ЭТС В процессе культивирования CЖКT среду меняли каждые 3 сут. и пассировали, когда монослой клеток занимал 7G-8G% поверхности чашки. Перед инкубацией с антисмысловыми олигонуклеотидами клетки сажали на покровные стекла, помещенные на дно чашек Петри. Темпы пролиферации и морфологию eGFP+ клеток оценивали под инвертированным микроскопом Axiovert 25 с флуоресцентной приставкой (Garl Zeiss).
Инкубация культур СКЖТ в средах с олигонуклеотидами. После заполнения клетками, помещенными на покровные стекла, 6G-7G% поверхности, их инкубировали в полной ростовой среде с добавлением АсОДН 1 нмоль/мл. CКЖT инкубировали в средах с АсОДН в течение 3 и 6 суток, затем отмывали в среде без олигонуклеотидов и оценивали проникновение АсОДН методом лазерной конфокальной сканирующей микроскопии.
Вестерн-блот анализ. Для проверки специфичности действия АсОДН к мРНК eGFP в культурах клеток проводили анализ изменения количества GFP в клетках при культивировании с олигонуклеотидами различной вторичной структуры. Культуру CКЖT в течение 3 и 6 суток инкубировали без олигонуклеотидов; со «структурированными» АсОДН, специфическими к мРНК eGFP и со «структурированными» неспецифическими олигонуклеотидами. Затем в лизатах клеток измеряли количество суммарного белка методом Брэдфорд, проводили гель-электрофорез в 18% ПААГ ^мА, 29В, 1,5 часа) и переносили пробы на PVDF мембрану (Amersham Sciences, Hybond-P), которую окрашивали понсо красным (3-5 мин на качалке), чтобы контролировать наличие белка. Mембрану с образцами инкубировали последовательно с первичными моноклональными антителами к белку eGFP и вторичными антителами, конъюгированными с перокси-дазой хрена. Белки визуализировали с использованием EGL-набора по инструкции Healthcare. Правильность нанесения белка на дорожки контролировали, визуализируя актин на мембране.
Флуоресцентная и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Получение флуоресцентных изображений проводили под инвертированным микроскопом Axiovert 25 (Garl Zeiss, Германия) с флуоресцентной приставкой и цифровой камерой AxioGam HRG. Работы по изучению проникновения АсОДН проводили на микроскопе Axiovert 2GGM с лазерной конфокальной приставкой LSM 51GMeta (Carl Zeiss, Германия). Покровные стёкла с монослоем клеток помещали в специальную камеру для прижизненного наблюдения за клетками, заполненную средой DMEM с добавлением 3,57 г/л HEPES для поддержания РН среды в пределах 7,2-7,3. В тех случаях, когда GFP+ клетки культивировали с АсОДН, коньюгированными с флуоро-хромом TAMRA, детекцию флуоресценции проводили в мультиканальном режиме с использованием лазерных линий возбуждения флуоресценции 488 нм для eGFP и 543 нм для TAMRA.
Результаты. Проникновение АсОДН в СЖКТ мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J. В нашей работе было изучено проникновение АсОДН, специфичных к мРНК гена eGFP, конью-гированных с флуорохромом TAMRA, в CЖКT полученных нами культур (рис. 1). «Неструктурированные» АсОДН, не образующие вторичной структуры, практически не проникали в клетки, а «структурированные» АсОДН сходной длины с высокой эффективностью проникали в CЖКT (рис. 2). Тот факт, что в клетки проникает 18-звенный «структурированный» олигонуклеотид, а 17звенный «неструктурированный» олигонуклеотид проникает в единичные клетки в значительно меньшем количестве и практически не проникает в большую часть клеток, даёт основания предпо-
лагать наличие механизмов на поверхности клеток, опосредующих проникновение «структурированного» олигонуклеотида (возможно, эту функцию выполняют специфические белковые рецепторы).
Рис. 1. Культура ОЕР+ стромальных клеток жировой ткани мышей линии С57ВЬ/б-Т§(АСТВ-Е0ЕР)10$ЪЛ: фазовый контраст (А) и флуоресценция белка еОЕР в клетках; стрелкой указаны жировые гранулы
Рис. 2. Проникновение АсОДН в CЖКT мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J
Флуоресценция TAMRA и eGFP (возбуждение 543 и 488 нм соответственно; мультиканальный режим регистрации): клетки после часа инкубации с неструктурированным АсОДН (А) и после часа инкубации с АсОДН «шпилька» (В); стрелками указана перинуклеарная локализация АсОДН
Показанная нами перинуклеарная локализация АсОДН в CЖКT дает возможность предполагать, что олигонуклеотиды проникают в клетку посредством эндоцитоза, возможно, рецеп-тор-опосредованного эндоцитоза. Как показано в статье [6] такую локализацию часто претерпевают вещества, попадающие в клетку посредством рециркулирующего рецептор-опосредованного эндоцитоза (вещества локализуются в области транс-Гольджи, но на самом деле попадают внутрь транс-Гольджи лишь в некоторой степени, остальная часть локализуется в рециклических компар-тментах, локализованных в непосредственной близости с транс-Гольджи или распределены по цитоплазме).
Антисмысловое действие олигонуклеотидов на экспрессию eGFP в культуре СКЖТ мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osh/J. Поскольку «структурированные» АсОДН хорошо проникают в CКЖT (рис. 2), мы провели проверку эффективности действия «структурированных» АсОДН на экспрессию белка eGFP с помощью вестерн-блота. Как видно из результатов иммуноблота, представленных на (рис. 3), на 3 сутки инкубации со «структурированными» АсОДН заметно снижение количества белка eGFP по сравнению с остальными пробами 3-суточной инкубации.
В контроле без олигонуклеотидов и в образце с неантисмы-словыми олигонуклеотидами содержание eGFP оказалось одинаковым и не менялось независимо от сроков инкубации. На 6 сут. инкубации выявлено сильное снижение количества белка eGFP в клетках, инкубировавшихся со «структурированными» АсОДН, по сравнению с другими образцами (рис. 3). Полученные данные доказывают эффективность специфического действия «структурированных» АсОДН на экспрессию белка eGFP в культурах ЖЖТ мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J.
Рис. 3. Анализ уровня экспрессии еОЕР с помощью иммуноблота в лизатах СКЖТ: 3 сут. инкубации без олигонуклеотидов (1); со «структурированными» АсОДН, специфическими к мРНК еОЕР (2) и со «структурированными» неспецифическими олигонуклеотидами (3); 6 сут. инкубации без олигонуклеотидов (4); со «структурированными» АсОДН, специфическими к мРНК еОЕР (5) и со «структурированными» неспецифическими олигонуклеотидами (6). Правильность нанесения количеств белка на дорожки контролировали при помощи визуализации актина на мембране
Заключение. Использование специфичных АсОДН, способных влиять на уровень и направление дифференцировки
CЖКT, возможно, откроет путь применения данного типа клеток для аутологических и аллогенных транстлантаций. АсОДН в настоящее время считаются перспективными и высокоточными агентами для подавления экспрессии конкретно выбранных белков. Однако данные об эффективности их проникновения в клетки как in vivo так и in vitro, полученные различными группами исследователей, существенно различаются. В нашей работе мы сравнивали способность АсОДН проникать в CЖКT мыши в системе in vitro. В ходе выполнения работы нами было проведено исследование проникновения и распределения АсОДН в CЖКT с применением методов лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Были подобраны АсОДН к мРНК eGFP, не образующие вторичной структуры, и образующие вторичную структуру «шпилька». На модели культивируемых CЖКT eGFP+-мышей линии G57BL/6-Tg(AGTB-EGFP)1Osb/J) была изучена эффективность проникновения «неструктурированных» и «структурированных», флуоресцентномеченых АсОДН в клетки. «Неструктурированные» АсОДН почти не проникали в CКЖT. «Огруктурированные» АсОДН, образующие вторичную структуру «шпилька», интенсивно проникали в клетки. После проникновения в CЖКT АсОДН локализовались в цитоплазме, преимущественно в околоядерной зоне, не проникали в ядра. ^ецифич-ность действия «структурированных» АсОДН к мРНК eGFP была подтверждена в культуре CКЖT методом иммуноблота: после 6-ти сут. инкубации клеток с этими олигонуклеотидами количество белка eGFP в них существенно снижалось.
Полученные нами данные о влиянии наличия вторичной структуры, «шпильки» на проникновение АсОДН сходной длины в CЖКT, а также данные о перинуклеарной локализации АсОДН в клетках дают возможность предполагать существование рецептор-опосредованного транспортного механизма проникновения АсОДН в CЖКT. Результаты этого исследования могут быть использованы для разработки методов направленной дифференцировки CЖКT и дадут возможность использовать АсОДН в клеточной терапии.
Литература
1. ТимченкоМ.А.. и др.) // Биохимия.2006.T. 71, C. 561-569.
2. Трактуев Д.О. и др. () // Цитология. 2006.Т. 48, C. 83-94.
3. CormackB. et al. () // Gene. 1996. Vol. 173. P.33-38.
4. Geller B.L. (2GG5) Antibacterial antisense. Gurr Opin Mol Ther.,Vol. 7, P. 109-113.
5. Kausch I. et al., (2003) // Cancer, Vol. 105, P.710-716.
6. Mukherjee S., Ghosh R.N., Maxfield F.R. (1997) // Endocy-tosis. Physiol. Rev., Vol. 77, P.759-8G3.
7. Mullen P., McPhillips F., MacLeodK., et al., (2004) // Glini-cal cancer research. Vol. 1G. P.21GG-21G8
8. Nakagami H, Morishita R, Maeda K, et al., (2006) // Athero-scler Thromb; Vol. 13, P.77-81.
9. O'Rear L., Longobardi L., Torello M., et al., (2005) // J of Molecular Endocrinology, Vol. 34, P.723-737.
10. Zhang G., Gurtu V., Kain S.R. (1996) // Biochemical and Biophysical Research Gommunications, Vol. 227, P.7G7-711.
11. Zuk, P., Zhu M., Mizuno H., et al., (2001) // Tissue Eng. Vol. 7, P.211-226.
Работа поддержана грантом компании Carl Zeiss Inc., Германия
№2-13.
УДК 616.36-004+616.36-002
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПРОБ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЦИРРОЗЕ В УСЛОВИЯХ ВВЕДЕНИЯ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
Э.М. ШЕНДЕР, А.Е. КОЛОСОВ*
Ключевые слова: функциональная проба печени
Циррозы занимают ведущее место среди хронических диффузных поражений печени [6,9,10]. Диагностика цирроза печени сопряжена с проведением комплекса биохимических проб, которые указывают на степень ее поражения. Анализируя ряд научных данных на эту тему, мы не увидели среди них результатов о закономерностях изменений биохимических показателей функциональных проб печени в случае экспериментального цирроза печени при введении фетальных тканей [1,2,8].
Цель исследования — изучение изменения функциональных биохимических показателей печени при циррозе, а так же установление их связей с регенераторными процессами в ней в условиях введения фетальных тканей.
Объект и метод. Объектом хронического эксперимента служили 340 беспородных половозрелых крыс средней массой 200 г. Во всех экспериментах соблюдены требования, предъявляемые при проведении экспериментальных работ на животных.
Подопытные крысы разделены на группы: 1 - контрольная; 2 - с экспериментальным ЦП;3 - с экспериментальным ЦП, которым проводилась стимуляция регенерации печени с помощью трансплантации суспензии фетальных тканей печени, селезенки и тимуса 18-19-дневных плодов крыс; 4 - с экспериментальным ЦП, которым проводилась стимуляция регенерации печени с помощью трансплантации суспензии тканей печени, селезенки и тимуса 18-19-дневных плодов крыс после воздействия на эти ткани низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) [3,4].
В качестве излучателя использовался гелий-неоновый полупроводниковый аппарат с длиной волны 633 нм. Облучение осуществлялось двукратно по 1,8 мин с перерывом в 5 минут при плотности излучения 75 мВт/см2 [5].
Модель ЦП у крыс воспроизводилась путем длительного введения гепатотропного яда - четыреххлористого углерода [7].
В течение 3 месяцев под кожу спины вводили 50% масляный раствор четыреххлористого углерода в дозе 0,4 мл на 100 гр. веса животного 4 раза в неделю. Трансплантат готовился из органов плодов самок крыс со сроком беременности 18-19 суток. Беременных самок выводили из эксперимента путем декапита-ции. Использован метод гомогенизации фрагментов фетальных тканей печени, селезенки и тимуса в равных количествах. При окраске трипановым синим гомогенат представлял суспензию жизнеспособных ядросодержащих клеток 3-5х105.
Трансплантацию осуществляли посредством внутрибрю-шинной инъекции. Во всех группах животных трансплантация фетальной взвести осуществлялась сразу после создания модели ЭЦП (на 91 сутки эксперимента). Содержание общего билирубина измерялось по методу Йендрашика; тимоловая проба, АСТ, АЛТ, щелочная фосфатаза и у-глутаматтрансфераза определялись с использованием соответствующих биохимических наборов фирмы «Лабсист» и на биохимическом анализаторе ФП-901М (Финляндия). Животных 2-4 групп выводили из эксперимента через 75 суток путем декапитации. Активность репаративных процессов оценивали с учетом морфо-функционального состояния печени. Для микроскопического исследования срезы печени фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали и заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, ШИК-реакцией.
Морфометрическое исследование осуществлялось с помощью компьютерной системы анализа цветового изображения ДиаМорф-Ско (Россия). На условной единице площади в ткани печени подсчитывались диаметры клеток и их ядер, а так же митотический индекс гепатоцитов. Все результаты обрабатывали с помощью БХСБЬ-2007; вычислялся 1-критерий Стьюдента.
У животных 2 экспериментальной группы (с экспериментальным ЦП) достоверно возрастали по сравнению с контролем уровни общего билирубина (рис.1), тимоловой пробы (рис.2) и активность у- глутаматтрансферазы (рис.3), АСТ, АЛТ, а так же щелочной фосфатазы (рис.4), достигая максимальных значений. При этом морфологически регистрировались дистрофия и некроз гепатоцитов, их извращенная регенерация, диффузный фиброз, деформация органа. Через 75 суток после введения фетальных тканей (3- я группа) отмечалось достоверное снижение значений функциональных проб печени, не достигающих показателей контрольной группы (рис.1-4). При морфологическом исследовании печени определялось неравномерное восстановление структур органа, в частности, доли соединительной и паренхиматозной ткани по отношению к контрольной серии (рис.5; рис.6), изменения числа клеток Купфера (рис.7), а также колебания митотического индекса гепатоцитов (рис.8).
У животных 4 экспериментальной группы значения функциональных проб печени на 75 сутки достоверно не отличались от показателей контрольной группы (рис.1-4), а гистологически обнаруживалось восстановление гистоархитектоники печени, сходное с печенью животных контрольной группы (рис.6).
* 610027, г. Киров, ул. К. Mаркса, 112, Кировская ГMА
