CC BY
24
Клиническая онкогематология. 2023;16(3):268-79
Clinical oncohematology. 2023;16(3):268-79
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Классические и активирующие химерные антигенные рецепторы PD-1 как элемент мультитаргетного подхода в лечении гематологических и солидных новообразований
К.А. Левчук1, А.А. Голдаева2, Е.А. Столярова3, П.А. Матейкович4, А.Х. Валиуллина5, Э.Р. Булатов5, А.В. Петухов1, А.А. Дакс6, Н.А. Барлев6, Е.В. Байдюк6, Я.Г. Торопова1
1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341
2 ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Университетская наб., д. 7/9, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 199034
3 ООО «Лечебно-диагностический центр Международного института биологических систем им. Сергея Березина», ул. Есенина, д. 1, корп. 3, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194354
4 ООО «ХЕМА», ул. 4-я 8 Марта, д. 3, корп. 3, Москва, Российская Федерация, 125319
5 ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», ул. Кремлевская, д. 18, Казань, Российская Федерация, 420008
6 ФГБУН «Институт цитологии РАН», Тихорецкий пр-т, д. 4, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194064
РЕФЕРАТ
Цель. Создание анти-PD-LI CAR T-эффекторов, несущих внеклеточный домен PD-1 в качестве антигенраспоз-нающего участка, и исследование их цитолитической активности. Функциональная оценка анти-PD-LI CAR T-эффекторов in vitro с перспективой применения в муль-титаргетной терапии опухолевых новообразований. Материалы и методы. Конструкция химерного антигенного рецептора PD-1 была создана с помощью молекулярного клонирования антигенраспознающего участка молекулы человеческого PD-1 (аминокислоты 12-170) в экспрессионный плазмидный вектор млекопитающих с добавлением активационного и костимулирующего доменов. Первичные Т-лимфоциты мононуклеарной фракции периферической крови здорового донора получены методом экспансии комбинации моноклональ-ных антител по поверхностным маркерам CD3/CD28. Анти-PD^ CAR T-эффекторы получены путем лентиви-русной трансдукции генома первичных Т-лимфоцитов здорового донора. Экспрессию химерного рецептора PD-1 и эффективность трансдукции оценивали методом проточной цитофлюориметрии. Специфическую цито-токсическую активность анти-PD^ CAR T-эффекторов
EXPERIMENTAL STUDIES
Classic and Activating Chimeric Antigen Receptors PD-1 as an Element of Multi-Target Approach to the Treatment of Hematological and Solid Neoplasms
KA Levchuk1, AA Goldaeva2, EA Stolyarova3, PA Mateikovich4, AKh Valiullina5, ER Bulatov5, AVPetukhov1, AA Daks6, NA Barlev6, EVBaidyuk6, YaG Toropova1
1 VA Almazov National Medical Research Center,
2 Akkuratova ul., Saint Petersburg, Russian Federation, 197341
2 Saint Petersburg State University, 7/9 Universitetskaya nab., Saint Petersburg, Russian Federation, 199034
3 Dr. Sergey Berezin Medical Institute (MIBS), 1 korp. 3 Esenina ul., Saint Petersburg, Russian Federation, 194354
4 HEMA, 3 korp. 3 4th 8 Marta ul., Moscow, Russian Federation, 125319
5 Kazan (Privolzhsky) Federal University, 18 Kremlevskaya ul., Kazan, Russian Federation, 420008
6 Institute of Cytology, 4 Tikhoretskii pr-t, Saint Petersburg, Russian Federation, 194064
ABSTRACT
Aim. To generate anti-PD-LI CAR-T effectors carrying extracellular domain PD-1 as antigen-recognizing site and to study their cytolytic activity as well as to functionally assess the anti-PD-LI CAR-T effectors in vitro with a view to apply them in multi-targeted tumor therapy. Materials & Methods. Chimeric antigen receptor PD-1 was constructed using molecular cloning of PD-1 antigen-recognizing region (12-170 amino acids) into mammalian expression plasmid vector adding activation and co-stimulatory domains. Primary T-lymphocytes of healthy donor peripheral blood mononuclear fraction were derived by expanding monoclonal antibody combination on surface markers CD3/ CD28. Anti-PD-L1 CAR-T effectors were obtained by lenti-viral transduction of primary T-lymphocyte genome of a healthy donor. Chimeric antigen receptor PD-1 expression and transduction efficiency were assessed by flow cytofluo-rometry. Specific cytotoxicity of the anti-PD-L1 CAR-T effectors was analyzed in vitro by means of real-time cytotoxicity assay (RTCA) with HeLa_PD-L1 target cell line co-cultivation. The level of cytokines IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y, and IL-17A was assessed by flow cytofluorometry using Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit (BD, USA).
268
© 2023 практическая медицина
анализировали in vitro с помощью теста цитотоксично-сти в реальном времени (RTCA) при сокультивировании с клетками-мишенями линии HeLa_PD-L1. Содержание цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y, IL-17A оценивали методом проточной цитофлюориметрии с использованием набора Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit (BD, США). Результаты. Эффективность лентивирусной трансдук-ции и доля анти-PD^ CAR T-эффекторов составили 42 %. Специфичность цитотоксического ответа анти-PD-L1 CAR T-эффекторов при низком соотношении эффектора/опухоли (1:20) верифицирована снижением клеточного индекса (КИ) при сокультивировании с HeLa_PD-L1 (КИ = 0,738) в 1,5 раза по сравнению с контролем (КИ = 1,0645). Увеличение синтеза цитокинов IL-2 (1000 пг/мл), IL-6 (438,5 пг/мл), TNF-a (44 пг/мл), IFN-y (1034 пг/мл) при сокультивировании с таргетной линией-мишенью HeLa_PD-L1 указывает на функциональность исследуемых клеток-эффекторов. Заключение. Нами получен и проверен in vitro химерный антигенный рецептор против PD-L1. Анти-PD^ CAR T-лимфоциты специфически «узнают» и способствуют цитолизу опухолевых клеток-мишеней путем высокой секреции провоспалительных цитокинов IFN-y, TNF-a, IL-6 и IL-2. Химерный антигенный рецептор PD-1 можно модифицировать в активирующий (CSR) делецией CD3Z-домена и использовать совместно с другими CAR без прогнозируемой неспецифической токсичности.
Results. The efficiency of lentiviral transduction and the proportion of the anti-PD-LI CAR-T effectors were 42 %. The specificity of cytotoxic response of the anti-PD-LI CAR-T effectors with a low effector/tumor ratio (1:20) was verified during HeLa_PD-L1 co-cultivation by a 1.5-fold decrease in the cell index (CI = 0.738) versus control (CI = 1.0645). The increase in synthesis of cytokines IL-2 (1000 pg/mL), IL-6 (438.5 pg/mL), TNF-a (44 pg/mL), and IFN-y (1034 pg/mL) during HeLa_PD-L1 target cell line co-cultivation confirms the functionality of the analyzed effector cells. Conclusion. Anti-PD-L1 chimeric antigen receptor was constructed and tested in vitro. Anti-PD-L1 CAR-T lymphocytes specifically recognize and promote the cytolysis of tumor target cells by increased secretion of pro-inflammatory cytokines IFN-y, TNF-a, IL-6, and IL-2. Chimeric antigen receptor PD-1 can be modified into chimeric switch receptor (CSR) by deleting CD3Z-domain and can be used together with other CARs without predicted non-specific toxicity.
Ключевые слова: CAR T-клеточная терапия, PD-1, анти-PD^ CAR T-эффекторы, микроокружение опухоли, мультитаргетная иммунотерапия.
Keywords: CAR-T cell therapy, PD-1, anti-PD-L1 CAR-T effectors, tumor microenvironment, multi-targeted immunotherapy.
Получено: 8 февраля 2023 г. Принято в печать: 3 июня 2023 г.
Received: February 8, 2023 Accepted:June 3, 2023
Для переписки: Ксения Александровна Левчук,
ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341;
тел.: +7(951)680-79-60; e-mail: ksenialevchuk2@gmail.com
Для цитирования: Левчук К.А., Голдаева А.А., Столярова Е.А. и др.
Классические и активирующие химерные антигенные рецепторы PD-1
как элемент мультитаргетного подхода в лечении гематологических
и солидных новообразований. Клиническая онкогематология.
2023;16(3):268-79.
DOI: 10.21320/2500-2139-2023-16-3-268-279
For correspondence: Kseniya Aleksandrovna Levchuk, 2 Akkuratova ul., Saint Petersburg, Russian Federation, 197341; Tel.: +7(951)680-79-60; e-mail: ksenialevchuk2@gmail.com For citation: Levchuk KA, Goldaeva AA, Stolyarova EA, et al. Classic and Activating Chimeric Antigen Receptors PD-1 as an Element of Multi-Target Approach to the Treatment of Hematological and Solid Neoplasms. Clinical oncohematology. 2023;16(3):268-79. (In Russ).
DOI: 10.21320/2500-2139-2023-16-3-268-279
ВВЕДЕНИЕ
Адоптивная иммунотерапия CAR T-клетками является одним из наиболее быстро развивающихся лечебных подходов при злокачественных новообразованиях. После официального одобрения первого CAR T-препа-рата практически ежегодно регистрировались новые CAR-T-клеточные продукты. В частности, в 2021 г. было зарегистрировано сразу пять CAR T-препаратов. К настоящему времени одобрено 8 различных препаратов (табл. 1). Следует отметить, что все упомянутые биомедицинские продукты показали высокую эффективность в терапии злокачественных лимфопроли-феративных заболеваний [1]. Более 150 компаний во всем мире занимаются разработкой CAR T-продуктов.
Насчитывается более 800 зарегистрированных клинических исследований. Наряду с исследованиями CAR T-клеток, применяемых в качестве монотерапии, увеличивается количество исследований с использованием CAR T-препаратов в комбинации с ингибиторами контрольных точек PD-1/PD-L1, а также с химиотерапией. Поскольку канцерогенез представляет собой сложный процесс, сопровождающийся формированием уникального клеточного микроокружения, необходимого для роста и резистентности опухоли, применение CAR T-клеток в комбинированной терапии направлено на преодоление ограничений адоптивной клеточной иммунотерапии и усиление ее эффективности (рис. 1).
Стандартная CAR T-клеточная терапия состоит из ряда последовательных этапов, включающих
Таблица 1. CAR T-клеточные продукты, одобренные FDA (США) и регуляторными органами КНР
Маркер- Первичная
Продукт CAR-T мишень Компания Заболевание регистрация
Kymriah (тисагенлеклейсел) CD19 Novartis
Рецидивы/рефрактерные В-ОЛЛ, ДВКЛ de novo, ДВКЛ 2017 г.*
как результат трансформации фолликулярной лимфомы, В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности, фолликулярная лимфома
Yescarta (аксикабтаген CD19 Gilead/Kite Pharma Рецидивы/рефрактерные ДВКЛ, первичная медиасти- 2017 г.*
силолейсел) нальная В-крупноклеточная лимфома, В-клеточная
лимфома высокой степени злокачественности, ДВКЛ как результат трансформации фолликулярной лимфомы, фолликулярная лимфома
Teractus (брексукабтаген аутолейсел) CD19 Gilead/Kite Pharma Рецидивы/рефрактерные В-ОЛЛ, лимфома из клеток мантии 2020 г.*
Breyanzi (лизокабтаген маралейсел) CD19 Bristol-Myers Squibb Рецидивы/рефрактерные ДВКЛ, первичная медиасти-нальная В-крупноклеточная лимфома, В-клеточная лимфома высокой степени злокачественности, фолликулярная лимфома 2021 г.*
Abecma (идекабтаген виклейсел) BCMA Bristol-Myers Squibb/ Bluebird bio Рецидивы/рефрактерное течение множественной миеломы 2021 г.*
РКС-876 (по лицензии Сй19 Ро$ипККе Рецидивы/рефрактерные ДВКЛ, первичная медиасти- 2021 г.*
Уе$саЛа) нальная В-крупноклеточная лимфома, В-клеточная
лимфома высокой степени злокачественности, ДВКЛ как результат трансформации фолликулярной лимфомы
Carteyva (релмакабтаген CD19 JW Therapeutic Рецидивы/рефрактерные ДВКЛ, фолликулярная 2021 г.**
аутолейсел) лимфома
Carvykti (цилтакабтаген BCMA Legend biotech/ Рецидивы/рефрактерное течение множественной 2022 г.*
аутолейсел) Janssen oncology миеломы
FDA — Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США; В-ОЛЛ — В-клеточный острый лимфобластный лейкоз; ДВКЛ — диффузная В-крупноклеточная лимфома. * CAR T-клеточные продукты, одобренные FDA.
** CAR T-клеточные продукты, одобренные Национальным управлением медицинской продукции Китая.
Рис 1. Опухоль и компоненты ее микроокружения
Fig. 1. Tumor and components of its microenvironment
лимфодеплецию (кондиционирование) и инфузию генетически модифицированных Т-лимфоцитов. Цель этапа кондиционирования заключается в снижении опухолевой нагрузки и редукции регуляторных иммунных клеток, в особенности регуляторных Тлим-фоцитов. В свою очередь, T-регуляторные лимфоциты, экспрессирующие как PD-L1, так и PD-1, способны
контролировать толерантность пула Т-клеток [2] и подавлять функцию CAR T-клеток. Последние помимо того, что оказывают цитотоксическое воздействие и стимулируют общий Т-клеточный ответ, рекрутируют компоненты неспецифического иммунитета. Очевидно, что удаление лимфоцитов является токсичным, но CAR T-клеточная терапия у пациентов, не
получавших режим кондиционирования, оказывается неэффективной [3, 4]. Наиболее распространенными и эффективными являются режимы кондиционирования с использованием флударабина, циклофосфа-мида. В сравнении с монотерапией циклофосфамидом при применении комбинированной схемы лимфоде-плеции отмечались более высокие показатели пролиферации CAR T-клеток, длительная их персистенция, а также более высокая частота ответа на проводимую терапию. Кроме того, схемы кондиционирования могут варьировать и зависят от возможной резистентности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам [5-7].
Помимо снижения опухолевой нагрузки некоторые противоопухолевые препараты могут способствовать смене иммунного статуса опухоли. Из резистентной, не способной быть инфильтрированной Т-лимфоцитами опухоль может перейти в активное иммуногенное состояние. Кроме того, статус имму-нологически активной опухоли принято связывать с высоким уровнем экспрессии PD-L1, а резистентную к иммунотерапии опухоль — с низким уровнем экспрессии этого маркера. Относительно экспрессии PD-L2 сходных данных не представлено [8].
Механизм элиминации мишени CAR T-клетками реализуется в первую очередь за счет экспрессии цито-кинов, а также благодаря образованию иммунного синапса с выделением гранзимов и перфоринов, который в отличие от Т-клеточного рецептора не структурирован [9]. В контексте CAR T-клеточной терапии наиболее упоминаемым и изучаемым является интерлейкин-6 (IL-6). Необходимо отметить, что высокий уровень экспрессии IL-6 может индуцироваться в микроокружении опухоли как под влиянием иммунного ответа, так и при воздействии противоопухолевых препаратов. В свою очередь, данный цитокин существенно влияет на иммунный ответ, поскольку непрерывный воспалительный ответ приводит к активации проонкогенных путей и истощению иммунных Т-клеток [10].
Недавние исследования причин полиорганной недостаточности у пациентов с COVID-19 и синдромом высвобождения цитокинов выявили два основных ци-токина: интерферон-у (IFN-y) и фактор некроза опухо-лей-а (TNF-а), которые участвуют в программируемой гибели клеток, названной ПАНоптоз (PANoptosis) [11]. Экспрессия CAR T-клетками данных цитокинов и чувствительность к ним опухолевых клеток, согласно многочисленным исследованиям, необходимы для успешной CAR T-клеточной терапии. При недостаточной передаче сигналов TNF-а и IFN-y эффективность противоопухолевого ответа снижается. В то же время мышиные модели с нокаутом гранзима и пер-форина не демонстрируют значительного снижения эффективности противоопухолевого иммунитета [12-14]. Однако данные механизмы могут быть справедливы только в отношении солидных опухолей [15]. Кроме того, IFN-y способен активировать экспрессию PD-L1, выступающего в качестве важного регулятора иммунного ответа со стороны не только опухолевых клеток, но и микроокружения [16, 17].
PD-L1 является лигандом рецептора программируемой гибели-1 (PD-1) и экспрессируется на поверхности иммунных клеток (дендритных,
макрофагов, Т- и В-лимфоцитов), а также гиперэкс-прессируется на поверхности опухолевых клеток. PD-1 — распространенный иммуносупрессивный белок, встречающийся на поверхности активированных T-лимфоцитов, дендритных клеток, моноцитов. Взаимодействие между рецептором PD-1 и его лигандом PD-L1 приводит к развитию иммунной толерантности, благодаря чему осуществляется механизм защиты клеток от аутоиммунных поражений. При взаимодействии рецептора PD-1 с лигандом PD-L1 на поверхности опухолевых клеток происходит ингибирование пролиферации PD-1-по-зитивных иммунных клеток, что приводит к уклонению опухолевых клеток от иммунного ответа.
Открытие и исследование сигнального пути PD-1/PD-L1 обусловили появление моноклональных антител — ингибиторов контрольных точек (ИКТ) иммунного ответа, которые стали значимым этапом в лечении опухолевых заболеваний (табл. 2) [18, 19]. Благодаря иммунному редактированию применение ИКТ стимулирует и усиливает иммунный ответ, блокируя взаимодействия PD-1/PD-L1. В настоящее время терапия, направленная на PD-1 и его лиганд PD-L1, является наиболее широко исследуемой областью в онкоиммунологии. Моноклональные антитела против PD-1/PD-L1 применяются при многих опухолевых заболеваниях, таких как меланома, рак легкого, лимфомы, колоректальный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, рак шейки матки, почки, желудка, молочной железы, и ряде других злокачественных новообразований. Терапия ИКТ в качестве адъювантной или неоадъювантной дает заметный, однако недостаточный эффект. Частота клинического ответа при лечении ИКТ достигает не более 40 %. Применение моноклональных антител против PD-1/PD-L1 у пациентов с прогрессированием или рецидивами злокачественных новообразований демонстрирует увеличение показателей выживаемости в сравнении с результатами лечения по стандартным схемам противоопухолевой терапии, однако частота полного клинического ответа остается низкой и не превышает 15 % [20, 21].
Недостаточная эффективность терапии ИКТ с низкой частотой ответа связана с рядом факторов, в т. ч. с уменьшением интенсивности инфильтрации опухоли Т-клетками [21]. Кроме того, чувствительность к иммунотерапии может значительно варьировать в зависимости от гетерогенности опухоли, механизма презентации антигена или активации различных сигнальных путей, приводящих к клеточной гибели [22].
Для повышения эффективности адоптивной иммунотерапии возможны следующие лечебные подходы: 1) комбинированная терапия с использованием разных ИКТ [23]; 2) комбинированная терапия с применением онколитических вирусов, способствующих лимфоцитарной инфильтрации и переходу опухоли в активное иммуногенное состояние [24]; 3) локальная термоабляционная терапия (например, радиочастотная абляция), химио- и лучевая терапия [25]. В последние годы также стало актуальным воздействие на сенесцентные (стареющие) клетки опухолевого микроокружения [26-28].
Таблица 2. Основные моноклональные антитела — ингибиторы иммунных контрольных точек
Мишень Препарат Заболевание
PD-1 Ниволумаб* Меланома, лимфома Ходжкина, НМРЛ, гепатоцеллюлярный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи, уротелиальный рак, колоректальный рак, рак желудка (аденокарцинома), рак пищевода (аденокарцинома, плоскоклеточный рак), почечноклеточный рак
PD-1 Пембролизумаб* Меланома, НМРЛ, лимфома Ходжкина, первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома, уротелиальный рак, злокачественные новообразования с высоким уровнем микросателлитной нестабильности, рак желудка (ИЕР2-позитивная аденокарцинома), рак шейки матки (с экспрессией РР-И), плоскоклеточный рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, почечноклеточный рак, рак эндометрия, плоскоклеточный рак кожи, тройной негативный рак молочной железы (с экспрессией РР-И)
PD-1 Достарлимаб* Рак эндометрия, солидные опухоли с дефицитом системы репарации неправильно спаренных пар оснований (ЬММР)
PD-1 Цемиплимаб* Плоскоклеточный рак кожи, базальноклеточный рак кожи, НМРЛ
PD-1 Тислелизумаб Плоскоклеточный рак пищевода, гепатоцеллюлярный рак, НМРЛ, назофарингеальный рак, лимфома Ходжкина, уротелиальный рак (с экспрессией РР-1.1)
PD-1 Торипалимаб Меланома, назофарингеальный рак, уротелиальный рак
PD-1 Пенпулимаб Лимфома Ходжкина, назофарингеальный рак, НМРЛ
PD-L1 Атезолизумаб* Уротелиальный рак, НМРЛ, гепатоцеллюлярный рак, меланома, мелкоклеточный рак легкого
PD-L1 Авелумаб* Рак из клеток Меркеля, уротелиальный рак, почечноклеточный рак
PD-L1 Дурвалумаб* НМРЛ, мелкоклеточный рак легкого, рак желчных протоков
CTLA-4 Ипилимумаб* Меланома, почечноклеточный рак, НМРЛ, гепатоцеллюлярный рак, колоректальный рак, мезотелиома плевры, плоскоклеточный рак пищевода
CTLA-4 Тремелимумаб* НМРЛ при отсутствии мутаций в гене БвБЯ или А.К-аберраций, гепатоцеллюлярный рак
НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого.
* Ингибиторы иммунных контрольных точек, одобренные Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA).
Таблица 3. Клинические исследования анти-PD-LI CAR T-клеточнои терапии в 2022 г.
В
Мишень/тип CAR Идентификационный
T-клеточного номер клинического
продукта Заболевание исследования
VEGFR1 и PD-L1 Злокачественные NCT05477927
CAR-T новообразования с плевральными или перитонеаль-ными метастазами
PD-L1, Рецидивы и метастазы NCT04847466
облученные рака желудка
CAR-NK или плоскоклеточного рака головы и шеи
HER2 и PD-L1 Рак (Н02-позитивный) NCT04684459
(CSR) CAR-T с плевральными или перитонеаль-ными метастазами
c-Met/PD-L1 CAR-T Гепатоцеллюлярный рак NCT03672305
MC-19PD1 CAR-T Рецидивы или рефрактерное течение В-клеточной лимфомы NCT03932955
PD-1/CD28 (CSR) Рецидивы NCT04850560
CD19 CAR-T или рефрактерное течение диффузной В-крупноклеточной лимфомы
Антигенраспознающая область: (А, Б) внеклеточная часть рецептора PD-1 или (В) вариабельные участки цепей моноклональных антител
Трансмембранный домен, «заякоривающий» рецептор в мембране (трансмембранный домен CD8 или CD28)
Стимулирующий домен (4-1ВВ, CD28, 1^, 0X40 и др.)
Благодаря высокой клинической и фундаментальной значимости PD-L1 стал прямой мишенью для CAR T-клеток. К настоящему времени известно о 6 клинических исследованиях терапии солидных новообразований и В-клеточных лимфом с применением анти-PD-L! CAR T-клеток (табл. 3).
Сигнальный цитотоксический домен CD3Z
Рис. 2. Типы химерных рецепторов анти-PD-LI: A — PD-1-основанный химерный антигенный рецептор (CAR); Б — PD-1-основанный химерный активирующий рецептор (CSR); В — классический CAR, основанный на моноклональных антителах
Fig. 2. Types of anti-PD-L1 chimeric receptors: A — PD-1-based chimeric antigen receptor (CAR); Б — PD-1-based chimeric switch receptor (CSR); В — monoclonal antibody-based classic CAR
В клинической практике могут использоваться различные варианты химерных антигенных рецепторов PD-L1, начиная от уже ставших классическими CAR на основе моноклональных антител и менее распространенных, но неиммуногенных и сопоставимо эффективных CAR-основанных до своеобразного переключателя ингибирующего сигнала рецептора PD-1 в активирующий сигнал 4-1BB, CD28 и др. (рис. 2). Такой переключатель пока не имеет русскоязычного обозначения и называется нами химерным активирующим рецептором. Дословный перевод с
английского — химерный переключающий рецептор (chimeric switch receptor, CSR) [29].
Идея использования в иммунотерапии активирующих Т-клетки молекул в противовес ингибированию контрольных точек принадлежит одному из корейских ученых, внесших вклад в открытие 4-1BB [30]. Byoung S. Kwon и соавт. получили 50%-ю частоту ответов у пациентов с поздней стадией NK/T-клеточных лимфом, положительных на вирус Эпштейна—Барр, при применении противоопухолевых Т-лимфоцитов 4-1BB. В 2019 г. данный подход был назван новой парадигмой в терапии опухолевых заболеваний. При этом активирующий рецептор CSR, используемый при CAR T-терапии, может не просто стимулировать Т-клетки по сигнальному пути 4-1BB, но и использовать им-муносупрессивное опухолевое микроокружение в качестве активирующего, тем самым повышая эффективность противоопухолевой терапии (рис. 3) [31, 32].
Таким образом, необходимость сложных разнонаправленных лечебных подходов обусловлена существованием четырехстороннего взаимодействия следующих составляющих: опухоль, опухолевое микроокружение, CAR T-клетки и иммунная система. Резистентность опухоли к проводимой терапии также не является результатом одного генетического изменения и обусловлена рядом патогенетических механизмов канцерогенеза.
В настоящей работе мы фокусируемся на контрольной точке PD-1/PD-L1 и новом подходе к ее модуляции напрямую CAR T-клетками, не забывая о чрезвычайной сложности взаимодействий внутри опухоли. Нами выполнен дизайн молекулы CAR, специфичной к PD-L1, и проверена ее активность in vitro с использованием генно-инженерных моделей и CAR T-лимфоцитов. Мы не только приводим полную аминокислотную последовательность анти-PD-Ll CAR, но и справедливо предполагаем его возможную простую модернизацию в активирующий рецептор (CSR).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Дизайн молекулярной последовательности исследуемого химерного антигенного рецептора PD-L1/2 включал сигнальный пептид CSF2RA, участок внутриклеточного домена PD-1, участок внутриклеточного домена CD28, участок цитоплазматического домена CD3Z. Последовательность химерного антигенного рецептора PD-L1/2 клонировали в экспрессионный лентивирусный плазмидный вектор, полученный и использованный ранее [33] по сайтам рестрикции AgeI и EcoRI с удалением репортерного белка FusionRed. Полная нуклеотидная последовательность анти-PD-L1/2 CAR с необходимыми сайтами для молекулярного клонирования была синтезирована в компании «Евроген» (Россия).
Лентивирусные векторы собирались методом транзиентной котрансфекции несущей CAR плаз-мидной ДНК и упаковочных плазмид в клетках линии HEK293T по описанному ранее протоколу с последующей ультрафильтрацией [34].
Для активации первичных Т-лимфоцитов моно-нуклеарная фракция была получена центрифугиро-
Иммуносупрессивное микроокружение PD-L1+
в / 1|» •
Опухоль, экспрессирующая антиген
Рис. 3. Концепция одновременного использования активирующего и классического химерных рецепторов в терапии опухолей
Fig. 3. The concept of simultaneous use of chimeric switch receptor and classic chimeric receptor in tumor therapy
ванием в градиенте 1,077 г/см3 фиколла («ПанЭко», Россия) из периферической крови здорового донора. До этапа трансдукции 5 млн мононуклеарных клеток активировали в 4 мл среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) в течение 72 ч в присутствии моноклональных антител Immunocult CD3/CD28 (STEMCELL Technologies, Канада), 10 % FBS (Himedia, Индия), 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина, 1000 ME/мл IL-2 («Биотех», Россия). После активации Т-лимфоциты инкубировали с лентивирусным вектором анти-PD-L! CAR в полной ростовой среде, содержащей 50 мкг/мл протамина сульфата («Эл-лара», Россия) в течение 5 ч. Спустя 5 ч лентивирусной трансдукции Т-лимфоциты рассевали в объем свежей культуральной среды и проводили экспансию полученных клеток в течение 72 ч. Эффективность трансдукции и получения CAR T-клеток оценивали перед сокультивированием с опухолевыми клетками-мишенями методом проточной цитометрии по интенсивности флюоресценции FITC с использованием антител, специфичных к PD-1 человека (BD, США).
Опухолевые клеточные линии были получены трансдукцией лентивирусного вектора, несущего PD-L1, в клетки линии аденокарциномы HeLa для создания специфичной мишени и трансдукцией лентиви-русного вектора, несущего только репортерный белок mCherry, в контрольные клетки HeLa. Генетическую модификацию Т-клеток оценивали методом проточной цитометрии по интенсивности флюоресценции FITC c помощью антител к PD-L1 человека (BD, США).
Для анализа цитотоксической активности полученных анти-PD-L! CAR T-лимфоцитов осуществляли их сокультивирование с клетками-мишенями опухоли в соотношении эффектора/опухоли (E/T), равном 1:20 (1 CAR T-клетка на 20 опухолевых). Цитотоксич-ность CAR T-эффекторов оценивали по изменению клеточного индекса (КИ) системы xCELLigence — метод RTCA (цитотоксичность в режиме реального времени).
MLLLVT SLLLCELPH PAFLLIPD
\ .У
MSPSNQTD
ECD PD-1
TM CD28 CD3Z
s/
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGD NATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFR VTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTE RRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGK HLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHS DYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQG QNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQK DKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Рис. 4. Схематическое изображение молекулярного устройства и аминокислотная последовательность молекулы анти-PD-LI CAR. В круге обозначены аминокислоты сигнального пептида и участка связывания с PD-L1 слева направо
Fig. 4. A schematic diagram of molecular structure and amino acid sequence of anti-PD-L1 CAR molecule. Amino acids of the signal peptide and PD-L1 binding site are highlighted in a circle from left to right
Экспрессию цитокинов и функциональность иммунного ответа CAR T-клеток оценивали в супер-натанте методом проточной цитометрии также с соотношением E/T 1:20 после 48 ч коинкубации по протоколу и с применением коммерческого набора Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit (BD, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярный дизайн химерного антигенного
рецептора PD-L1
Полученный анти-PD-LI химерный антигенный рецептор (CAR) был основан на последовательности рецептора PD-1 человека, а также на участке внеклеточного домена костимулирующей молекулы CD28 и участке цитоплазматического домена молекулы корецепторного комплекса Т-клеточного рецептора CD3Z. Сигнальный пептид на N-конце синтетического белка (аминокислотная последовательность MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPD) был взят из кодирующего участка рецептора гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора (CSF2RA). Наличие таких сигнальных пептидов позволяет принять химерным синтетическим конструкциям необходимую исследователям ориентацию и, как правило, является обязательной составляющей классического дизайна молекулы CAR.
В качестве антигенраспознающего домена CAR были выбраны аминокислоты 21-170 рецептора PD-1 человека. Таким образом, изучаемый домен содержит участок взаимодействия с PD-L1 — аминокислотная последовательность MSPSNQTD [35], а также эпитопы связывания ниволумаба (LDSPDRPWNP) [36] и пем-бролизумаба (NQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQ) [37]. Последовательность спейсер-шарнира (hinge region),
иногда используемая для гибкости антигенраспознающего домена CAR, в данной конструкции отсутствовала. Трансмембранный и костимулирующий домены были выбраны как участок молекулы CD28, на C-конце находился цитоплазматический домен CD3Z (рис. 4).
Оценка уровня экспрессии химерного антигенного рецептора PD-1
Для создания CAR T-клеток, несущих химерный антигенный рецептор PD-1, использовали Т-клетки, выделенные из фракции мононуклеаров здорового донора с клеточным соотношением CD4+ 24 % и CD8+ 60 % (рис. 5, А). Полученные лентивирусные частицы на основе созданной целевой конструкции трансдуци-ровали первичные Т-лимфоциты с эффективностью более 20 %. Эффективность трансдукции и получения CAR T-клеток оценивали по иммунофлюоресценции рецептора PD-1 на поверхности цитоплазматической мембраны эффекторов (рис. 5, Б). Для верификации специфической цитотоксической активности исследуемых анти-PD-l CAR T-клеток была создана модельная клеточная линия-мишень HeLa с конститутивной экспрессией PD-L1 (рис. 5, В).
Оценка специфической цитотоксической активности клеток-эффекторов CAR-T PD-1
Для исследования специфического цитоток-сического эффекта полученных анти-PD-LI CAR T-эффекторов их сокультивировали с клетками-мишенями линии HeLa в течение 48 ч в соотношении Е/T 1:20. В качестве отрицательных контролей специфичности CAR использовали опухолевую клеточную линию HeLa, лишенную модификаций. Сокультивиро-вание мишеней с Т-клетками выполняло роль оценки неспецифического ответа эффекторов на опухоль. Несмотря на низкое отношение клеток-эффекторов к клеткам-мишеням, сокультивирование исследуемых анти-PD-LI CAR T-эффекторов инициирует цитолиз HeLa_PD-L1 и снижение КИ. Это доказывает специфичность разработанного химерного рецептора PD-1 к лиганду, экспрессируемому на опухолевых клетках (рис. 6, А, Б). При добавлении клеток-эффекторов CAR-T наблюдается закономерное снижение КИ в 1,5 раза по сравнению с контрольными точками без сокультивирования и с сокультивированием мишени с Т-клетками без модификации (рис. 6, В).
Согласно результатам, обнаруженное снижение КИ при сокультивировании эффекторов CAR-T и линии HeLa_PD-L1 (КИ = 0,738) по сравнению с контролем (КИ = 1,0645) доказывает специфичность полученной молекулы химерного антигенного рецептора PD-1, а также наличие цитотоксического эффекта у исследуемых CAR T-эффекторов.
Оценка функциональности специфического цитотоксического ответа анти-PD^ CAR T-эффекторов
Для оценки функциональности специфической цитотоксической активности исследуемых ан-ти-PD-Ll CAR T-эффекторов было проанализировано содержание основных цитокинов — медиаторов иммунного ответа: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y, IL-17A (рис. 7). Для анализа с помощью проточной ци-
А
о
< 50 ti to to
Анти-PD-Ll CAR-T: все события
Анти-PD-Ll CAR-T: клетки
Б
<506 to to
В
< 50 6 to to
FSC-A (x104)
Т-клетки: все события
50
FSC-A (x104)
HeLa: все события
Т-клетки 93,21 %
0 50
FSC-A (x104)
-A50 C-
S S
PD-1 FITC-A
HeLa: клетки
-A50 C-
S S
PD-L1 FITC-A
Анти-PD-Ll CAR-T: лейкоциты CD45+
Анти-PD-Ll CAR-T: Т-клетки CD3+
10
< 50 C-
S S
0 104 10s CD45 PerCP-Cy5.5-A
T-клетки
10s
CD3 FITC-A
Анти-PD-Ll CAR-T: все события
-A50 C-
50
FSC-A (x104)
HeLa_PD-L1: все события
-A50 C-
50
FSC-A (x104)
104 10s CD4 PC7-A
Анти-PD-L1 CAR-T: Т-клетки
-A C-
0 104 10s 10' PD-1 FITC-A
HeLa_PD-L1: клетки
Клетки 78,05 % Ijppt-
lib.
гШР р*' '
ш
W
-A C-
0 10" 10s 10' PD-L1 FITC-A
100
100
0
0
100
100
100
100
50
0
0
0
0
0
100
0
100
100
100
100
100
50
0
0
0
0
100
0
100
10
Рис. 5. Цитофлюориметрическая оценка исследуемых анти-PD-L1 CAR T-эффекторов и линии-мишени HeLa_PD-L1: А — фенотипирование Т-клеточной популяции здорового донора по маркерам CD45, CD3, CD4, CD8; Б — оценка эффективности лен-тивирусной трансдукции анти-PD-L1 CAR-T; В — оценка экспрессии PD-L1 на поверхности цитоплазматической мембраны линии-мишени HeLa_PD-L1
Fig. 5. Cytofluorometric evaluation of the analyzed anti-PD-LI CAR-T effectors and HeLa_PD-L1 target cell line: A — phenotyping of healthy donor T-cell population by markers CD45, CD3, CD4, CD8; 5 — assessment of anti-PD-LI CAR-T lentiviral transduction efficiency; B — PD-L1 expression assessment on the surface of cytoplasmic membrane of HeLa_PD-L1 target cell line
тофлюориметрии клеточный супернатант был собран после 48 ч сокультивирования клеток-эффекторов c клетками-мишенями в соотношении E/T 1:20.
При сокультивировании исследуемых анти-PD-L! CAR T-эффекторов c линией-мишенью HeLa_PD-L1 происходит значительное увеличение концентрации цитокинов IL-2 (1000 пг/мл), IL-6 (438,5 пг/мл), TNF-a (44 пг/мл), IFN-y (1034 пг/мл), IL-10 (11,7 пг/мл) по сравнению с контрольной точкой без добавления CAR T-эффекторов. Индукция синтеза цитокинов — медиаторов воспаления в ходе сокультивирования с таргетной линией опухолевых клеток HeLa_PD-L1 указывает на специфичность подобранной конструкции химерного антигенного рецептора PD-1, а также подтверждает функциональность и наличие иммунного ответа исследуемых клеток-эффекторов на модели солидной опухоли.
Таким образом, презентация химерного антигенного рецептора PD-1 на поверхности цитоплазматической мембраны Т-лимфоцитов после лентивирусной трансдукции, специфичность ци-тотоксической активности эффекторов к лиганду PD-L1 свидетельствуют о функциональности полученной конструкции химерного рецептора. Это в равной степени подтверждается индукцией синтеза провоспалительных цитокинов IL-2, IL-6, TNF-a, IFN-y. Аппликации полученного CAR на основе молекулы ингибитора контрольных точек PD-1 могут в дальнейшем быть расширены относительно ликвидации иммуносупрессивного микроокружения опухолей различного генеза. Это, в свою очередь, может служить дополнительным эффективным инструментом в комплексном иммунотерапевтиче-ском подходе.
А
0,60
20,3
24,5
28,8 33,0
Время, ч
37,3
HeLa_PD-L1 (контроль) HeLa_PD-L1 + Т-клетки HeLa_PD-L1 + анти-PD-LI CAR-T
41,5
Б 1,10
В 1,2
1,0
0,8
0,6
р
° 0,4
0,2 0,0
28,8 33,0
Время, ч
I
1,0645
I
1,129
1,0051
1,0173
HeLa
HeLa_PD-L1
HeLa + T-клетки
0,9635
HeLa (контроль) HeLa + Т-клетки HeLa + анти-PD-LI CAR-T
0,738
HeLa_PD-L1 + HeLa + HeLa_PD-L1 +
Т-клетки анти-PD-L! CAR-T анти-PD-L1 CAR-T
Рис. 6. Результаты анализа цитотоксической активности исследуемых анти-PD-LI CAR T-эффекторов на опухолевой линии-мишени HeLa в реальном времени с помощью системы xCelligence (RTCA). Соотношение E/T 1:20: A — кривая клеточной пролиферации опухолевой линии-мишени HeLa_PD-L1 в ходе сокультивирования с Т-клетками (синий), ан-™-PD-L1 CAR T-эффекторами (зеленый) и без сокультивирования (красный). Красной линией отмечена временная точка сравнения 37 ч; Б — кривая клеточной пролиферации контрольной опухолевой линии-мишени HeLa в ходе сокультивирования с Т-клетками (синий), клетками анти-PD-LI CAR T-эффекторами (зеленый) и без сокультивирования (красный). Красной линией отмечена временная точка сравнения 37 ч; В — гистограмма нормализованного клеточного индекса (КИ) контрольных точек и сокультивирования спустя 17 ч после добавления анти-PD-LI CAR T-эффекторов и Т-клеток донора для контроля неспецифической цитотоксической активности (p < 0,05)
Fig. 6. The real-time cytotoxicity assay of anti-PD-LI CAR-T effectors on the HeLa tumor cell line using xCelligence (RTCA). E/T 1:20: A — cell proliferation curve of HeLa_PD-L1 tumor cell line during T-cell (blue) and anti-PD-LI CAR-T effectors (green) co-cultivation and without it (red). The red line marks the time reference point of 37 hours; 5 — cell proliferation curve of control HeLa tumor cell line during T-cell (blue) and anti-PD-LI CAR-T effectors (green) co-cultivation and without it (red). The red line marks the time reference point of 37 hours; B — histogram of normalized cell index (KM) at the end points and with co-cultivation 17 hours after adding anti-PD-LI CAR-T effectors and donor T-cells for the monitoring of non-specific cytotoxicity (p < 0.05)
А
1G6
1G5
O 1G4 P
1G3
1G2
Б
1G
O 1G4 P
В
а р
т н
е
T-клетки
L6(11,94*3^
м I I I 1 fe •■ TNF<12,16%)ï
FN JÍ16,36%)
• ЩШшЁ?' L1 ГА(13Л2%>
Яг-
1G4
1G5
PE-A
1G6
PD-L1 HeLa + T-клетки
1G4
1G5
PE-A
1G6
14GG
л
E
]= 12GG «
1GGG
3GG
он 6GG
4GG 2GG G
1GGG,G
2,9 3,1 1,3 IL-2
44,G
1,6 1,6 1,5 ! 1,5 1,5 4,3
TNF-a
IFN-Y
1G7
1G7
1G6
1G5
о 1G4 -P
1G3
1G2
1G6
1G5
o 1G4 P
1G3
1G2
1G34,G
PD-L1_HeLa (контроль)
I. _
1G4
1G5
PE-A
1G6
PD-L1 HeLa + анти-PD-L1 CAR-T
1G4
1G5
PE-A
1G6
1G7
11.2(13,86%)
L4(14,3149 ■ -J '
.маШШ...
L1 0(15.09%)
TNF|13.Г1 %•) 'тШ
■ ■ ■ ^^й/Ш^-' FMB(I4,37%) ... ■ "irv^iÄ-c
L17AT14.52M ^^^^
:
1G7
HeLa_PD-L1 Т-клетки
HeLa_PD-L1 + Т-клетки HeLa_PD-L1 + анти-PD-L1 CAR-T
Í433,5 1,3
2,3 1,3 5,7 1,3 1,3 1,9 11,7 1,4 1,3 1,3 5,6 2,9 2,9 2,9 3,7 IL-6 IL-1Q IL-17A IL-4
Рис. 7. Оценка содержания цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y, IL-17A после 48 ч сокультивирования анти-PD-L1 CAR T-эф-фекторов с клетками линии-мишени HeLa_PD-L1: А — цитограммы уровня цитокинов в контрольных точках без сокультивирования: Т-клетки и клетки HeLa_PD-L1; Б — цитограммы уровня цитокинов в экспериментальных точках сокультивирования опухолевой линии-мишени HeLa_PD-L1 с эффекторами: Т-клетки и анти-PD-L1 CAR T-клетки; В — гистограмма количественной оценки содержания провоспалительных цитокинов при сокультивировании анти-PD-L1 CAR T-эффекторов с клетками линии-мишени HeLa_PD-L1 IFN-y — интерферон-Y; IL — интерлейкин; TNF-a — фактор некроза опухолей-a.
Fig. 7. Levels of cytokines IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a, IFN-y, IL-17A assessed 48 hours after anti-PD-L1 CAR-T effector co-cultivation with HeLa_PD-L1 target cell line:
А — cytograms of cytokine levels at the end points without co-cultivation: Т-cells and HeLa_PD-L1 cells; Б — cytograms of cytokine levels at the experimental points of HeLa_PD-L1 tumor cell line co-cultivation with effectors: Т-cells and anti-PD-L1 CAR-T cells; В — quantitative histogram showing the level of pro-inflammatory cytokines during anti-PD-L1 CAR-T effector co-cultivation with HeLa_PD-L1 target cell line IFN-y — interferon-gamma; IL — interleukin; TNF-a — tumor necrosis factor alpha.
G
G
G
G
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Новая парадигма противоопухолевой терапии, в которой CAR T-клетки могут играть центральную роль, невозможна без понимания сложной организации
опухоли и взаимодействия опухолевого микроокружения с Т-клетками, несущими химерный антигенный рецептор. До сих пор иммуносупрессивное влияние опухоли и микроокружения подавляли, в частности, с применением ИКТ. Новым этапом, напротив, стала
активация Т-лимфоцитов через такие молекулы, как CD28 или 4-1BB, которые критически необходимы для персистенции генетически модифицированных Т-лимфоцитов [32].
Одним из показательных примеров использования терапии, направленной как на опухоль, так и на опухолевое микроокружение с активацией CAR T-лимфоцитов через молекулу 4-1BB, является исследование Q. Ma и соавт. [32]. Авторы продемонстрировали более высокий уровень анти-HER2 CAR T-клеток с активирующим доменом CD28 в сравнении с анти-HER2 CAR T-клетками с активирующим доменом 4-1ВВ при раке легкого, молочной железы, желудочно-кишечного тракта с метастазами и раке яичников с плевральным и перитонеальным выпотами. Однако секреция эффекторных цитокинов и пролиферация HER2.28Z CAR T-клеток значительно снижались в иммуносупрессивной среде плеврального или перитонеального выпота. В последующем эти авторы создали CAR T-клетки с двойным нацеливанием (HER2.28Z/PD-L1.BB), содержащие CSR, который переключал иммуносупрессивный сигнал от PD-L1 в активирующий молекулу 4-1BB. CRS-модифицированные CAR T-клетки с двойным нацеливанием, в которых происходила активация молекулы 4-1BB, показали более высокую цитоток-сичность и пролиферацию в сравнении с HER2.28Z CAR-T [32].
Таким образом, комбинированная терапия, направленная как на опухоль, так и на опухолевое микроокружение, с применением нескольких препаратов различной природы может быть заменена новым поколением высокоэффективных CAR T-продуктов с низкой частотой развития побочных эффектов.
Ожидается, что новое поколение CAR T-клеточных продуктов в виде многокомпонентного препарата может иметь в составе несколько разнонаправленных CAR T-эффекторов, что обеспечит одновременное воздействие как минимум в трех направлениях:
1) эрадикация опухолевых клеток, например, за счет взаимодействия химерного антигенного рецептора NKG2D с лигандами MICA/B, ULBP1-6 [38];
2) эрадикация иммуносупресирующих стареющих клеток, например, путем связывания химерного антигенного рецептора с CD87 [33];
3) активация CAR T-клеток за счет PD^-экс-прессирующего микроокружения, например, PD1-4-1BB-основанным химерным активирующим рецептором [32]. Так, специфичные ан-ra-PD-L1 CAR T-лимфоциты могут стать одним из ключевых элементов мультитаргетной CAR T-клеточной терапии.
Нами получен и проверен на свою in vitro активность химерный антигенный рецептор против PD-L1. CAR T-клетки, экспрессирующие данный рецептор, специфически распознают мишень, вызывают гибель опухолевых клеток, а также экспрессируют специфические цитокины IFN-y, TNF-a и IL-2. Такой химерный антигенный рецептор можно модифицировать в активирующий (CSR) делецией CD3Z-домена и использовать совместно с другими CAR без прогнозируемой неспецифической токсичности.
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Aвторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ
Работа выполнена за счет средств гранта РНФ 19-7510059.
ВКЛАД АВТОРОВ
Концепция и дизайн: А.В. Петухов, А.А. Дакс.
Сбор и обработка данных: К.А. Левчук, П.А. Матей-
кович.
Предоставление материалов исследования:
К.А. Левчук.
Анализ и интерпретация данных: А.В. Петухов, К.А. Левчук, А.А. Дакс.
Подготовка рукописи: А.В. Петухов, К.А. Левчук, Е.А. Столярова, А.Х. Валиуллина, А.А. Голдаева. Окончательное одобрение рукописи: А.Х. Валиуллина, Е.А. Столярова, Э.Р. Булатов, Е.В. Байдюк, Н.А. Барлев, Я.Г. Торопова.
flMTEPATyPA/REFERENCES
1. Cerrano M, Ruella M, Perales M-A, et al. The Advent of CAR T-Cell Therapy for Lymphoproliferative Neoplasms: Integrating Research Into Clinical Practice. Front Immunol. 2020;11:888. doi: 10.3389/fimmu.2020.00888.
2. Lohr J, Knoechel B, Abbas AK. Regulatory T cells in the periphery. Immunol Rev. 2006;212(1):149-62. doi: 10.1111/j.0105-2896.2006.00414.x.
3. Kershaw MH, Westwood JA, Parker LL, et al. A Phase I Study on Adoptive Immunotherapy Using Gene-Modified T Cells for Ovarian Cancer. Clin Cancer Res. 2006;12(20):6106-15. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-06-1183.
4. Park JR, DiGiusto DL, Slovak M, et al. Adoptive Transfer of Chimeric Antigen Receptor Re-directed Cytolytic T Lymphocyte Clones in Patients with Neuroblas-toma. Mol Ther. 2007;15(4):825-33. doi: 10.1038/sj.mt.6300104.
5. Jafarzadeh L, Masoumi E, Fallah-Mehrjardi K, et al. Prolonged Persistence of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell in Adoptive Cancer Immunotherapy: Challenges and Ways Forward. Front Immunol. 2020;11:702. doi: 10.3389/ fimmu.2020.00702.
6. Amini L, Silbert SK, Maude SL, et al. Preparing for CAR T cell therapy: patient selection, bridging therapies and lymphodepletion. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(5):342-55. doi: 10.1038/s41571-022-00607-3.
7. Mahadeo KM, Khazal SJ, Abdel-Azim H, et al. Management guidelines for paediatric patients receiving chimeric antigen receptor T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2019;16(1):45-63. doi: 10.1038/s41571-018-0075-2.
8. Ren X, Guo S, Guan X, et al. Immunological Classification of Tumor Types and Advances in Precision Combination Immunotherapy. Front Immunol. 2022;13:790113. doi: 10.3389/fimmu.2022.790113.
9. Watanabe K, Kuramitsu S, Posey AD, June CH. Expanding the Therapeutic Window for CAR T Cell Therapy in Solid Tumors: The Knowns and Unknowns of CAR T Cell Biology. Front Immunol. 2018;9:2486. doi: 10.3389/fimmu.2018.02486.
10. Bent EH, Millan-Barea LR, Zhuang I, et al. Microenvironmental IL-6 inhibits anti-cancer immune responses generated by cytotoxic chemotherapy. Nat Commun. 2021;12(1):6218. doi: 10.1038/s41467-021-26407-4.
11. Karki R, Sharma BR, Tuladhar S, et al. Synergism of TNF-a and IFN-y Triggers Inflammatory Cell Death, Tissue Damage, and Mortality in SARS-CoV-2 Infection and Cytokine Shock Syndromes. Cell. 2021;184(1):149-168.e17. doi: 10.1016/j. cell.2020.11.025.
12. Patel SJ, Sanjana NE, Kishton RJ, et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature. 2017;548(7669):537-42. doi: 10.1038/na-ture23477.
13. Kearney CJ, Vervoort SJ, Hogg SJ, et al. Tumor immune evasion arises through loss of TNF sensitivity. Sci Immunol. 2018;3(23):eaar3451. doi: 10.1126/ sciimmunol.aar3451.
14. Han P, Dai Q, Fan L, et al. Genome-Wide CRISPR Screening Identifies JAK1 Deficiency as a Mechanism of T-Cell Resistance. Front Immunol. 2019;10:251. doi: 10.3389/fimmu.2019.00251.
15. Larson RC, Kann MC, Bailey SR, et al. CAR T cell killing requires the IFNyR pathway in solid but not liquid tumours. Nature. 2022;604(7906):563-70. doi: 10.1038/s41586-022-04585-5.
16. Mimura K, Teh JL, Okayama H, et al. PD-L1 expression is mainly regulated by interferon gamma associated with JAK-STAT pathway in gastric cancer. Cancer Sci. 2018;109(1):43-53. doi: 10.1111/cas.13424.
17. Chen S, Crabill GA, Pritchard TS, et al. Mechanisms regulating PD-L1 expression on tumor and immune cells. J Immunother Cancer. 2019;7(1):305. doi: 10.1186/ s40425-019-0770-2.
18. Ключагина Ю.И., Соколова З.А., Барышникова М.А. Роль рецептора PD1 и его лигандов PDL1 и PDL2 в иммунотерапии опухолей. Онкопедиатрия. 2017;4(1):49-55. doi: 10.15690/onco.v4i1.1684.
[Klyuchagina YI, Sokolova ZA, Baryshnikova MA. Role of PD-1 receptor and its ligands PD-L1 and PD-L2 in cancer immunotherapy. Oncopediatrics. 2017;4(1):49-55. doi: 10.15690/onco.v4i1.1684. (In Russ)]
19. Liu J, Chen Z, Li Y, et al. PD-1/PD-L1 Checkpoint Inhibitors in Tumor Immunotherapy. Front Pharmacol. 2021;12:731798. doi: 10.3389/fphar.2021.731798.
20. Zhulai G, Oleinik E. Targeting regulatory T cells in anti-PD-1/PD-L1 cancer immunotherapy. Scand J Immunol. 2022;95(3):e13129. doi: 10.1111/sji.13129.
21. Wu M, Huang Q, Xie Y, et al. Improvement of the anticancer efficacy of PD-1/ PD-L1 blockade via combination therapy and PD-L1 regulation. J Hematol Oncol. 2022;15(1):24. doi: 10.1186/s13045-022-01242-2.
22. Jia Q, Wang A, Yuan Y, et al. Heterogeneity of the tumor immune microenvironment and its clinical relevance. Exp Hematol Oncol. 2022;11(1):24. doi: 10.1186/ s40164-022-00277-y.
23. Zhao Y, Liu L, Weng L. Comparisons of Underlying Mechanisms, Clinical Efficacy and Safety Between Anti-PD-1 and Anti-PD-L1 Immunotherapy: The State-of-the-Art Review and Future Perspectives. Front Pharmacol. 2021;12:714483. doi: 10.3389/fphar.2021.714483.
24. Kaufman HL, Kohlhapp FJ, Zloza A. Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(9):642-62. doi: 10.1038/nrd4663.
25. Liu Y-T, Sun Z-J. Turning cold tumors into hot tumors by improving T-cell infiltration. Theranostics. 2021;11(11):5365-86. doi: 10.7150/thno.58390.
26. Rao SG, Jackson JG. SASP: Tumor Suppressor or Promoter? Yes! Trends in Cancer. 2016;2(11):676-87. doi: 10.1016/j.trecan.2016.10.001.
27. Schmitt CA, Wang B, Demaria M. Senescence and cancer - role and therapeutic opportunities. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(10):619-36. doi: 10.1038/ s41571-022-00668-4.
28. Wang B, Kohli J, Demaria M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes? Trends in Cancer. 2020;6(10):838-57. doi: 10.1016/j.trecan.2020.05.004.
29. Chen C, Gu Y-M, Zhang F, et al. Construction of PD1/CD28 chimeric-switch receptor enhances anti-tumor ability of c-Met CAR-T in gastric cancer. Oncoimmu-nology. 2021;10(1):1901434. doi: 10.1080/2162402X.2021.1901434.
30. Biopharma dealmakers. Using immunology to bring new paradigms to oncology therapies (Internet). Available from: https://www.nature.com/articles/ d43747-020-00780-3 (accessed 29.032023).
31. Liu H, Lei W, Zhang C, et al. A phase I trial using CD19 CAR-T expressing PD-1/CD28 chimeric switch-receptor for refractory or relapsed B-cell lymphoma. J Clin Oncol. 2019;37(15_suppl):7557. doi: 10.1200/JC0.2019.37.15_ suppl.7557.
32. Ma Q, He X, Zhang B, et al. A PD-L1-targeting chimeric switch receptor enhances efficacy of CAR-T cell for pleural and peritoneal metastasis. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):380. doi: 10.1038/s41392-022-01198-2.
33. Неклесова М.В., Смирнов С.В., Шатилова А.А. и др. Получение специфичных к антигену CD87 CAR T-лимфоцитов и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2022;15(4):340-8. doi: 10.21320/2500-2139-2022-15-4-340-348.
[Neklesova MV, Smirnov SV, Shatilova AA, et al. Production of CD87 Antigen-Specific CAR-T Lymphocytes and Assessment of Their In Vitro Functional Activity. Clinical oncohematology. 2022;15(4):340-8. doi: 10.21320/2500-21392022-15-4-340-348. (In Russ)]
34. Зайкова Е.К., Левчук K.A., Поздняков Д.Ю. и др. Эффективная трансдукция Т-лимфоцитов лентивирусными частицами в онкоиммунологи-ческих исследованиях. Клиническая онкогематология. 2020;13(3):295-306. doi: 10.21320/2500-2139-2020-13-3-295-306.
[Zaikova EK, Levchuk KA, Pozdnyakov DYu, et al. Efficient Transduction of T-Lymphocytes by Lentiviral Particles in Oncoimmunological Studies. Clinical oncohematology. 2020;13(3):295-306. doi: 10.21320/2500-2139-2020-13-3-295306. (In Russ)]
35. Zak KM, Kitel R, Przetocka S, et al. Structure of the Complex of Human Programmed Death 1, PD-1, and Its Ligand PD-L1. Structure. 2015;23(12):2341-8. doi: 10.1016/j.str.2015.09.010.
36. Tan S, Zhang H, Chai Y, et al. An unexpected N-terminal loop in PD-1 dominates binding by nivolumab. Nat Commun. 2017;8(1):14369. doi: 10.1038/ ncomms14369.
37. Na Z, Yeo SP, Bharath SR, et al. Structural basis for blocking PD-1-medi-ated immune suppression by therapeutic antibody pembrolizumab. Cell Res. 2017;27(1):147-50. doi: 10.1038/cr.2016.77.
38. Левчук K.A., Осипова С.А., Онопченко А.В. и др. Экспериментальное исследование функциональной активности химерного антигенного рецептора NKG2D in vitro и in vivo. Клиническая онкогематология. 2022;15(4):327-39. doi: 10.21320/2500-2139-2022-15-4-327-339.
[Levchuk KA, Osipova SA, Onopchenko AV, et al. Experimental Study of the In Vitro and In Vivo Functional Activity of NKG2D Chimeric Antigen Receptor. Clinical oncohematology. 2022;15(4):327-39. doi: 10.21320/2500-2139-2022-15-4-327339. (In Russ)]
