CC BY
31
© Коллектив авторов, 2022
Терещенко В.П.1' 2, Кузнецова М.С.1, Шевченко Ю.А.1, Фишер М.С.1, Курилин В.В.1, Ллсаллум Л.1, Акахори Я.3, Шику Х.1' 3, Сенников С.В.1
Характеристика лимфоцитов с MAGE-A4-специфичным TCR-подобным CAR-рецептором in vitro
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 630099, г. Новосибирск, Российская Федерация
2 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Научно-технологический университет «Сириус», 354340, пгт Сириус, Российская Федерация
3 Университет Мие, г. Цу, Япония
Резюме
Введение. В настоящее время одним из перспективных вариантов CAR-T-технологии является разработка лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором, распознающих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов в комплексе с MHC, что открывает широкий выбор возможных антигенов-мишеней любой клеточной локализации.
В данной работе представлена характеристика in vitro лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к MAGE-A4 - раково-эмбриональному антигену, экспрессия которого наблюдается лишь в злокачественных новообразованиях и в иммуно-привилегированных органах, что делает его перспективной мишенью для эффективной CAR-Т-клеточной терапии со сниженной нецелевой токсичностью.
Материал и методы. С помощью проточной цитометрии лимфоциты, трансдуци-рованные и нетрансдуцированные TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к MAGE-A4, изучены на предмет содержания субпопуляций клеточной памяти (по маркерам CD45RA и CD62L) и явлений клеточной активации и истощения (по маркерам CD69, CD95, PD-1, TIM3). Цитотоксичность полученных CAR-Т-клеток изучена колориметрическим методом по содержанию лактатдегидрогеназы. Эффекторная функция CAR-Т-лимфоцитов изучена после сокультивирования с клетками-мишенями по маркерам клеточной активации (4-1BB, CD69, CD40L, FasL) с помощью проточной цитометрии.
Результаты. CD4+- и ОТ8+-лимфоциты, трансдуцированные TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к MAGE-A4, отличались повышенным содержанием терминально дифференцированных эффекторных Т-клеток, а также активированных (по маркеру CD69) и истощенных (PD-1+TIM3+) клеток. Однако преимущественно данные клетки были представлены слабодифференцированными субпопуляциями Т-клеток памяти и не несли маркеров активации и истощения. Трансдуцированные культуры проявляли антиген-специфичные цитотоксические свойства, превышающие таковые для не-трансдуцированных культур. При этом цитотоксическая функция трансдуцированных клеток сопровождалась повышением количества клеток, несущих активационные иммуностимулирующие молекулы 4-1BB, CD69, CD40L.
Заключение. Полученные лимфоциты c TCR-подобным CAR, специфичным к MAGE-A4, проявляют противоопухолевые свойства in vitro и могут быть рекомендованы к дальнейшим доклиническим испытаниям в экспериментальных моделях in vitro и in vivo.
Ключевые слова: CAR; TCR-подобные CAR-T-клетки; MAGE-A4; GITR; субпопуляции Т-клеток памяти; Т-клеточная активация; Т-клеточное истощение
Статья получена 18.04.2022. Принята в печать 01.07.2022.
Для цитирования: Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсал-лум А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Характеристика лимфоцитов с MAGE-A4-специфичным TCR-подобным CAR-рецептором in vitro. Иммунология. 2022; 43 (4): 401-411. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-401-411
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-6500004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Для корреспонденции
Сенников Сергей Витальевич -доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии, главный научный сотрудник лаборатории клеточных технологий иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Кури-лин В.В., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В; сбор и обработка материала - Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Алсаллум А.; статистическая обработка данных - Терещенко В.П.; написание текста - Терещенко В.П.; редактирование - Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Сенников С.В.; утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Терещенко В. П.
Tereshchenko V.P.1' 2, Kuznetsova M.S.1, Shevchenko J.A.1, Fisher M.S.1, Kurilin V.V.1, Alsalloum A.1, Akahori Yu.3, Shiku H.1 3, Sennikov S.V.1
Study of MAGE-A4 specific TCR-like CAR-T lymphocytes in vitro
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 630099, Novosibirsk, Russian Federation.
2 Sirius University of Science and Techonology, 354340, Sochi, Sirius, Russian Federation
3 Mie University Graduate School of Medicine, Tsu, Japan
Abstract
Introduction. Currently, one of the promising options for CAR-T technology is the development of TCR-like CAR-T lymphocytes that recognize epitopes of tumor-associated antigens in combination with MHC, which opens up a wide range of possible target antigens of any cellular localization. This work presents characterization in vitro of TCR-like CAR-T cells specific for MAGE-A4, a cancer-germline antigen, which expression is observed only in malignant neoplasms and immune-privileged organs, which makes it a promising target for effective CAR-T cellular therapy with reduced off-target toxicity.
Material and methods. Transduced and non-transduced lymphocytes were studied for the memory subsets (by markers CD45RA and CD62L) and cell activation and exhaustion markers (CD69, CD95, PD-1, TIM3) by flow cytometry. The cytotoxicity of the obtained CAR-T cells was studied colorimetrically by the content of lactate dehydrogenase. The effector function of CAR-T cells was studied after cocultivation with target cells by cell activation markers (4-1BB, CD69, CD40L, FasL) detection using flow cytometry.
Results. Transduced CD4+ and CD8+ lymphocytes were characterized by an increased content of terminal effector cells, as well as activated (according to CD69 marker) and exhausted cells (PD-1+TIM3+ phenotype). However, predominantly, transduced cells were represented by low differentiated memory T cell subsets, and did not carry markers of activation and exhaustion. Transduced cultures exhibited antigen-specific cytotoxicity greater than those of non-transduced cells. At the same time, the cytotoxicity of transduced cells was accompanied by an increase in the number of cells carrying activation immunostimulating molecules 4-1BB, CD69, CD40L.
Conclusion. The MAGE-A4-specific TCR-like CAR-T cells exhibit antitumor response in vitro and can be recommended for further preclinical study in experimental models in vitro and in vivo.
Keywords: CAR; TCR-like CAR-T cells; MAGE-A4; GITR; memory T cell subsets; T cell activation; T cell exhaustion
Received 18.04.2022. Accepted 01.07.2022.
For citation: Tereshchenko V.P., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Fisher M.S., Kurilin V.V., Alsalloum A., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V. Study of MAGE-A4 specific TCR-like CAR-T lymphocytes in vitro. Immu-nologiya. 2022; 43 (4): 401-11. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-401-411 (in Russian)
Funding. The research was supported by the grant of the Russian Science Foundation (project No. 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
Authors' contributions. The concept and design ofthe study - Tereshchenko V.P., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Kurilin V.V., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V.; data collection and processing - Tereshchenko V.P., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Fisher M.S., Alsallum A.; statistical data processing - Tereshchenko V.P.; text writing -Tereshchenko V.P.; editing - Tereshchenko V.P., Kuznetsova M.S., Sennikov S.V.; approval of the final version of the article - Sennikov S.V.; responsibility for the integrity of all parts of the article - Tereshchenko V.P.
For correspondence
Sergey V. Sennikov -MD, PhD, Professor, Head of Molecular Immunology Laboratory, Chief Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Введение
В настоящее время активно разрабатываются методы персонализированного лечения пациентов со злокачественными новообразованиями с помощью лимфоцитов с генетически модифицированным антиген-специфичным клеточным рецептором. Бурное развитие данного научного направления привело к появлению и тестированию целого ряда генетически модифицированных лимфоцитов, к которым относятся Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-Т-клетки), специфичным к поверхностным молекулам опухолевых клеток [1-4], a также Т-клетки с искусственно внесенным Т-клеточным рецептором (TCR) желаемой специфичности (TCR-инженерные T- клетки) [5, 6].
CAR-T-лимфоциты распознают эпитопы поверхностно расположенных антигенов, количество которых оценивается в 14-26 % от всего протеома клетки [7-9], что существенно ограничивает выбор возможных эффективных и специфичных мишеней для противоопухолевой CAR-Т-терапии. Однако внутриклеточный домен химерного рецептора может быть модифицирован для проведения дополнительных сигналов, обеспечивающих устойчивость лимфоцита к иммуносупрессивному микроокружению опухоли и истощению [10-12].
TCR-инженерные Т-лимфоциты, как и естественные Т-лимфоциты, распознают комплекс пептид-MHC (рМНС), пептид в котором может быть получен от антигенов из любого клеточного компартмента. Среди них могут присутствовать онкогены, непосредственно обусловливающие развитие опухолевого процесса, в том числе неоантигены, антигены онкогенных вирусов и зародышевые раковые антигены (cancer germ-line antigens) [13]. При этом, однако, для успешной активации TCR-инженерных T-клеток требуется полноценный кости-муляторный сигнал, реализация которого может быть затруднена в условиях иммуносупрессивного микроокружения опухоли. Эффективность противоопухолевой терапии TCR-инженерными Т-лимфоцитами может быть увеличена за счет последующей вакцинации pMHC-несущими агентами, например MHC-мономерами или антиген-представляющими клетками [14].
Возможным путем объединения преимуществ и устранения недостатков CAR-T-клеточной и TCR-инженерной клеточной терапии может быть применение лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором [12, 13], антиген-распознающий домен которого представлен scFv-фрагментом TCR-подобного антитела, специфичного к комплексу желаемого эпитопа и молекулы MHC, а внутриклеточный сигнальный домен может повторять таковой для CAR-T-клеток. Таким образом, лимфоциты с TCR-подобным CAR-рецептором могут быть нацелены на антигены любой клеточной локализации, а их функция может быть усилена за счет модификаций внутриклеточного сигнального домена CAR-рецептора и посттрансферной вакцинацией с помощью pMHC-несущих агентов [15-16].
В данной работе описано получение, а также фено-типические и функциональные свойства лимфоцитов
с TCR-подобным CAR-рецептором, антиген-распозна-ющая часть которого специфична к эпитопу p230-239 (GVYDGREHTV) опухолевого антигена MAGE-A4, а внутриклеточный домен содержит активационный мотив GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein, TNFRSF18, CD357).
Высокий уровень MAGE-A4 обнаружен в злокачественных новообразованиях головы и шеи, пищевода, желудка, яичников, эндометрия и других органов [17]. При этом MAGE-A4 является раково-эмбриональным антигеном, экспрессия которого в нормальных условиях ограничена иммунопривилегированными органами - яичками и плацентой, что делает MAGE-A4 перспективной мишенью для противоопухолевой терапии со сниженной нецелевой токсичностью. Однако предыдущие попытки таргетирования MAGE-A4 на солидных новообразованиях с помощью белковых и пептидных вакцин, а также TCR-инженерных лимфоцитов проявили ограниченную клиническую эффективность [18, 19]. Таким образом, поиск альтернативных вариантов анти-MAGE-A4-терапии остается актуальным.
Предлагаемый подход с использованием активаци-онного мотива GITR во внутриклеточном домене CAR-конструкции может обеспечить повышенную терапевтическую эффективность, поскольку GITR является мощным костимулятором Т-клеток [20], а его внутриклеточный сигнал, приводящий к активации NF-kB, не подвержен супрессорному влиянию сигналинга PD-1 [21].
К тому же мы надеемся, что выявленные в нашей работе особенности влияния трансдукции CAR-конструкции на CD4- и CD8-лимфоциты могут быть полезны при последующей разработке противоопухолевой терапии, основанной на генетически модифицированных лимфоцитах.
Материал и методы
TCR-подобная CAR-конструкция
Для трансдукции лимфоцитов человека использовали гаммаретровирусную конструкцию, кодирующую химерный антигенный рецептор, содержащий scFv-фрагмент мышиного TCR-подобного антитела, специфичного к комплексу эпитопа MAGE-A4 p230-239 (GVYDGREHTV) и молекулы HLA-A02:01, трансмембранный домен CD28, Z-цепь CD3 и внутриклеточный домен GITR. Вирусные частицы были сконструированы и наработаны на базе кафедры иммунной генной терапии Университета Миэ под руководством профессора Х. Шику.
Получение T-лимфоцитов с TCR-подобными CAR-рецепторами
МНК выделяли из периферической крови 6 условно-здоровых доноров на градиенте плотности фи-колл-урографина. 1 • 106 МНК в 2 мл среды GT-T551 (Takara Bio, Япония) с добавлением 300 ед/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) и 6 мкл/мл сыворотки группы AB высевали в лунку 12-луночного планшета, заранее покрытого 400 мкл раствора, содержащего 25 мг/мл рет-
ронектина (Takara Bio, Япония) и 5 мг/мл анти-СБЗ-антител (Biolegend, США). На 2-й и 3-й дни культивирования меняли половину среды. На 3-й день готовили планшеты для ретровирусной трансдукции. Растворы ретровирусов размораживали при 37 оС и разводили в 4 раза. 1 мл полученного раствора переносили в лунку 24-луночного планшета, заранее покрытого 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония). Далее планшет центрифугировали с ускорением 2000 g 2 ч при 32 оС.
После центрифугирования раствор ретровируса удаляли и в лунки добавляли 1,5-2 • 105 полученных лимфоцитов (преимущественно СБ3+-лимфоцитов после анти-СБ3-стимуляции). Клетки в планшетах центрифугировали при ускорении 1000 g 10 мин при 32 оС. На 4-й день трансдукцию повторяли и через 4-5 ч клетки переносили в 6-луночные планшеты в 3,5 мл культуральной среды. На 7-й день полученные клетки использовали для изучения эффективности трансдукции и фенотипа трансдуцированных клеток. На 8-й день трансдуцированные клетки использовали для постановки тестов цитотоксичности.
Оценка эффективности трансдукции и фенотипа Т-лимфоцитов с TCR-подобным CAR
Оценку эффективности трансдукции и фенотипа Т-лимфоцитов проводили методом проточной цито-метрии для 6 условно-здоровых доноров. На 7-й день из лунок, содержащих трансдуцированные клетки, забирали аликвоты по 100 мкл. Для анализа эффективности трансдукции полученные аликвоты метили MHC-тетрамерами-РЕ (предоставлены профессором Х. Шику, Высшая школа медицины Университета Мие, Япония). Также пробы метили флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам человека: анти-СБ3-АР700, анти-СБ4-Ву570, анти-СБ8-PeCy7, анти-СБ45ЯА-Ву711, анти-СБ62Ь-АР488, анти-CD95(Fas)-PerCP-Cy5.5, анти-СБ69-АР647, анти-РБ-1-Bv421, анти-Т1М3-АРС/Су7 (Biolegend, США).
Для выявления клеток с поврежденной мембраной клетки метили витальным красителем Zombie Aqua (Biolegend, США). Меченые пробы инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, затем отмывали в 2 мл PBS c NaN3 и анализировали на проточном цитометре АИиш NxT (Thermo Fisher Scientific, США). Гейтирование интересующих маркеров проводили по FMO-контролям (fluorescence-minus-one). Анализ данных проточной цитометрии проводили с использование программного обеспечения FlowJo v10.8.1 (BD Bioscience, США).
Оценка цитотоксичности Т-лимфоцитов с TCR-подобным CAR in vitro
Цитотоксичность изучали колориметрическим методом по содержанию лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью коммерческого набора CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя. Кратко: полученные после трансдукции генно-модифицированные клетки культивировали совместно с клетками-мишенями, представ-
ляющими собой клетки опухолевых линий, экспрес-сирующие или неэкспрессирующие целевой антиген. В качестве антиген-экспрессирующих (MAGE-A4+) опухолевых клеток-мишеней использовали линию ме-ланомы человека NW-Mel-38. В качестве антиген-негативного контроля - линию клеток рака толстой кишки человека HCT-116 (MAGE-A4-).
Перед проведением теста цитотоксичности осуществляли калибровку для выявления оптимального количества клеток-мишеней, клеток-эффекторов и оптимальной временной точки анализа. Далее для изучения цитотоксичности в плоскодонные 96-луночные планшеты высевали по 4 • 103 клеток соответствующих опухолевых линий. Через 17-18 ч к опухолевым клеткам добавляли по 20 • 103 клеток (соотношение эффектор : мишень = 5 : 1) из трансдуцированных или нетрансду-цированных культур. После 7-8 ч совместного культивирования из лунок забирали 50 мкл среды, которую анализировали на содержание ЛДГ. Полученную цитотоксичность CAR-трансдуцированных культур сравнивали с цитотоксичностью нетрансдуцированных культур.
Оценка экспрессии маркеров активации и цитотоксичности на лимфоцитах после культивирования с клетками-мишенями
Полученные после трансдукции лимфоциты с TCR-подобным CAR-рецептором культивировали совместно с клетками-мишенями (NW-Mel-38, SK-Mel-37 -MAGE-A4+, HCT-116 - MAGE-A4) в соотношении 10 : 1 (эффектор : мишень) в течение 4-5 ч. После этого клетки собирали и метили MHC-тетра-мерами-PE и моноклональными антителами: анти-CD3-AF700, анти-CD4-Bv570, анти-CD8-PeCy7, анти-CD69-AF647, анти-CD154(CD40L)-PerCP/Cy5.5, анти-CD178(FasL)-BV421™, анти^137(4-1ВВ)-ВУ711™ (Biolegend, США). Гейтирование маркеров интереса проводили с использованием FMO-контролей. Анализ данных проточной цитометрии выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo v10.8.1 (BD Bioscience, США).
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Далее данные анализировали подходящими статистическими методами. Использованные статистические методы указаны в подписях к рисункам.
Результаты
Эффективность трансдукции и фенотип лимфоцитов, трансдуцированных TCR-подобным CAR-рецептором
После трансдукции клеток условно-здоровых доноров анти-MAGE-A4 TCR-подобной CAR-конструкцией с помощью проточной цитометрии внутри каждого об-
<
У 400 К
CAR+ 47.1
CAR-52.2
53
а
►J
-ав.
а
с U
CAR+Live 96.6
100 101 102 103 104 105 106 Comp-RL2-A:: CD3-Alexa Fluor 700-A
10° 101 102 1 03 1 04 1 05 1 06 Comp-RL2-A:: CD3-Alexa Fluor 700-A
-103 0 Comp-
/L2-A:: Live-dead-ZA-A
> rn
D
Рч
m
o
и
0 1
PD-1+TIM3- PD-1+TIM3+
7.76 2.29
.-■у*"
PD-1+ TIM3- PD-1+TIM3+
82.2 7.80
> (9
D
с
-A::
2 >
omp-o
и
^ Temra 14.3 ' ш Tnaive 44.9 jgji.
: Tem J 14.7 Tcm 26.1
-A 7-
¿7
D
с
L
я
omp-
о
103 -1 0 -103
40
30
20
10
0 104 105 101 Comp-BL3-A:: CD95-PerCP-Cy5.5-A
-103 0 1 03 1 04 1 05 106 Comp-RL1-A:: CD69-Alexa Fluor 647-A
Рис. 1. Схема гейтирования и пример цитометрических данных при анализе фенотипа трансдуцированных и нетрансдуцирован-ных Т-лимфоцитов
800 К
4
10
и 600 К
10
200 К-
0
105 10
10
10
10
10
10
4
10
4
10
4
10
10
4
0
разца были проанализированы эффективность транс-дукции и фенотип трансдуцированных и нетрансду-цированных СБ4- и СБ8-Т-лимфоцитов по маркерам клеток памяти (СВ45ЯЛ, СБ62Ь), маркерам клеточной активации (СБ69, СБ95, РБ-1) и истощения (РБ-1, Т1М-3). Пример полученных цитометрических данных и схема гейтирования представлены на рис. 1.
Согласно цитометрическим данным, эффективность трансдукции СБ3+-лимфоцитов анти-МЛвБ-Л4 ТСЯ-подобной СЛЯ-конструкцией по реализуемому протоколу составила 40,52 ± 12,28 % (средняя и стандартное отклонение), с минимумом 22,1 % и максимумом 55,4 %.
Трансдукция значимо не влияла на жизнеспособность Т-лимфоцитов. Так, количество клеток с поврежденной мембраной среди СБ3+-лимфоцитов составляло 5,52 ± 2,2 % для трансдуцированных клеток и 3,2 ±
1,2 % для нетрансдуцированных (средняя и стандартная ошибка средней). Однако среди трансдуцированных (CAR+) CD4+-лимфоцитов обнаружено значимо большее количество терминально дифференцированных эф-фекторных клеток (Temra, CD62LCD45RA+) по сравнению с нетрансдуцированными (9,1 ± 3 % и 6,8 ± 3,1 % соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, p = 0,042; /-тест для зависимых выборок, n = 6) (рис. 2).
При этом среди трансдуцированных CD4+-X-лимфоцитов присутствовало значимо меньше центральных клеток памяти (Tcm, CD62L+CD45RA), чем среди нетрансдуцированных (CAR-; 38,02 ± 3,78 % и 45,02 ± 4,5 % соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, p = 0,018; /-тест для зависимых выборок, n = 6).
Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов отмечено значимое увеличение содержания эффекторных
CAR+
CAR-
CD4
И Temra
□ Tnaive ■ Tem
□ Tcm
CD8
H Temra
□ Tnaive ■ Tem
□ Tcm
Рис. 2. Распределение центральных клеток памяти (Tcm, CD62L+CD45RA-), эффекторных клеток памяти (Tem, CD62L-CD45RA-), терминально дифференцированных эффекторных клеток (Temra, CD62L-CD45RA+) и наивных клеток (Tnaive, CD62L+CD45RA+) среди CD4+ и CD8+ трансдуциро-ванных (CAR+) и нетрансдуцированных (CAR-) лимфоцитов (n = 6)
Указаны средние значения. Стрелками указаны статистически значимые отличия; * - p < 0,05; t-тест для зависимых выборок.
клеток памяти (Tem, CD62LCD45RA-, 11,73 ± 2,82 для CAR+ и 7,92±2,14 для CAR-, средние и стандартная ошибка среднего, n = 6, p = 0,034, t-тест для зависимых выборок) и значимое снижение содержания центральных клеток памяти (Tcm, CD62L+CD45RA-, 23,4±5,43 для CAR+ и 26,96 ± 6,24 для CAR-, средние и стандартная ошибка среднего, n = 6, p = 0,023, t-тест для зависимых выборок).
Анализ функциональных маркеров выявил, что среди трансдуцированных лимфоцитов повышено количество клеток, несущих маркеры активации и истощения. Так, среди трансдуцированных CD4+-Т-лимфоцитов обнаружено значимо большее содержание клеток, несущих маркеры активации CD69 и PD-1 и имеющих фенотип клеточного истощения PD-1+TIM3+, по сравнению с не-трансдуцированными клетками (рис. 3, верхний ряд). Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов статистически значимое повышение было отмечено только для клеток с фенотипом клеточного истощения PD-1+TIM3+ (см. рис. 3, нижний ряд).
Эффекторные свойства Т-лимфоцитов с TCR-подобным CAR
Анализ цитотоксичности культур выявил, что ци-тотоксичность культур, трансдуцированных анти-MAGE-A4 TCR-подобной CAR-конструкцией, про-
CD69+
CD95+
PD-1+TIM3-
PD-1+TIM3+
s -
D
C
100 -| 80 -60 -40 -20 -0
20 -,
15 -
10 -
5 -
3 п
2 -
1 -
CAR+ CAR-
CAR+ CAR-
CAR+ CAR-
CAR+ CAR-
10
s -
D
C
100 -, 80 -60 -40 -20 -0
6 п
4 -
2 -
2,0 -, 1,5 -1,0 -0,5 -
0,0
CAR+ CAR-
CAR+ CAR-
CAR+ CAR-
CAR+ CAR-
а
ft
ft
ft
к
ft
ft
5
4
3
2
0
0
0
8
6
4
2
0
0
Рис. 3. Относительное количество трансдуцированных (CAR+) и нетрансдуцированных (CAR-) CD4+- и CD8+-лимфоцитов, несущих функциональные маркеры CD69, CD95, PD-1, TIM-3 (n = 6)
Указаны средние и стандартные ошибки средних. Скобками указаны статистически значимые отличия. * - p < 0,05; t-тест для связанных выборок для нормально распределенных данных и тест Вилкоксона для ненормально распределенных данных.
тив МЛОБ-Л4-экспрессирующей клеточной линии (NW-MEL-38) статистически значимо превышает ци-тотоксичность трансдуцированных культур против МЛвЕ-Л4-негативной клеточной линии (HCT-116) и цитоксичность нетрансдуцированных культур против МЛвЕ-Л4-экспрессирующей линии (рис. 4).
При этом среди трансдуцированных СБ4+-лим-фоцитов было отмечено статистически значимое повышение доли клеток, несущих маркеры активации CD40L, CD69 и FasL, при сокультивировании с MAGE-Л4+-клеточными линиями (NW-MEL-38, SK-MEL-37 и SK-MEL-37, соответственно) по сравнению с культурами без клеток-мишеней (для CD40L, CD69 и FasL), клетками-мишенями, негативными по экспрессии MAGE-A4 (для CD69 и FasL), и культурами с нетранс-дуцированными клетками в качестве эффекторов (для CD40L, CD69; рис. 5, верхний ряд).
Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов, со-культивированных с MAGE-A4+-клеточной линией SK-MEL-37, отмечено статистически значимое повышение доли клеток, экспрессирующих маркеры 41BB, CD40L и CD69, по сравнению с ОТ8+-лимфоцитами, культивируемыми без клеток-мишеней, с клетками-мишенями, негативными по MAGE-A4, и с нетранс-дуцированными CD8+-лимфоцитами, сокультивиро-ванными с SK-MEL-37 (см. рис. 5, нижний ряд). При сокультивировании ОТ8+-лимфоцитов с MAGE-A4+-клеточной линией NW-MEL-38 отмечено статистически значимое повышение доли клеток, экспрессирующих CD40L, по сравнению с CD8+-лимфоцитами, культивируемыми без клеток-мишеней, с клетками-мишенями, негативными по MAGE-A4, и с нетрансдуциро-
50 -,
g 40 -
30 -
S 20 -
10 -
■
КУ-трансдукция Без трансдукции
■ МЛОБ-Л4+ (№№-Ые1-38) □ МЛОБ-Л4- (НСТ-116)
Рис. 4. Цитотоксичность трансдуцированных и нетрансдуцированных культур против МЛОЕ-Л4-экспрессирующей (^№-Ме1-38) и МЛОЕ-Л4-неэкспрессирующей (НСТ-116) клеточных линий (п = 6)
Указаны средние и стандартные ошибки средних. Скобками указаны статистически значимые отличия. * -р < 0,05; ** - р < 0,01. Двухфакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями Сидака.
ванными СБ8+-лимфоцитами, сокультивированными с М"^МЕЬ-38. Также при сокультивировании трансдуцированных СБ8+-лимфоцитов с линией NW-MEL-38 отмечено статистически значимое повышение доли СБ69-экспрессирующих клеток по сравнению с СБ8+-лимфоцитами, культивируемыми с клетками-мишенями, негативными по МЛвЕ-Л4, и с нетрансдуциро-ванными СБ8+-лимфоцитами, сокультивированными с NW-MEL-38.
S 20-
н s а
s
s
? 104
С
о
41BB+
CAR+
à
CAR-
40-, 3020100
CD40L
*
+
CAR+
CAR-
403020100
CD69+
I **
CAR+
CAR-
40-, 3020100-
FasL+
ûÛ
П
Pi
[il
CAR+
CAR-
§ 40-
ГН
s
I30"
s
? 20-
+
00 о
C
10 0
й
20 ! 15105-
0
п
i
â
50 -| 403020100
[il
Q
jfiÛ
20 ! 151050
JÜ
[il
a
CAR+ CAR- CAR+ CAR- CAR+ CAR- CAR+
□ Без мишени □ MAGE-A4+ (NW-MEL-38) ■ MAGE-A4+ (SK-MEL-37) □ MAGE-A4- (HCT-116)
CAR-
Рис. 5. Относительное количество трансдуцированных (CAR+) и нетрансдуцированных (CAR-) CD4+- и CD8+-лимфоцитов, несущих функциональные маркеры 41ВВ, CD40L, CD69, FasL после культивирования без клеток-мишеней и с клетками-мишенями, позитивными и негативными по экспрессии MAGE-A4 (n = 4-6)
Указаны средние и стандартные ошибки средних. Скобками указаны статистически значимые отличия. * - p < 0,05; ** -p < 0,01; *** -p < 0,001; **** -p < 0,0001. Двухфакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями Сидака.
а
л*
0
а
а
а
а
а
5
0
* vV
: :
:
** г*
v
Обсуждение
В данной работе представлена характеристика CD4+-и CD8+-лимфоцитов после трансдукции TCR-подобной CAR-конструкцией, антиген-распознающий домен которой специфичен к раково-эмбриональному антигену MAGE-A4, а внутриклеточный домен содержит актива-ционный мотив GITR.
В рамках работы было выявлено, что трансдукция Т-лимфоцитов предложенной CAR-конструкцией приводила к сдвигу количественного соотношения субпопуляций клеток памяти в сторону более дифференцированных [22], а также к увеличению экспрессии ряда молекул активации и истощения. Так, трансдуцирован-ные CD4+-лимфоциты отличались от нетрансдуциро-ванных значимо большим содержанием терминально дифференцированных эффекторных клеток (Temra) и значимо меньшим содержанием центральных клеток памяти (Tcm) (см. рис. 2). Трансдуцированные CD8+-лимфоциты содержали меньше Tcm, но больше эффек-торных клеток памяти (Tem).
Среди трансдуцированных CD4+-лимфоцитов отмечено значимо больше клеток, несущих маркер активации CD69, отражающий наличие CD3-стимуляции [23], что может говорить о тоническом сигналинге с ОТ3-^-домена CAR-рецептора [24] (см. рис. 3). Также для трансдуцированных CD4+-лимфоцитов отмечено значимо увеличенная доля клеток с активированным фенотипом PD-1+TIM3- [25] и фенотипом клеточного истощения PD-1+TIM3+ [26]. Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов отмечено лишь увеличенная доля клеток с фенотипом истощения PD-1+TIM3+.
Таким образом, трансдукция и тонический сигна-линг с используемой CAR-конструкции стимулировали дальнейшее продвижение некоторых лимфоцитов по пути активация-дифференцировка-истощение. При этом если клеточное истощение в результате тонического CD3-Ç-сигналинга является хорошо известным феноменом для CAR-T-клеток [24], то увеличение доли более дифференцированных Т-клеток памяти нуждается в дальнейшем изучении. Возможно, оно связано с костимуляторным GITR-сигналингом, обеспечиваемым примененной конструкцией. При этом данный эффект был более выражен для CD4+-лимфоцитов. Однако все же большая часть как трансдуцированных CD4+-, так CD8+-лимфоцитов была представлена низ-кодифференцированными субпопуляциями наивных Т-лимфоцитов (Tnaive) и центральных лимфоцитов памяти, не несла маркеров активации и истощения, что относится к факторам, увеличивающим эффективность противоопухолевой терапии [27].
Культуры, трансдуцированные TCR-подобным анти-MAGE-A4-CAR, обладали значимо большей способностью к уничтожению MAGE-A4-экспрессирующей клеточной линии по сравнению с нетрансдуцированными культурами и их способностью уничтожать MAGE-A4-негативные опухолевые клетки, что говорит об антиген-специфичной цитотоксичности полученных Т-лимфо-цитов c TCR-подобным CAR-рецептором (см. рис. 4).
При этом реализация цитотоксической функции сопровождалась повышением доли трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов, несущих активационные и эффекторные молекулы. Так, доля трансдуцирован-ных CD4+- и ОТ8+-лимфоцитов, несущих CD40L - мощный активатор Т-, B-, дендритных и неиммунных клеток [28, 29], было увеличено после сокультивирования с экспрессирующими MAGE-A4 опухолевыми линиями, но не после сокультивирования с MAGE-A4--клетками.
Данного явления не наблюдалось для нетрансдуци-рованных лимфоцитов (см. рис. 5). Также среди трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов, сокультиви-рованных с MAGE-A4+-линиями опухолевых клеток, наблюдалось увеличение доли CD69+-клеток до уровня, превышающего уровень после трансдукции (см. рис. 3, рис. 5), что может говорить о возникновении эффективного надпорогового CD3-сигналинга при активном распознавании мишеней CAR-рецептором.
При сокультивировании с MAGE-A4--клетками и использовании нетрансдуцированных клеток в качестве эффекторов данных явлений не наблюдалось. Доля трансдуцированных CD4+- и СD8+-лимфоцитов, несущих FasL, демонстрировало схожую с маркерами CD40L и CD69, но менее выраженную тенденцию. Возможно, это связано с тем, что для CAR-T-клеток, как и для обычных лимфоцитов, основным является перфорин-гранзимовый механизм цитотоксичности [30]. Костиму-ляторная молекула 4-1BB, сигналинг которой способен выводить лимфоциты из состояния истощения [24], была обнаружена на значимо большем количестве трансду-цированных CD8+-лимфоцитов, сокультивированных MAGE-A4+ линией SK-MEL-37, чем при сокультивиро-вании с MAGE-A4- клетками и использовании нетранс-дуцированных клеток в качестве эффекторов.
Таким образом, согласно полученным данным, при сокультивировании с опухолевыми клетками, несущими антиген-мишень, полученные CD4+- и CD8+-лимфоциты, несущие MAGE-A4-специфичный TCR-подобный CAR, усиливали свое активированное состояние путем увеличения доли клеток, несущих иммуностимуляторные и эффекторные молекулы. Также стоит отметить, что сигнальные домены изученных костимуляторных молекул (4-1BB, CD40L) [18-25] сейчас активно используются для разработки высокоэффективных CAR-T-клеток, и, соответственно, их экспрессия в полученных транс-дуцированных лимфоцитах может способствовать повышенной эффективности полученных CAR-T-клеток.
Заключение
В проведенном исследовании выполнена характеристика in vitro одного из перспективных вариантов CAR-Т-лимфоцитов - с TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к опухоль-ассоциированному антигену MAGE-A4 и несущим активационный мотив GITR в сигнальной части. Отмечены явления истощения лимфоцитов под действием трансдукции и передачи сигнала от внесенного CAR-рецептора, а также увеличения доли более дифференцированных Т-клеток памяти
среди трансдуцированных CD4+- и СБ8+-лимфоцитов. Однако большая часть трансдуцированных лимфоцитов была представлена низкодифференцированными субпопуляциями Т-клеток памяти и не несла маркеров активации и истощения, что относится к факторам, увеличивающим эффективность противоопухолевой терапии. Полученные лимфоциты с TCR-подобным CAR, специфичным к MAGE-A4, проявляли антиген-специ-
■ Литература
1. Lee D.W., Kochenderfer J.N., Stetler-Stevenson M., Cui Y.K., Del-brook С., Feldman S.A. et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2015; 385: 517-28. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0140-6736(14)61403-3
2. Maude S.L., Frey N., Shaw P.A., Aplenc R., Barrett D.M., Bunin N.J. et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N. Engl. J. Med. 2014; 371: 1507-17. DOI: https://doi. org/10.1056/NEJMoa1407222
3. Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Вла-сенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140064
4. Stepanov A.V., Markov O.V., Chernikov I.V., Gladkikh D.V., Zhang H., Jones T. et al. Autocrine-based selection of ligands for personalized CAR-T therapy of lymphoma. Sci. Adv. 2018; 4 (11): aau4580. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv. aau4580
5. Sanderson J.P., Crowley D.J., Wiedermann G.E., Quinn L.L., Crossland K.L., Tunbridge H.M. et al. Preclinical evaluation of an affinity-enhanced MAGE-A4-specific T-cell receptor for adoptive T-cell therapy. Oncoimmunology. 2020; 9 (1): 1682381. DOI: https://doi.org/10.1080/21 62402X.2019.1682381
6. Hiasa A., Hirayama M., Nishikawa H., Kitano S., Nukaya I., Yu S.S. et al. Long-term phenotypic, functional and genetic stability of cancer-specific T-cell receptor (TCR) aß genes transduced to CD8+ T cells. Gene Ther. 2008; 15: 695-9. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.gt.3303099
7. Bausch-Fluck D., Goldmann U., Müller S., van Oostrum M., Müller M., Schubert O.T. et al. The in silico human surfaceome. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018; 115 (46): E10 988-97. DOI: https://doi. org/10.1073/pnas.1808790115
8. Fagerberg L., Jonasson K., von Heijne G., Uhlen M., Berglund L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 2010; 10: 11419. DOI: https://doi.org/10.1002/pmic.200900258
9. Kulemzin S.V., Gorchakov A.A., Taranin A.V. Prostate cancer surface targets for CAR T cell therapy or metastatic prostate cancer in the CAR T cell era: My kingdom for the target! Cell. Ther. Transplant. 2019; 8:19-28. DOI: https://doi.org/10.18620/ctt-1866-8836-2019-8-4-19-28
10. Zhang H., Li F., Cao J., Wang X., Cheng H., Qi K. et al. A chi-meric antigen receptor with antigen-independent OX40 signaling mediates potent antitumor activity. Sci. Transl. Med. 2021; 13 (578): eaba7308. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aba7308
11. Golubovskaya V.M. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Front. Biosci. 2018; 23: 4703. DOI: https://doi.org/10.2741/4703
12. Tang X., Tang Q., Mao Y., Huang X., Jia L., Zhu J. et al. CD137 Co-stimulation improves the antitumor effect Of LMP1-specific chimeric antigen receptor T cells in vitro and in vivo. Oncotargets Ther. 2019; 12: 9341-50. DOI: https://doi.org/10.2147/OTT.S221040
13. Shafer P., Kelly L.M., Hoyos V. Cancer therapy with TCR-engi-neered T cells: current strategies, challenges, and prospects. Front. Immunol. 2022; 13: 835752. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.835762
14. Chodon T., Comin-Anduix B., Chmielowski B., Koya R.C., Wu Z., Auerbach M. et al. Adoptive transfer of MART-1 T-cell receptor transgenic lymphocytes and dendritic cell vaccination in patients with met-astatic melanoma. Clin. Cancer Res. 2014; 20: 2457-65. DOI: https://doi. org/10.1158/1078-0432.CCR-13-3017
15. Akahori Y., Wang L., Yoneyama M., Seo N., Okumura S., Mi-yahara Y. et al. Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracel-
фичную цитотоксичность, сопровождающуюся увеличением доли клеток, несущих иммуностимуляторные молекулы, что может способствовать повышенной эффективности используемых клеток. Таким образом, полученные МЛОБ-Л4-специфичные TCR-подобные CAR-Т-клетки могут быть рекомендованы к дальнейшему изучению их свойств и эффективности в условиях in vitro и in vivo.
lular oncoprotein WT1 can be enhanced by vaccination. Blood. 2018; 132: 1134-45. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2017-08-802926
16. Dragon A.C., Zimmermann K., Nerreter T., Sandfort D., Lahrberg J., Klöß S. et al. CAR-T cells and TRUCKs that recognize an EBNA-3C-derived epitope presented on HLA-B*35 control Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferation. J. Immunother. Cancer. 2020; 8: e000736. DOI: https://doi.org/10.1136/jitc-2020-000736
17. Терещенко В.П., Сенников С.В. Опухолевые ксенотранс-плантаты как модель для доклинических испытаний генетически модифицированных клеточных препаратов. Иммунология. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741
18. Zajac P., Schultz-Thater E., Tornillo L., Sadowski C., Trella E., Mengus C. et al. MAGE-A antigens and cancer immunotherapy. Front. Med. 2017; 4: 18. DOI: https://doi.org/10.3389/fmed.2017.00018
19. Kageyama S., Ikeda H., Miyahara Y., Imai N., Ishihara M., Saito K. et al. Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophageal cancer. Clin. Cancer Res. 2015; 21: 2268-77. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432. CCR-14-1559
20. He Y., Vlaming M., van Meerten T., Bremer E. The implementation of TNFRSF co-stimulatory domains in CAR-T cells for optimal functional activity. Cancers (Basel). 2022; 14: 299. DOI: https://doi.org/10.3390/ cancers14020299
21. Hauer J., Püschner S., Ramakrishnan P., Simon U., Bongers M., Federle C. et al. TNF receptor (TNFR)-associated factor (TRAF) 3 serves as an inhibitor of TRAF2/5-mediated activation of the noncanonical NF-kB pathway by TRAF-binding TNFRs. Proc. Natl Acad. Sci. 2005; 102: 2874-9. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0500187102
22. Brummelman J., Pilipow K., Lugli E. The single-cell phenotypic identity of human CD8+ and CD4+ T cells. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2018; 341: 63-124. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2018.05.007
23. Testi R., Phillips J.H., Lanier L.L. T cell activation via Leu-23 (CD69). J. Immunol. 1989; 143: 1123.
24. Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M. et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 2015; 21: 581-90. DOI: https://doi.org/10.1038/nm.3838
25. Hui E., Cheung J., Zhu J., Su X., Taylor M.J., Wallweber H.A. et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 2017; 355: 1428-33. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aaf1292
26. Yang R., Sun L., Li C.-F., Wang Y.-H., Yao J., Li H. et al. Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy. Nat. Commun. 2021; 12: 832. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-21099-2
27. Golubovskaya V., Wu L. Different subsets of T cells, memory, effector functions, and CAR-T immunotherapy. Cancers (Basel). 2016; 8: 36. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers8030036
28. Loskog A., Totterman T. CD40L - a multipotent molecule for tumor therapy. Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets. 2007; 7: 23-8. DOI: https://doi.org/10.2174/187153007780059432
29. Karnell J.L., Rieder S.A., Ettinger R., Kolbeck R. Targeting the CD40-CD40L pathway in autoimmune diseases: humoral immunity and beyond. Adv. Drug Deliv. Rev. 2019; 141: 92-103. DOI: https://doi. org/10.1016/j.addr.2018.12.005
30. Mamonkin M., Rouce R.H., Tashiro H., Brenner M.K. A T-cell-directed chimeric antigen receptor for the selective treatment of T-cell malignancies. Blood. 2015; 126: 983-92. DOI: https://doi.org/10.1182/ blood-2015-02-629527
■ References
1. Lee D.W., Kochenderfer J.N., Stetler-Stevenson M., Cui Y.K., Del-brook C., Feldman S.A., et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2015; 385: 517-28. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0140-6736(14)61403-3
2. Maude S.L., Frey N., Shaw P.A., Aplenc R., Barrett D.M., Bunin N.J., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N. Engl. J. Med. 2014; 371: 1507-17. DOI: https://doi. org/10.1056/NEJMoa1407222
3. Kiselevsky M.V., Chikileva I.O., Sitdikova S.M., Vlasenko R.Ya., Karaulov A.V. Prospectives of application of the genetically modified lymphocytes with chimeric T-cell receptor (CAR-T-cells) for the therapy of solid tumors. Immunologiya. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-140064 (in Russian)
4. Stepanov A.V., Markov O.V., Chernikov I.V., Gladkikh D.V., Zhang H., Jones T., et al. Autocrine-based selection of ligands for personalized CAR-T therapy of lymphoma. Sci. Adv. 2018; 4 (11): aau4580. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv. aau4580
5. Sanderson J.P., Crowley D.J., Wiedermann G.E., Quinn L.L., Crossland K.L., Tunbridge H.M., et al. Preclinical evaluation of an affinity-enhanced MAGE-A4-specific T-cell receptor for adoptive T-cell therapy. Oncoimmunology. 2020; 9 (1): 1682381. DOI: https://doi.org/10.1080/21 62402X.2019.1682381
6. Hiasa A., Hirayama M., Nishikawa H., Kitano S., Nukaya I., Yu S.S., et al. Long-term phenotypic, functional and genetic stability of cancer-specific T-cell receptor (TCR) aß genes transduced to CD8+ T cells. Gene Ther. 2008; 15: 695-9. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.gt.3303099
7. Bausch-Fluck D., Goldmann U., Müller S., van Oostrum M., Müller M., Schubert O.T., et al. The in silico human surfaceome. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018; 115 (46): E10 988-97. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1808790115
8. Fagerberg L., Jonasson K., von Heijne G., Uhlen M., Berglund L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 2010; 10: 11419. DOI: https://doi.org/10.1002/pmic.200900258
9. Kulemzin S.V., Gorchakov A.A., Taranin A.V. Prostate cancer surface targets for CAR T cell therapy or metastatic prostate cancer in the CAR T cell era: My kingdom for the target! Cell. Ther. Transplant. 2019; 8: 19-28. DOI: https://doi.org/10.18620/ctt-1866-8836-2019-8-4-19-28
10. Zhang H., Li F., Cao J., Wang X., Cheng H., Qi K., et al. A chi-meric antigen receptor with antigen-independent OX40 signaling mediates potent antitumor activity. Sci. Transl. Med. 2021; 13 (578): eaba7308. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aba7308
11. Golubovskaya V.M. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Front. Biosci. 2018; 23: 4703. DOI: https://doi.org/10.2741/4703
12. Tang X., Tang Q., Mao Y., Huang X., Jia L., Zhu J., et al. CD137 Co-stimulation improves the antitumor effect of LMP1-specific chimeric antigen receptor T cells in vitro and in vivo. Oncotargets Ther. 2019; 12: 9341-50. DOI: https://doi.org/10.2147/OTT.S221040
13. Shafer P., Kelly L.M., Hoyos V. Cancer therapy with TCR-engi-neered T cells: current strategies, challenges, and prospects. Front. Immunol. 2022; 13: 835752. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.835762
14. Chodon T., Comin-Anduix B., Chmielowski B., Koya R.C., Wu Z., Auerbach M., et al. Adoptive transfer of MART-1 T-cell receptor transgenic lymphocytes and dendritic cell vaccination in patients with metastatic melanoma. Clin. Cancer Res. 2014; 20: 2457-65. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-3017
15. Akahori Y., Wang L., Yoneyama M., Seo N., Okumura S., Miyahara Y., et al. Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracellular oncopro-
Сведения об авторах
Терещенко Валерий Павлович - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск; специалист ресурсного центра клеточных технологий и иммунологии, АНО ВО университет «Сириус», пгт Сириус, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
tein WT1 can be enhanced by vaccination. Blood. 2018; 132: 1134-45. DOI: https://doi.oig/10.1182/blood-2017-08-802926
16. Dragon A.C., Zimmermann K., Nerreter T., Sandfort D., Lahrberg J., Klöß S., et al. CAR-T cells and TRUCKs that recognize an EBNA-3C-de-rived epitope presented on HLA-B*35 control Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferation. J. Immunother. Cancer. 2020; 8: e000736. DOI: https://doi.org/10.1136/jitc-2020-000736
17. Tereshchenko V.P., Sennikov S.V. Tumor xenografts as the model for a preclinical trials of genetically modified cell therapy. Immunologiya. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741 (in Russian)
18. Zajac P., Schultz-Thater E., Tornillo L., Sadowski C., Trella E., Mengus C., et al. MAGE-A antigens and cancer immunotherapy. Front. Med. 2017; 4: 18. DOI: https://doi.org/10.3389/fmed.2017.00018
19. Kageyama S., Ikeda H., Miyahara Y., Imai N., Ishihara M., Saito K., et al. Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophageal cancer. Clin. Cancer Res. 2015; 21: 2268-77. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-14-1559
20. He Y., Vlaming M., van Meerten T., Bremer E. The implementation of TNFRSF co-stimulatory domains in CAR-T cells for optimal functional activity. Cancers (Basel). 2022; 14: 299. DOI: https://doi. org/10.3390/cancers14020299
21. Hauer J., Püschner S., Ramakrishnan P., Simon U., Bongers M., Federle C., et al. TNF receptor (TNFR)-associated factor (TRAF) 3 serves as an inhibitor of TRAF2/5-mediated activation of the noncanonical NF-kB pathway by TRAF-binding TNFRs. Proc. Natl Acad. Sci. 2005; 102: 2874-9. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0500187102
22. Brummelman J., Pilipow K., Lugli E. The single-cell phenotypic identity of human CD8+ and CD4+ T cells. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2018; 341: 63-124. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2018.05.007
23. Testi R., Phillips J.H., Lanier L.L. T cell activation via Leu-23 (CD69). J. Immunol. 1989; 143: 1123.
24. Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M., et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 2015; 21: 581-90. DOI: https://doi.org/10.1038/nm.3838
25. Hui E., Cheung J., Zhu J., Su X., Taylor M.J., Wallweber H.A., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 2017; 355: 1428-33. DOI: https://doi. org/10.1126/science.aaf1292
26. Yang R., Sun L., Li C.-F., Wang Y.-H., Yao J., Li H., et al. Galec-tin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy. Nat. Commun. 2021; 12: 832. DOI: https://doi. org/10.1038/s41467-021-21099-2
27. Golubovskaya V., Wu L. Different subsets of T cells, memory, effector functions, and CAR-T immunotherapy. Cancers (Basel). 2016; 8: 36. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers8030036
28. Loskog A., Totterman T. CD40L - a multipotent molecule for tumor therapy. Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets. 2007; 7: 23-8. DOI: https://doi.org/10.2174/187153007780059432
29. Karnell J.L., Rieder S.A., Ettinger R., Kolbeck R. Targeting the CD40-CD40L pathway in autoimmune diseases: humoral immunity and beyond. Adv. Drug Deliv. Rev. 2019; 141: 92-103. DOI: https://doi. org/10.1016/j.addr.2018.12.005
30. Mamonkin M., Rouce R.H., Tashiro H., Brenner M.K. A T-cell-directed chimeric antigen receptor for the selective treatment of T-cell malignancies. Blood. 2015; 126: 983-92. DOI: https://doi.org/10.1182/ blood-2015-02-629527
Authors' information
Valeriy P. Tereshchenko - PhD, Senior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation, Specialist of the Resource Center for Cellular Technologies and Immunology, Sirius University of Science and Technology, Sirius, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-1620-6447
Кузнецова Мария Сергеевна - канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник лаб. клеточных технологий иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Шевченко Юлия Александровна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Фишер Марина Сергеевна - аспирант мл. науч. сотр. лаб. клеточных технологий иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Курилин Василий Васильевич - канд. мед. наук, вед. науч. сотрудник лаб. клеточных технологий иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Алсаллум Алаа - лаборант-исследователь лаб. клеточных технологий иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация
E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Акахори Ясуши - PhD, доцент каф. иммунной генной терапии, Университет Миэ, Цу, Япония E-mail: [email protected]
Шику Хироши - MD, PhD, зав. лаб. клеточных технологий иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобр-науки России, Новосибирск, Российская Федерация; проф. каф. иммунной генной терапии, Университет Миэ, Цу, Япония E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Сенников Сергей Витальевич - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. молекулярной иммунологии, гл. науч. сотр. лаб. клеточных технологий и иммунотерапии, ФГБНУ НИИФКИ Минобрнауки России, Новосибирск, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
Maria S. Kuznetsova - PhD, Senior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-9834-9328
Julia A. Shevchenko - PhD, Leading Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-8773-0599
Marina S. Fisher - Junior Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0001-6261-7557
Vasiliy V. Kurilin - PhD, Leader Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-5617-0450
Alaa Alsalloum - Research Assistant of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab. RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-4395-5822
Yasushi Akahori - PhD, Assistant Prof. of Immuno-gene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: [email protected]
Hiroshi Shiku - MD, PhD, Head of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation; Prof. of Immuno-gene Therapy Dept., Mie University, Tsu, Japan E-mail: [email protected] http://orcid.org/0000-0002-0362-755X
Sergey V. Sennikov - MD, PhD, Professor, Head of Molecular Immunology Lab., Chief Researcher of the Cellular Technologies of Immunotherapy Lab., RIFCI of the MSHE of Russia, Novosibirsk, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-7366-7768
