CC BY
55
УДК 619:611.018.5:636.52/58 Е.Г. Турицына
КИНЕТИКА МОРФОБИОХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ КРОВИ КУР ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ
ПРЕПАРАТА “ПРОВЕСТ”
Изучена кинетика морфобиохимических параметров крови кур под воздействием индуктора эндогенного интерферона - препарата “Провест”. Выявлено положительное влияние препарата “Провест” на гемопоэз, уровень гемоглобина и синтез гамма-глобулинов крови.
Ключевые слова: индуктор эндогенного интерферона, «Провест», куры, кровь.
Ye.G. Turitsyna
KINETICS OF THE MORPHOBIOCHEMICAL HEN BLOOD PARAMETERS UNDER THE “PROVEST” PREPARATION INFLUENCE
Kinetics of the morphobiochemical hen blood parameters under the influence of the “Provest” preparation which is endogen interferon inductor is studied. Positive “Provest” preparation effect on haemopoesis, hemoglobin level and blood gamma-globulin synthesis is revealed.
Key words: endogen interferon inductor, «Provest», hens, blood.
В промышленном птицеводстве постоянно ведется активный поиск оптимальных иммуномодулирующих препаратов, способных повысить естественную резистентность птиц, корректировать состояние иммунной системы и позволить максимально эффективно реализовать напряженные программы вакцинаций, являющихся неотъемлемой частью комплексных ветеринарно-санитарных мероприятий, обеспечивающих эпизоотическое благополучие птицеводческих предприятий.
Внимание исследователей в последние годы все больше привлекают иммунокоррегирующие препараты, сконструированные на основе двуспиральных и однонитевых нуклеиновых кислот (дсРНК и онРНК) и оказывающие на иммунную систему поликлональное стимулирующее действие [4-5]. Изучение терапевтических эффектов нуклеиновых кислот на состояние больных с различными формами патологий, а также на лабораторных и сельскохозяйственных животных, показало, что их главным фармакологическим свойством является стимуляция процессов регенерации и репарации, функциональной активности практически всех клеток иммунной системы [3; 6]. Препараты этой группы усиливают устойчивость к заражению патогенными микроорганизмами и угнетают активность внутриклеточных микроорганизмов, таких, как хламидии, микоплазмы, микобактерии [1], активируют синтез фактора некроза опухолей, интерферонов, интерлейкина-1, стимулируют поглотительную функцию макрофагов, обладают антипролиферативным действием, стимулируют Т- и В-клеточный иммунитет [4-5]. Было установлено, что многопрофильное действие препаратов дсРНК на механизмы неспецифической резистентности, сформированные в ходе эволюции, осуществляется через систему Toll-like рецепторов клеток, преимущественно TRL3 [9]. Универсальный механизм действия этих препаратов объясняет факты их испытания в онкологии, при патологии иммунной системы, в частности, при аутоиммунных заболеваниях, для повышения эффективности вакцинации. Несмотря на высокий интерес исследователей к препаратам на основе нуклеиновых кислот, сведений об их влиянии на организм сельскохозяйственных птиц в доступной научной литературе крайне мало [2; 7].
Целью настоящих исследований явилось изучение кинетики морфобиохимических показателей крови кур под воздействием препарата «Провест».
Материалы и методы исследований. Научно-производственные исследования провеста были проведены на птицефабрике «Заря» Красноярского края и на кафедре анатомии и гистологии животных института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины Красноярского государственного аграрного университета. В одном из производственных цехов птицефабрики были сформированы три группы суточных цыплят кросса «Родонит-2»: одна контрольная и две опытные (табл.).
Препарат «Провест» был разработан в ООО «Диафарм» совместно с ИМБТ ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (г. Бердск, Новосибирская область). Он является индуктором эндогенного интерферона и представляет собой комплекс натриевых солей однонитевых и двуспиральных рибонуклеиновых кислот, полученных из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae с добавлением поливинилпирролидона, обеспечивающего пролонгированное действие данного препарата.
Схема научно-производственного опыта по испытанию препарата «Провест» на птицефабрике «Заря» Красноярского края
Группа Кол-во голов Доза препарата Объем раствора Способ введения
1-я опытная 1392 10 мкг/ гол. с вакциной 0,2 мл Внутримышечно
2-я опытная 1496 20 мкг/гол. с вакциной 0,2 мл Внутримышечно
3-я контрольная 1869 Вакцина без препарата 0,2 мл Внутримышечно
В соответствии с рекомендациями, полученными из ООО «Диафарм», «Провест» перед введением растворяли в разбавителе для сухих вирусвакцин против болезни Марека. Препарат вводили внутримышечно в область бедра полуавтоматическим инъектором ИП-1 одновременно с вакциной в дозе 0,2 мл. Обработка цыплят произведена в условиях инкубатория перед посадкой в цех выращивания. Контролем служили вакцинированные цыплята того же возраста, не обработанные препаратом.
Экспериментальная птица содержалась в клеточных батареях БКМ и подвергалась плановым технологическим обработкам - сортировке по массе, дебикации, антигенным стимуляциям в соответствии с утвержденной на птицефабрике программой специфической профилактики инфекционных болезней.
Материалом для морфобиохимических исследований являлась цельная кровь, стабилизированная гепарином, и сыворотка крови 1-, 7-, 14- 21-, 30-, 45-суточных цыплят. Во всех возрастных периодах исследовали кровь трех-пяти цыплят из каждой экспериментальной группы. Кровь у 1- и 7-суточной птицы отбирали из наружной ярёмной вены, а у молодняка старшего возраста из подкожной локтевой (крыловой) вены. Исследования крови включали определение общего содержания эритроцитов и лейкоцитов, лейкоцитарного профиля, концентрации гемоглобина, общего белка в сыворотке крови и белковых фракций.
Содержание форменных элементов (эритроцитов и лейкоцитов) подсчитывали в счетных камерах Горяева после предварительного разведения образцов цельной крови в пробирках с 3%-м раствором генциан-виолета, приготовленного на 0,85%-м растворе натрия хлорида. Лейкоцитарный профиль крови изучали на мазках, окрашенных комбинированным методом по Паппенгейму, включающим фиксацию мазков красителем Май-Грюнвальда с последующим докрашиванием по Романовскому-Гимза. Гемоглобин исследовали гемоглобинцианидным методом Драбкина в модификации на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ4.2 при зеленом светофильтре и длине волны 540 нм. Общий белок в сыворотке крови определяли биуретовой реакцией, уровень белковых фракций - нефелометрическим методом на фотоколориметре при красном светофильтре и длине волны 670 нм. Достоверность обнаруженных межгрупповых различий оценивали с использованием ^критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при уровне значимости Р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение. Исследование общего содержания форменных элементов крови показало низкий уровень эритроцитов и лейкоцитов у суточных цыплят всех экспериментальных групп. Содержание эритроцитов составило 1,80±0,02х1012/л, что почти в 1,5 раза меньше нормативных показателей взрослых кур. За первые три недели наблюдений общее содержание эритроцитов у контрольной птицы увеличилось на 21,7% относительно исходных показателей и составило 2,19±0,14х 1012/л (Р<0,05). В течение всего периода исследований в крови цыплят регистрировали до 10% молодых форм эритроцитов, характеризующихся крупными размерами и слабобазофильной цитоплазмой. Наличие незрелых эритроцитов характерно для крови птиц первых двух месяцев жизни и отражает интенсивный процесс гемопоэза в период раннего постнатального онтогенеза.
Введение «Провеста» обусловило рост количества эритроцитов в крови опытной птицы относительно контроля. Этот эффект наиболее ярко проявлялся в конце второй недели жизни. Максимальная разница с контрольной группой в этот период достигла 34,05% при дозе 20 мкг/гол. и 29,37% - при дозе 10 мкг/гол. (рис. 1). У трехнедельных цыплят 1-й опытной группы общее содержание эритроцитов составило 2,43±0,06х1012/л, что на 10,96% превысило данные контрольной группы (Р<0,05). В конце второго месяца наблюдений достоверных отличий в уровне эритроцитов между контрольной и опытными группами не установлено.
Общее содержание лейкоцитов в крови суточных цыплят было в два раза ниже нормативных показателей взрослых кур и составило 11,93±0,64х109/л. Среди лейкоцитов преобладали псевдоэозинофильные гранулоциты, относительное содержание которых достигло 58,86+3,52%. Около 12-14% гранулоцитов представляли собой незрелые формы клеток. Метамиелоциты (юные гранулоциты) характеризовались крупными размерами до 14-16 мкм, ядрами округлой или слегка бобовидной формы с мелкоглыбчатым неравномерно
распределенным хроматином, обширной светлой оксифильной или слабобазофильной цитоплазмой с плохо дифференцированной мелкой зернистостью от фиолетового до красного цвета.
Рис. 1. Содержание эритроцитов в крови экспериментальной птицы, 1012/л (* Р<0,05 по сравнению с контролем)
К концу первой недели жизни общее содержание лейкоцитов у цыплят 1-й опытной группы превысило контрольные показатели на 6,5%, во 2-й опытной группе - на 16,7% (рис. 2). У двухнедельной опытной птицы разница с контролем достигала 32,5% в 1-й группе и 38,1% - во 2-й группе (Р<0,05).
У трехнедельных цыплят опытных групп этот показатель превысил контрольные значения на 9,8% во 2-й группе и на 16,8% - в 1-й группе (Р<0,05). В месячном возрасте сохранялась тенденция к повышению уровня лейкоцитов в крови птицы, обработанной «Провестом». Так, во 2-й группе количество лейкоцитов превысило контрольные показатели на 10,2%, а в 1-й группе - на 3,4%. К концу наблюдений разница с контролем по данному параметру в 1-й группе сохранилась на уровне 3,5%, а показатели 2-й опытной группы отстали от контроля на 2,8% и составили 21,67±2,72х 109/л.
Рис. 2. Содержание лейкоцитов в крови птицы, обработанной препаратом «Провест», 109/л
(* Р<0,05 по сравнению с контролем)
Исследование лейкоцитарного профиля крови показало значительный рост как относительного, так и абсолютного содержания лимфоцитов в крови экспериментальной птицы в течение всего периода наблюдений. Ранее нами было установлено, что развитие лимфоцитоза закономерно связано с многократными антигенными стимуляциями молодняка кур вирусвакцинами при реализации плановых схем специфической профилактики [8].
Введение препарата «Провест» усиливало лимфоцитоз у цыплят опытных групп по сравнению с контролем. Этот эффект был ярко выражен в первые две недели эксперимента. У 7-суточных цыплят, обработанных препаратом в дозе 20 мкг/гол., относительное содержание лимфоцитов на 13,2% превысило показатели контрольной группы и составило 65,2±2,22% (Р<0,05). «Провест» в дозе 10 мкг/гол. стимулировал лимфоцитоз у 14-суточных опытных цыплят, разница в содержании лимфоцитов с контрольной группой составила более 9% (Р<0,05). Достоверных отличий в лейкограмме в другие периоды исследований не установлено, хотя тенденция к повышению содержанию лимфоцитов у молодняка кур, обработанного этим препаратом, сохранялась в течение всего периода наблюдений.
Содержание гемоглобина у суточных цыплят экспериментальных групп находилось в пределах физиологической нормы и составило 85,94+2,29 г/л. Введение «Провеста» сопровождалось повышением этого параметра относительно контроля только у 7-суточной птицы. Уровень гемоглобина к концу первой недели исследований повысился на 21,37% при дозе препарата 20 мкг/гол. (Р<0,01) и на 12,03% - при дозе 10 мкг/гол. (Р<0,05). В дальнейшем статистически значимых межгрупповых отличий не установлено.
За период наблюдений содержание общего белка в сыворотке крови экспериментальной птицы достоверно увеличилось во всех группах с 23,34±1,02 г/л у суточных цыплят до 34,88±1,29 г/л в 1-й группе, 37,98±0,95 - во 2-й группе, 33,33±1,74 г/л - в 3-й контрольной группе (Р<0,01), что характерно для периода постэмбрионального развития [8]. Обработка птицы «Провестом» в дозе 10 мкг/гол. обусловила незначительное увеличение общего белка в сыворотке крови у семидневной птицы на 1,81% относительно контроля, а при дозе 20 мкг/гол. - на 4,51%.
У 2- и 3-недельных опытных цыплят количество общего белка сыворотки крови сократилось, разница с контрольной группой составляла от 2 до 16%, но вследствие значительных внутригрупповых колебаний показатели не были статистически значимыми (рис. 3). В конце первого месяца жизни этот биохимический параметр крови вновь увеличился, разница с контролем в 1-й группе составила 21,75% (Р<0,05), во 2-й группе - 8,69%. В конце наблюдений уровень общего белка у 45-суточной птицы в опытных группах превысил показатели контроля на 4,65% в 1-й группе и на 13,95% - во 2-й группе (Р<0,05).
Рис. 3. Содержание общего белка в сыворотке крови цыплят экспериментальных групп, г/л
(* Р<0,05 по сравнению с контролем)
Исследования белковых фракций сыворотки крови, включающие определение альбуминов, а-, р- и Y-глобулинов, показали значительные изменения их соотношения у экспериментальной птицы в течение всего периода наблюдений. У только что вылупившихся цыплят в сыворотке крови преобладали альбумины, их относительное содержание в среднем составило 63,73±1,05%, абсолютное - 15,29±1,02 г/л. Уровень глобулинов колебался от 35 до 39%, что в абсолютных величинах составило 8,66±0,41 г/л. Фракция а-глобулинов занимала 13,77±2,36% (3,26±0,46 г/л), р-глобулинов - 12,36±1,66% (2,99±0,47 г/л), Y-глобулинов - 10,16±0,87% (2,42±0,22 г/л).
С возрастом содержание альбуминов в сыворотке крови всех экспериментальных цыплят сократилось, а уровень глобулиновых фракций повысился. При этом соотношение белковых фракций крови у контрольной и обработанной «Провестом» птицы имело значительные отличия. В течение первых трех недель количество альбуминов у контрольной птицы было выше, чем у опытных цыплят, а уровень глобулиновых фракций преобладал у птицы, обработанной препаратом. На 21-е сутки у цыплят 1-й опытной группы абсолютное количество альбуминов сократилось на 14,4% по сравнению с контролем и составило 11,23±0,28 г/л (Р<0,05), их относительное содержание уменьшилось до 49,50±3,94%, что ниже показателей контрольной птицы на 8,13%. Во 2-й опытной группе при дозе «Провеста» 20 мкг/гол. абсолютное количество альбуминов сократилось по сравнению с контролем на 9,38%, относительное - на 9,15%.
Содержание глобулиновых фракций белка в сыворотке крови трехнедельных цыплят 1-й группы составило 56,5%, во 2-й группе - 57,04%, что превысило контрольные показатели на 19,7 и 20,8% соответственно. Соотношение глобулиновых фракций трехнедельных цыплят представлено на рис. 4. Количество а-глобулинов в сыворотке крови у птицы 1-й и 2-й опытных групп было ниже контрольных показателей на 33,51 и 47,46% соответственно (Р<0,01). Уровень р-глобулинов у птицы, обработанной «Провестом», почти в два раза превышал показатели контрольных цыплят (Р<0,05).
О
=
>-
'О
о
с.
:с
о.
-е-
о
е
а-глобулины 3-глобулины у-глобулины
Рис. 4. Соотношение глобулиновых фракций белка сыворотки крови 21-суточной птицы, г/л
(* Р<0,05 по сравнению с контролем)
Содержание Y-глобулинов к трехнедельному возрасту увеличилось у всех экспериментальных цыплят, что связано с интенсивной иммунизацией птицы. У цыплят, обработанных препаратом «Провест» в дозе 20 мкг/гол., абсолютное количество Y-глобулинов превысило контрольные показатели на 29,71% и составило 8,34±0,46 г/л (Р<0,05). Относительное содержание Y-глобулинов в сыворотке крови на 54,22% опередило данные контрольной птицы (Р<0,01).
К концу первого месяца жизни относительный уровень глобулиновых фракций белка в сыворотке крови у цыплят, обработанных препаратом «Провест» в дозе 10 мкг/гол., практически не отличался от контрольных показателей, в то время как препарат в дозе 20 мкг/гол стимулировал синтез глобулинов, уровень которых на 21,42% превысил показатели контрольной птицы (Р<0,01).
Выводы
1. Однократное введение препарата «Провест» молодняку кур в дозе 10 и 20 мкг/гол. умеренно стимулирует гемопоэз, сопровождается увеличением общего содержания эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитозом.
2. Препарат «Провест» влияет на биохимические параметры крови кур, что проявляется кратковременным увеличением уровня гемоглобина, колебанием уровня общего белка сыворотки крови, сокращением альбуминов и накоплением глобулиновых белковых фракций преимущественно за счет гамма-глобулинов.
Литература
1. Аликин Ю.С. Стимуляторы неспецифической резистентности на основе РНК для ветеринарной медицины: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Новосибирск, 1998. - 44 с.
2. Методология применения иммуномодуляторов в промышленном птицеводстве / Ю.С. Аликин [и др.] //
БИО. - 2004. - № 4(43). - С. 2-4.
3. Влияние разных форм природных РНК на иммунный ответ / Ю.С. Аликин [и др.] // Достижения современной биотехнологии: сб. науч. тр. - Новосибирск, 2008. - C. 92-103.
4. Григорян С.С. Индукторы интерферона: итоги и перспективы // Интерферону - 50 лет: мат-лы науч.-
практ. конф. - М., 2007. - С. 66-72.
5. Ершов Ф.И. Пять десятилетий интерферона // Интерферону - 50 лет: мат-лы науч.-практ. конф. - М.,
2007. - С. 11-18.
6. Исследование биологических свойств индуктора интерферона пролонгированного действия на основе дсРНК / В.И. Масычева [и др.] // Достижения современной биотехнологии: сб. науч. тр. - Новосибирск,
2008. - С. 77-85.
7. Иммуномодулирующее действие РНК на организм птиц / Н.В. Мельникова, В.М. Колышкин, И.В. Ма-нюхин [и др.] // Мат-лы 1-го Междунар. вет. конгр. по птицеводству. - М., 2005. - С. 129-131.
8. Турицына Е.Г. Влияние иммунизации на морфологию крови и морфометрические показатели лимфоцитов цыплят // Вузовская наука - сельскому хозяйству: сб. ст. междунар. науч.-практ. конф. - Барнаул: Изд-во АГАУ, 2005. - Кн. 2. - С. 130-132.
9. Toll-like receptor 3: a link between toll-like receptor, interferon and viruses / M. Matsumoto, K. Funami,
H. Oshiumi [at el] // Microbiol. Immunol. - 2004. - Vol. 48. - № 3. - Р. 147-154.
