CC BY
32
Табл. 4. Ил. 2. Библ. 15.
УДК 577.151/157:582.282.23
КИНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ЖИВОТНОГО БЕЛКА
Иванкин А.Н.1, доктор хим. наук, Вострикова Н.Л.1, канд. техн. наук, Куликовский А.В.1, канд. техн. наук,
Олиференко Г.Л.2, канд. хим. наук, Полещук О.М.2, доктор техн. наук, Агеев А.К.2, Зенкин А.Н. 2
1 ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»;
2 НИУ «МГТУ им. Н.Э. Баумана»
KINETICS OF ENZYMATIC DEGRADATION OF ANIMAL PROTEIN
Ivankin A.N. 1, Vostrikova N.L. 1, Kulikovskii A.V. 1, Oliferenko G.L. 2, Poleshchuk O.M. 2, Ageev A.K. 2, Zenkin A.N. 2
1 The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
2 Bauman Moscow State Technical University
Ключевые слова:
мясное сырье, аминокислотный состав, белки, колла-геназа, кинетика ферментативной деградации животного белка
Реферат
Изучен процесс энзиматической деградации белков мышечной ткани протеолитическим комплексом колла-геназы. Определены кинетические константы и значения энергии активации высвобождения аминокислот из белковых фракций. Для описания кинетических закономерностей протекания ферментативного гидролиза была использована модель, предусматривающая наличие «быстрой» и «медленной» стадий процесса, согласно которой, реакционную систему можно рассматривать как сумму независимо реагирующих субстратов, скорость распада каждого из которых определяется его концентрацией и кинетическими характеристиками. Показано, что максимальная степень конверсии в процессе получения свободных аминокислот, достигается при определенном соотношении максимальных скоростей гидролиза на «быстрой» и «медленной» стадиях, а именно при 40 °С Vmax на «медленной» стадии, что составляло около 50 % от V на «быстрой»
max г
стадии. При 45 °С эта величина равна 40 %, а при 50 °С менее 25 %. В исследованном интервале температур можно принять, что максимальный выход достигается при соотношении скоростей на «медленной» и «быстрой» стадиях менее 0,2. Сравнение формальных макрокинетических констант процесса позволяет оценить условия ферментативной деградации мышечных белков животного происхождения. При получении ферментированных продуктов вплоть до продуктов высокой степени переработки проте-олитическим ферментом при температуре 40-55 °С с фермент-субстратным соотношением 1:10, возможно получение белкового продукта содержащего 25-30 % свободных аминокислот в сухом гидролизате с глубиной деградации белка 35-40 %.
Keywords:
raw meat, amino acid composition, proteins, collagenase, kinetics of enzymatic degradation of animal protein
Summary
The process of enzymatic degradation of pig muscle tissue proteins in the presence of proteolytic collagenase complex was studied. Kinetic constants and the activation energy of release of amino acids from protein fractions were determined. To describe the kinetics of enzymatic hydrolysis flow patterns of the model has been used, it provides for a «fast» and «slow» process steps. In accordance with the model the reaction system can be viewed as the sum of independently reacting substrates, the rate of decay of each of which is determined by its concentration and kinetic characteristics. The maximum degree of conversion in the process of obtaining the free amino acids was at a certain ratio hydrolysis maximum speeds to the «fast» and «slow» stages, namely: a «slow» step at 40 °C, V , which was about 50 % of V at a «fast»
~ ' max max
step. At 45 °C this value is 40 %, and at 50 °C of less than 25 %. In the temperature range studied it can be assumed that the maximum output is achieved with a ratio of speeds on «slow» and «fast» stage less than 0.2. Compare formal macro kinetic constant process to evaluate the conditions of the enzymatic degradation of muscle proteins of animal origin. In the preparation of fermented food products up to the high degree of processing a proteolytic enzyme at a temperature of 40-55 °C with enzyme - substrate ratio of 1:10 is possible to obtain a protein product containing 25-30 % of free ami-no acids in the hydrolyzate with the dry protein degradation depth of 35-40 %.
Введение
] иологическая ценность белка — основного компонента питания человека заключается в возможности его ферментативного распада на составляющие
аминокислоты, которые используются живым организмом для построения необходимых органов и тканей [1, 2].
На заключительных стадиях, процесс функционирования белка сводится к гидролитическому распаду белковых макромолекул до низших аминокислот [3]. Такой процесс протекает во всех видах белкового сырья, используемых человеком, которое подвергается хранению в соответствующих условиях. Этот же естественный процесс, происходящий в природе в живых организмах под воздействием ферментов, применяется человеком для получения продуктов питания [4, 5].
Для оптимального использования процесса ферментативного превращения белкового сырья и получения пищевого продукта необходимо знание кинетических закономерностей протекания процесса в целом и на отдельных стадиях. Понятие «пищевого белка» животного происхождения включает в себя сумму множества фракций белковых молекул с молекулярной массой от нескольких тысяч до сотен тысяч с различной последовательностью составляющих аминокислот, которые подвергаются деградации до меньших фрагментов с образованием промежуточных поли- и олигопептидов и дальнейшей фрагментацией до свободных аминокислот [6]. Содержание белка в животной ткани обычно составляет около 20 % и в нем содержится от 0,1 до 2 % свободных аминокислот [7]. В зависимости от состояния белкового сырья, содержание свободных аминокислот может превышать этот уровень в несколько раз. В специальных видах белковых продуктов лечебно профилактического действия, которые представляют собой белковые гидролизаты, содержание свободных аминокислот может составлять 50-100 % [8].
Известно, что кинетические характеристики любой биохимической реакции позволяют количественно оценить макро процесс и приблизиться не только к пониманию его механизма, но и к выявлению оптимальных условий дальнейших превращений с целью получения целевых продуктов с высоким выходом [9, 10]. К сожалению, использование классической химической и ферментативной кинетики для описания гидролиза сложных многокомпонентных белковых смесей комплексными ферментными препаратами, включающими несколько ферментов различной субстратной специфичности, приводит, как правило, к недостоверному определению кинетических констант [11]. В связи с этим ряд исследователей [5, 7-9] предложили формальный подход к описанию процессов гидролиза многокомпонентных смесей, позволяющий сравнивать эффективность выбранных ферментных комплексов для гидролиза сложных белковых субстратов. Основываясь на этих соображениях, нами была выбрана одна из кинетических схем, описанная в работах [6, 10-12].
Чаще всего при изучении кинетики гидролиза сложных белковых субстратов в качестве основной функции отклика используют интегральные показатели количества концевых групп, освобождающихся в ходе реакции. Обычно для этого применяют формольное титрование [13], реакции с нингидрином, тринитробензолсульфокислотой [5] и др.
реагентами, позволяющими осуществлять аналитическии контроль хода реакции.
Прямым методом контроля является определение накопления свободных аминокислот в ходе ферментативного гидролиза, но этому методу посвящено мало публикации, хотя, именно кинетические характеристики, полученные на основании количественного определения содержания свободных аминокислот наиболее целесообразны для понимания механизма исследуемого процесса.
Целью данноИ работы явилось определение макроки-нетических характеристик процесса гидролитического распада смеси белков мышечной тканеИ, и накопления отдельных аминокислот, освобождающихся в ходе гидролиза, и последующего сравнения полученных результатов с целью выбора оптимальных параметров получения ферментированных продуктов из вторичного сырья мясоперерабатывающих предприятий.
Материалы и методы
В качестве объекта использовали водно-солевой экстракт (1:1) обезжиренной мышечной ткани Longissimus dorsi годовалых свиней, полученный путем 2 часовой экстракции сырья 3 % раствором хлорида натрия, содержащий 30 г/л соли и 35 г/л белка, характеризующийся следующим полным аминокислотным составом (в г/100 г белка): Асп — 7,5; Тре — 5,8; Сер — 2,3; Глу — 15,6; Про — 3,7; Гли — 15,5; Ала — 4,1; Цис — 1,1; Вал — 5,2; Met — 2,4; Иле — 4,0; Лей — 8,2; Тир — 3,1; Фен — 4,8; Гис — 3,1; Лиз — 8,1; Арг — 6,6. Фракционный состав белка, по данным электрофореза в 18 % полиакриа-мидном геле составлял (фракции, кДа): до 10 — 5 %, 10...17 — 8 %, 17...26 — 9 %, 26...43 — 14 %, 43...72 — 15 %, 72...130 — 16 %, 130...170 — 15 %, более 170 кДа — 18 %. Содержание свободных аминокислот в белке 0,2 %. В качестве ферментного препарата использовали Коллагеназу КК 250 ЕД. Определение кинетических параметров осуществляли при соотношении «фермент:субстрат» 1:10 в пересчете на белок при различных температурах в течение 6 часов, отбирая пробы в начале процесса через 15, 30, 60 минут, а далее через каждый час для определения содержания свободных аминокислот. Подготовка проб и автоматический аминокислотный анализ осуществляли как описано ранее [10, 14]. Обработку экспериментальных данных проводили с использованием методов математической статистики [15].
Результаты и их обсуждение
Для описания кинетических закономерностей протекания ферментативного гидролиза была использована модель, предусматривающая наличие «быстрой» и «медленной» стадий процесса [2, 6]. Согласно этой модели, реакционную систему рассматривают как сумму независимо реагирующих субстратов, скорость распада каждого из которых определяется его концентрацией и кинетическими характеристиками. Предполагается, что в момент времени t скорость гидролиза Vt пептидных связей, обладающих близкой реакционной способностью, можно определить по уравнению 1:
Vt = V е-к,
t max '
где Vmax — максимальная скорость гидролиза, г • л-1 • с-1; k — константа эффективности протекания процесса гидролиза
пептидных связей, с-1 [9].
б
Рисунок 1. Зависимость скорости накопления продуктов гидролиза суспензии белков мышечной ткани в присутствии ферментного комплекса Коллагеназы КК при различных температурах, °С: 1-40; 2-45; 3-50; 4-55 (а); графическое определение максимальных кажущихся скоростей (б) и констант интенсивности (в) процесса ферментативного гидролиза
О 240 43»
Рисунок 2. Зависимость скорости накопления аспа-рагиновой кислоты в процессе ферментативного гидролиза свиного белка при различных температурах, °С: 1-40, 2-45, 3-50.
Прологарифмировав эту зависимость, и приняв во внимание, что скорость гидролиза Vt выражается отношением текущей концентрации расщепленных пептидных связей к моменту времени t, получаем уравнение 2: lnVf=ln(P/t) = lnV - kt,
t K J max '
где Р — концентрация расщепленных пептидных связей к моменту времени t, г азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в литре реакционной смеси.
В случае, когда t0, (P/t)^ V0. Согласно принятой модели, предполагающей, что накопление продуктов гидролиза протекает по псевдопервому порядку, V0 соответствует Vmax. Таким образом, построение графика в координатах ln(P/t) = f(t) дает возможность методом нулевой экстраполяции на ось ординат определить Vmax. В зависимости от того, сколько встретится в процессе гидролиза групп с близкой реакционной способностью, график будет представлять из себя ломаную линию из нескольких прямолинейных участков, каждый из которых характеризует ферментативный гидролиз пептидных связей в белке с близкой реакционной способностью.
На рисунке 1 представлена экспериментальная зависимость накопления продуктов гидролиза суспензии белков мышечной ткани от времени. В результате линеаризации кинетических кривых гидролиза в координатах P/t = f(t) (рисунок 1б) можно определить максимальные скорости гидролиза Vma>, а построение зависимостей логарифма текущих скоростей от времени (рисунок 1в) позволило определить константы эффективности протекания процесса гидролиза k на «быстрой» и «медленной» стадиях. Энергию активации определяли по известному уравнению Аррениуса [15]. Полученные значения энергии активации на «быстрой» и «медленной» стадиях были достаточно близки между собой (таблица 1).
На рисунке 2 представлена характерная зависимость накопления одной из 18-ти аминокислот в ходе ферментативного гидролиза при различных температурах. Подобный вид зависимостей был типичным для всех других исследованных аминокислот.
Кинетические зависимости выхода аминокислот в известной мере отвечают уравнению псевдопервого порядка и после линеаризации могут быть аппроксимированы двумя прямолинейными участками, условно характеризующими «быструю» и «медленную» стадии процесса, как это
видно на рисунке 2. Используя вышеизложенный подход, были вычислены кинетические константы при различных температурах протекания процесса гидролиза, энергии активации и выход каждой аминокислоты в отдельности (таблицы 1-3).
Вклад «быстрой» и «медленной» стадий в общий выход продуктов, позволяющий определить долю общего выхода свободных аминокислот, образующихся на каждой из них, оценивали по соотношениям максимальных скоростей процесса к их сумме:
V Быстр /(V Быстр. + V медл.) и V медл./(^ быстр. + V медл.)
max ^ max max ' max ^ max max ''
Для некоторых аминокислот определить энергию активации «медленной» стадии с достаточной степенью точности не всегда удается т.к. линейная аппроксимация зависимостей lnVmax = f (1/T) осуществлялась с низким коэффициентом корреляции (таблица 3).
Анализируя полученные данные, можно заметить, что накопление аргинина, лизина, лейцина и тирозина протекало наиболее интенсивно в течение всего исследованного промежутка времени, о чем свидетельствовали достаточно высокие значения Vmax, как на «быстрой», в среднем 1,5 • 10 -4 г • л-1 • с-1, так и на «медленной», в среднем 610-5 г • л-1 • с-1, стадиях.
Аналогично, хотя и несколько менее интенсивно, происходило высвобождение фенилаланина, гистидина
Таблица 1. Кинетические характеристики процесса гидролиза суспензии белков мышечной ткани свиней ферментным комплексом Коллагеназы КК
Макрокинетическая характеристика Температура, оС
40 45 50 55
«Быстрая» стадия
V -104, г • л -1 • с -1 max ' 2,66 3,42 3,91 4,77
k -10 4, с -1 1,74 2,11 2,57 2,73
Еа, кДж/моль 30,41
«Медленная» стадия
V •ТО4, г • л -1 • с -1 max 0,91 1,24 1,42 1,73
k •ТО 4, с-1 0,31 0,43 0,59 0,99
Е кДж/моль
32,03
а
в
Таблица 2.
Максимальные скорости V и энергия активации Е
г тох г ^ о
процесса накопления отдельных аминокислот в ходе «медленной» стадии ферментативного гидролиза
Амино- V х тах 105, г • л-1 • с-1 Еа, кДж/
кислота 40 °С 45 °С 50 °С моль
Незаменимые аминокислоты
Иле 1,33 2,44 2,12 —
Лей 5,23 6,39 6,88 —
Лиз 4,45 6,14 6,22 —
Мет 1,32 3,12 2,02 —
Фен 3,09 5,23 4,99 —
Тир 2,42 6,16 4,71 —
Тре 1,13 1,56 1,60 30,53
Вал 2,88 3,42 3,95 51,23
Заменимые аминокислоты
Ала 1,28 1,91 2,66 31,48
Арг 5,55 8,27 7,44 —
Асп 0,41 0,55 0,51 19,23
Гис 2,66 4,72 3,27 —
Гли 0,6 0,62 0,68 10,02
Глу 1,52 2,71 2,68 40,25
Сер 1,14 1,46 1,63 21,33
Таблица 3. Константы эффективности к, доли от общего выхода аминокислот, образующихся на «быстрой» и «медленной» стадиях, а также суммарный выход аминокислот в ходе ферментативного гидролиза при 40 °С
Аминокислота к х 10 4, с-1 Доля общего выхода аминокислот, реализуемого на стадиях Выход аминокислот, %*
«быстрая» стадия «мед- _ " «бы- «медлен-ленная» страя» ная» стадия
Незаменимые аминокислоты
Иле 2,13 0,24 0,63 0,35 20,1
Лей 1,74 0,31 0,68 0,33 30,4
Лиз 1,99 0,3 0,70 0,30 25,2
Мет 1,66 0,25 0,66 0,38 —
Фен 1,77 0,29 0,64 0,36 31,8
Тир 2,44 0,30 0,74 0,25 42,8
Тре 0,73 0,30 0,62 0,47 22,3
Вал 1,19 0,14 0,65 0,45 21,6
Заменимые аминокислоты
Ала 2,08 0,26 0,74 0,23 6,3
Арг 1,24 0,33 0,6 0,3 45,5
Асп 2,61 0,55 0,81 0,33 2,3
Гис 2,18 0,35 0,72 0,36 37,1
Гли 1,77 0,39 0,64 0,37 1,7
Глу 1,55 0,12 0,64 0,47 9,1
Сер
3,11
0,36
0,81
0,33
14,4
* Здесь и далее выход определяли по истечении 7 час гидролиза при указанной температуре.
и валина. В этом случае усредненные значения Утах колебались в интервалах 8 • 10 -5 г • л-1 • с-1 и 3 • 10 -5 г • л-1 • с-1 для «быстрой» и «медленной» стадии соответственно. Для этих аминокислот наблюдался максимальный выход.
Напротив, аланин, серин и аспарагиновая кислота образовывались в процессе гидролиза преимущественно во время «быстрой» стадии, т.к. Утах на «быстрой» стадии в среднем в 3 раза выше Утах на «медленной» стадии. При этом накопление аспарагиновой кислоты на «медленной» стадии почти прекращалось, о чем свидетельствовало минимальное значение Утах для «медленной» стадии — 4,5 • 10-6 г • л-1 • с-1.
Из полученных данных (таблицы 2, 3) видно, что максимальная степень конверсии в процессе получения свободных аминокислот, достигается при определенном соотношении максимальных скоростей гидролиза на «быстрой» и «медленной» стадиях, а именно при 40 °С Утах на «медленной» стадии составляет около 50 % от Утах на «быстрой» стадии, при 45 °С эта величина составляет около 40 %, а при 50 °С менее 25 %. То есть в исследованном интервале температур можно принять, что максимальный выход достигается при соотношении скоростей на «медленной» и «быстрой» стадиях менее 0,2.
Анализируя вышесказанное, предполагаем — фермент гидролизовал в первую очередь актомиозин, миозин, миоглобин, входящие в состав животного белка, и затем уже белковые фракции коллагеновых структур.
При сравнении энергий активации освобождения аминокислот в ходе «быстрой» стадии процесса с интегральной энергией активации всего процесса в целом (таблицы 1, 2) видно, что энергия активации для свободных аминокислот в 2-3 раза выше, чем энергия активации для всего процесса в целом. Это вполне объяснимо, так как в полученных ги-дролизатах содержалось 15-20 % свободных аминокислот, тогда как остальная часть приходилась на олигопептиды различной молекулярной массы, для получения которых, вероятно, должно тратиться меньшее количество энергии, чем для получения свободных аминокислот.
Таким образом, сравнивая полученные формальные константы гидролиза суспензии белков мышечной ткани комплексом протеолитических ферментов, удалось оценить условия ферментативной деградации мышечных белков животного происхождения. В случае необходимости получения ферментированных продуктов вплоть до гидролизатов, установленные константы позволяют заключить, что в описанных условиях, т.е. при температурах 40-55 °С возможно получение, при использовании проте-олитического фермента с фермент-субстратным соотношением 1:10, белкового продукта содержащего 25-30 % свободных аминокислот в сухом гидролизате с глубиной гидролиза 35-40 %.
В случае перенесения полученных данных на животное сырье, подвергающееся хранению при комнатной температуре, можно предположить, что скорость распада белка будет почти на порядок выше. Содержание свободных аминокислот с 0,1 % может увеличиваться до 1-10 % в течение суток.
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00008). •
В КОНТАКТЫ:
Иванкин Андрей Николаевич а aivankin@inbox.ru
Вострикова Наталия Леонидовна а nvostrikova@list.ru
Куликовский Андрей Владимирович а kulikovsky87@gmail.com
Олиференко Галина Львовна а oliferenko2@inbox.ru
Полещук Ольга Митрофановна а poleshchuk@mgul.ac.ru
Агеев Антон Константинович а ageev95@bk.ru
Зенкин Александр Николаевич а zensanches@mail.ru
5. Zhu X., Zhu C., Zhao L., Cheng H. Amino acids production from pig proteins hydrolysis in subcritical water // Chinese Journal of Chemical Engineering. - 2008. - V. 16. - № 3. - P. 456-460.
6. German A.B., Neklyudov A.D., Ivankin A.N., Berdutina A.V. The kinetics of hydrolysis of animal fat by pancreatic lipase //Applied Biochemistry and Microbiology. - 2002. - V. 38. - № 6. - P. 517-520.
7. Ivankin A.N., Nekludov A.D., Vostrikova N.L Biologically active substances of a natural origin. Reception and structurally functional interrelations. - Saarbrücken, Germany: LAMBERT Academic Publishing, 2011. - 420 c.
8. Lisitsyn A.B. Comparative study of fatty acid composition of meat material from various animal species / A.B. Lisitsyn, I.M. Chernukha, A.N. Ivankin // Scientific J. of Animal Science. - 2013. - V. 2. - № 5. - P. 124 -131.
9. Neklyudov A.D., Berdutina A.V., Ivankin A.N., Karpo B.S., Osoka A.V. Determination of kinetic constants hydrolysis of keratin-containing raw materials // Applied biochemistry and microbiology. — 1999. — V. 35. -No 1. — P. 45-49.
10. Valencia P., Espinoza K., Ceballos A., Pinto M., Almonacid S. Novel modeling methodology for the characterization of enzymatic hydrolysis of proteins // Process Biochemistry. — 2015. — V. 50. No 4. — P. 589-597.
11. Abadía-García L., Castaño-Tostado E., Ozimek L., Romero-Gómez S., Ozuna C., Amaya-Llano S.L. Impact of ultrasound pretreatment on whey protein hydrolysis by vegetable proteases // Innovative Food Science & Emerging Technologies. — 2016. — V. 37. Part A . — No 10. -P. 84-90.
12. Vorob'ev M. M., Kochetkov K.A. Determination of kinetic parameters for casein hydrolysis by chymotrypsin using two ranges of substrate concentration // International Dairy Journal. — 2016. — V. 61. — No 10. — P. 76-84.
13. López C. M., Bru E., Vignolo G.M., Fadda S. G. Identification of small peptides arising from hydrolysis of meat proteins in dry fermented sausages // Meat Science. — 2015. — V. 104. — No 6. — P. 20-29.
14. Valencia P.L., Flores S.A., Pinto M.J., Almonacid S.F. Analysis of the operational strategies for the enzymatic hydrolysis of food proteins in batch reactor //Journal of Food Engineering. — 2016. — V. 176. -No 5. — P. 121-127.
15. Darwish A., Poleshchuk O. New models for monitoring and clustering of the state of plant species based on semantic spaces. // Journal of intelligent and fuzzy systems. — 2014. — V. 26. - No 3. — P. 1089-1094.
Подписка на информационно-аналитическое обозрение «РЫНОК мяса и мясных продуктов» на 2017 год
Периодичность выхода обзора — ежемесячно.
Стоимость годовой подписки: 3300 руб. (включая НДС), бумажный носитель.
3540 руб. (включая НДС), электронный носитель. Справки по тел: +7 (495) 676-64-11. Подписка: тел./факс: +7 (495) 676-61-01
ПОДПИСНОЙ КУПОН
Издание: МАО «РЫНОК мяса и мясных продуктов»
Срок подписки: СОдОвая / ПОЛуГОДОЮЯ_
Адрес подписчика:_
(почтовый индекс, область, район, город, улица, дом, корпус, № офиса)
Наименование предприятия, организации _
Контактный телефон, факс (код города) _
Адрес электронной почты_
Фамилия, имя, отчество _
