CC BY
33
теолиз минорных белков в автолизирующих животных тканях. В связи с тем, что кальпаины проявляют оптимальную активность при величинах pH, близких к нейтральному значению, это может иметь существенное значение в послеубойных изменениях мяса с высоким уровнем pH (ДЕД). Полученные нами данные показали, что при автолизе активность каль-паина, требующего низкой концентрации ионов кальция, постоянно снижается, очевидно, как полагают авторы [7], вследствие авто-протеолиза и наличия эндогенного ингибитора — кальпостатина. Аналогичные результаты получены [8, 9].
Как показали экспериментальные данные, хлорид натрия оказывает ингибирующее действие на кальпаин только при концентрациях более 3%, что может быть обусловлено присутствием в тканевой жидкости ионов кальция, стабилизирующих каталитически активную конформацию фермента. При концентрациях ЫаС1 свыше 8% скорость ингибирования кальпаина значительно снижается. Кинетика термоинактивации кальпаина без и в присутствии хлорида натрия при концентрации, оказывающей ингибирующее действие на активность фермента, свидетельствует о разнохарактерности процессов, что связано с неустойчивостью кальпаина к температуре при наличии в системе ЫаС1. В отсутствие хлорида натрия наблюдается пик активности при всех исследованных режимах термостатирования, однако уровень и время достижения максимума уменьшаются с увеличением температуры. Полученные кривые инактивации кальпаина го-вяжьей~мышечной -ткани и рассчитанные константы позволяют со всей очевидностью утверждать, что кинетика термоинактивации описывается реакцией первого порядка.
ВЫВОДЫ
Активность кальпаина в ходе автолиза имеет тенденцию к снижению. Хлорид натрия, применяемый при посоле мяса, оказывает ингибирующее действие при концентрациях выше 3%. Термоинактивация кальпаина при наличии в системе хлорида натрия (5%) относится к- реакции первого порядка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Anson М. L. The Estimation of Pepsin, Tripsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin//I. Gen Phvsiol. 1983,—22.—P. 77.
2. W h i t a k e r I. R., Gran urn P. E. An Absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm.//Analit. biochem.— 1980. —109,—P. 156.
3. Герасимов Я- И., Д p e в и ч В. П., Е р е-м и н Е. Н. и др. Курс физической химии.— М.: Химия, 1966.—592 с.
4. Bush W. A., St rome г М. Н., Go 11 D. Е., Suzuki А. Са2+ — Specific removal of Z-lines from rabbit skeletal muscle//I. Cell. Biol., 1972,—52,—P. 367.
5. Reddy М. K., Et linger I. D., R a b i n o-witz М., Fishman D. A., Z a k R. Removal of Z-lines and L-actinin from isolated myofibrils by calcium — activated meutral protease//!. Biol. Chem 1975,—250.—P. 4278.
6. N e 1 s о n W. I., Tr a ub P. Purification and further characterisation of a calcium — activated neutral protease from cardiac muscle//!. Biochem.--1983 —93 — P. 1435.
7. N i s h i u r a 1., Tanaka K. Jamato S., Mura-s h i T. The occurrence of an inhibitor of Ca2 + — dependent neutral protease in rat livar//Biochem. —1978 — 84.— P. 1657.
8. V i d a 1 e n с P., С о t t i n P., Merdaci N.. Du-cast ei n g A. Stability of two Ca2 + — dependent neutral proteinases and their specific inhibitor during post-mortem storade of rabbit skeletal muscle//I. Sci. Food Agric—1983,—34.—№ 11,—P. 1241.
9. Zimmerman U. I„ Schlaepfer W. Multiple form of Ca2+ — activated protease from rat brain and muscle//!. Biol. Chem.—1984,—259,—№ 5,— P. 3210.
Кафедра технологии мяса
~и мясных продуктов Поступила 28.06.90
637.517.211.002.612
КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЬПАИНОВ ГОВЯЖЬЕЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
Л. С. КУДРЯШОВ, О. А. КОБЕЛЯНОВА, Н. Н. ПОТИПАЕВА, В. И. БРАГИНСКИЙ Кемеровский технологический институт пищевой промышленности
Кальпаины — ферменты группы Са2+ — активируемых нейтральных протеиназ, содержащихся в различных тканях животных, обладающие сходными физико-химическими свойствами и относящиеся к цистеиновым эндопептидазам, которые локализованы в саркоплазме клеток [1, 2]. Считают [3, 4], что Са2+— активируе-Тйые прбтеиназы играют определенную роль
в изменении миофибриллярной структуры животных тканей при созревании мяса. Кальпаины способны активировать некоторые ферменты, участвующие в метаболизме клеток [5]. Не менее существенную роль играют эти ферменты в технологии соленых мясопродуктов.
Цель работы — выявить зависимость скорости реакции протеолиза от концентрации суб-
стрг
калі
ным
комі
воде
Иі мыш 18-чали ленн тер а сред Пои дочн тов. диф* слу» Олаі акти 1 г СФ-' белк
Кс
мент
[9]
осно;
субсі
ЛЄКСІ
прод
Анал
устаї
подл
ции
ческс
К0НЦІ
рості
ной
V
0,075
0,093-^
0,025
О
ведеь
OCHOE
MOCTI
Мент
I
1:11:1 и (Ы 1:11. .1 ии1_1'.' [иЛл . н V-.
,п Р-ЧI у ^. I
ч- но-
1ГП1 —
I' 5 1 Лм-
II' ь I-ган[ Р у,'; I-1 - -|
[/НШ .>1
. ;■ и I 111 ,
иг И:-'
■I. : ■*
-•К.
1ДО1
ЙЛ,
!. -■ I-и;м1к-1 : |г |'1 о: к
« |р!г .и лк
страта, установить изменение активности кальпаина при связывании его функциональными группами хлорида натрия — основного компонента рассолов, используемых при производстве соленых мясопродуктов.
Исследования проводили на длиннейшей мышце спины говяжьих полутуш возрастом 18—24 мес. Образцы мышечной ткани измельчали сначала на мясорубке, а затем в изготовленном из тефлона гомогенизаторе типа Пот-тера-Эльвейема. В качестве суспендирующей среды использовали фосфатный буфер с pH 7,5. После центрифугирования гомогената надоса-дочную жидкость брали как источник ферментов. Активность кальпаина определяли по модифицированной методике [6], субстратом служил казеин, полученный по Гаммерстену Олайненского НПО «Биолар» [7]. Выражали активность в микромолях тирозина за 1 ч на 1 г белка, измеренного на спектрофотометре СФ-46 при длине волны к 280 нм. Содержание белка в растворе фиксировали по методике [8].
Количественные исследования скорости ферментативных реакций, освещенные в работах [9] Михаэлиса и Ментен, показали, что в их основе лежат обратимые взаимодействия субстратов с ферментами с образованием комплексов, которые далее распадаются, образуя продукты реакции и регенерируемого фермента. Анализом экспериментальных данных (рис. 1) установлено, что скорость гидролиза казеина и под действием кальпаина зависит от концентрации субстрата [5] и выражается гиперболической функцией. При сравнительно малых концентрациях казеина <Л,67-10“4 М скорость реакции является приблизительно линейной функцией концентрации субстрата. При-
" " Кш + Р] ■
где утах — максимальная скорость протеолиза, мкМ/ч-г белка;
Кт — константа Михаэлиса — Ментен, М.
Для нахождения утах и Кт воспользовались методом обратных величин, предложенным Лайнуивером и Берком [9].
Зависимость активности кальпаина от концентрации субстрата в координатах Лайнуи-вера Берка показана на рис. 2, где отрезок, отсекаемый продолжением прямой на оси ординат, равен 1/ишаА, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, равен —1 / Кт- Параллельно были найдены уточненные значения констант с помощью ЭВМ.
КВа \.-2
I. ЖИ-
Каль-п: фер-.., [5]. Ч фер-
"‘КТОВ.
скоро-I суб-
Рис. 1
веденные экспериментальные данные дают основание полагать, что полученная зависимость описывается уравнением Михаэлиса — Ментен
Таким образом, исследуя начальные скорости протеолиза казеина под действием кальпаина при различных концентрациях субстрата, с достаточно высокой степенью точности графическим методом двойных обратных величин и с помощью ЭВМ определили значения итах = 0,11 мкМ/ч-г белка и Кт = = 0,75-10~4 М. При этом, как следует из рис. 1, Кт = [5] при итах/2, что согласуется с представлениями общей кинетики ферментативных процессов и подтверждает возможность описания начальной скорости реакции протеолиза уравнением Михаэлиса — Ментен.
При обосновании режимных параметров посола мяса необходимо выявить кинетические характеристики не только процессов накопления и распределения посолочных ингредиентов, но и ферментативных реакций, сопровождающихся протеолитическими изменениями в тканях. Учитывая это обстоятельство, . был проведен ингибиторный анализ кальпаина с количественной оценкой реакционной спо-
собности ЫаС1. Для определения константы ингибирования /0 был применен способ, предложенный Уэббом [10]. При этом строили ряд прямых, характеризующих зависимость 1/и от концентрации №С1 при различных концентрациях казеина (рис. 3). Из графика
Рис. 3
видно, что продолжение прямых до оси абсцисс отсекает отрезок, соответствующий константе ингибирования /С,- =0,67 М. Анализируя полученные зависимости, можно с уверенностью утверждать о неконкурентном типе торможения реакции протеолиза в присутствии хлорида натрия. Таким образом, скорость реакции и для неконкурентных систем выражается уравнением
,, __ ____1'тах И_____ /о\
(Кт + [8]}(1 + С/КУ ’
где С — концентрация хлорида натрия. М.
Это уравнение в сопоставлении с рис. 3 позволяет решить вопрос, соответствует ли настоящая ферментативная модель неконкурентному ингибированию. В связи с тем, что в данном случае ингибитор отличается по своей структуре от субстрата, это позволяет предположить, что хлорид натрия взаимодействует с центром, отличающимся от центра связывания субстрата. Подавление активности кальпаина, по мнению [9], обусловлено искажением его трехмерной структуры, вызванным связыванием ингибитора. Помимо этого, связанный 1МаС1 как ингибитор способен влиять на каталитический процесс, частично экранируя активный центр. Как следует из рис. 3 и формулы 2, для неконкурентного ингибирования характерно уменьшение максимальной скорости реакции по сравнению с максимальной скоростью в отсутствие ингибитора. Из рис. 3 также видно, что какой бы высокой ни была концентрация субстрата, предотвратить ингибирование невозможно. Следовательно, результаты представленных исследований дают основание считать, чтд хлорид натрия, применяе-
мый при посоле мяса, способен ингибировать активность кальпаина при определенных концентрациях.
Полученные кинетические константы кальпаина говяжьей мышечной ткани, требующего для реакции низкие концентрации ионов кальция, могут быть использованы при создании математических моделей процессов созревания и посола мяса. Учитывая, что ингибирующее действие на кальпаин хлорид натрия проявляет при концентрациях свыше 3%, в случае кратковременного посола мяса лучше использовать рассолы более низких концентраций.
выводы
1. Кинетическими исследованиями кальпаина говяжьей мышечной ткани найдены максимальная скорость протеолиза утш.= 0,11 мкМ/ ч-г белка, константа Михаэлиса — Ментен /Ст=0,75-10 4 М, константа ингибирования реакции хлоридом натрия /0 = 0,67 М.
2. Хлорид натрия — неконкурентный ингибитор и соответственно взаимодействует с центром фермента, отличающимся от центра связывания субстрата.
ЛИТЕРАТУРА
1. I shiu г a S., Murofushi Н., Suzuki К., I гп а-hori К. Studies of a calcium-activated neutral protease from chicken skeletal muscle. 1. Purification and characterization//.!. Biochem.—1978.—84.— P. 225.
2. R e v i 1 1 e W. J., G о 1 1 D. E., Stromer H. H., Robson R. М., Dayton W. A. Ca2+ activated proteases possibly involved in myofibrillare proteine turnover: subcellular localization of the protease in porcine skeletal muscle//J. Cell Biol.—1976.—70.— P. I.
3. Z e e с e M. G., Robson R. М., L u s b у M. L., Frederick C., Parrish Jr. Effect of calcium activated protease (CAF) on bovin myofibrils under different conditions of pH and temperature//.). Food Sci.—1986.-—51.—3. — P. 797.
4. Q u a i i A., Valin C. Effect of muscle lysosomal enzymes and calsium-activity: relationship with ageing changes//Meat Sci.—1980.—5.— P. 233.
5. Wurachi T. Intracellurar Ca2+ — proteanse and its inhibitor protein calpain and calpostatin//In: Calcium and Cell Funchion. —1983. — 1.— P. 378.
6. Anson M. L. The estimation of pepsin, tripsin, papain and cathepsin with hemoglobin//J. Gen. Physiol.— 1983.—22,— P. 77.
7. Kudryash о v L. S., S h a I a k i n a L. P., Bolshakov A. S. The activity of pork muscle proteases as effeetet with sodium chloride//33 rd International congress of science & technology.—1987.— P. 40.
8. W h i t a k e r J". R., Granum P. E. An absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm//Analyt. Biochem.— 1980.-109,—P. 156.
9. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке.— М.:Мир, 1980.—2.— С. 28.
10. Уэбб Л. Ингибиторы ферментов и метаболизма.— М.: Мир, 1966.— С. 606.
Кафедра технологии мяса
и мясных продуктов Поступила 17.01.91
