Влияние автолиза, хлорида натрия и температуры на активность кальпаинов говяжьей мышечной ткани Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

муки были разработаны рецепты комбикормов, рассчитана их питательность.

ВЫВОД

того, одновременно производство мясокостной муки и кормового жира будет вестись по безотходной технологии.

Мясорастительная мука — ценное КОрМОвЬ!1 Кафедра технологии переработки средство ДЛЯ производства комбикормов, кроме зерна и комбикормов

Поступила 24.10.91

неї

КґіЛ

.ни

ИМ. і

ни.

637.517.211.002.612

ВЛИЯНИЕ АВТОЛИЗА, ХЛОРИДА НАТРИЯ И ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ КАЛЬПАИНОВ ГОВЯЖЬЕЙ мышечной ткани

Л. С. КУДРЯШОВ, Н. Н. ПОТИПАЕВА, О. А. КОБЕЛЯНОВА

Кемеровский технологический институт пищевой промышленности

В .связи с важной ролью протеолитических процессов в направленном регулировании и интенсификации технологических процессов вызывает большой интерес изучение тканевых ферментных систем мяса. Мы исследовали влияние некоторых технологических факторов на активность кальпаина, требующего низкой концентрации ионов кальция, соответствующей их содержанию в клеточной жидкости.

Эксперименты проводили на говяжьих полу-тушах I категории упитанности возрастом 18—24 мес. Была выбрана длиннейшая мышца спины, которую через 40—50 мин после убоя упаковывали в целлофановые мешочки и хранили в холодильнике при 0—4° С. Для экспериментов использовали мышцы с pH 5,8+0,2 через 24 ч с момента убоя животного. Сразу после извлечения мышцы, а затем ежедневно в течение 168 ч отбирали пробы. Термостабильность кальпаина определяли через 2 и 24 ч автолиза. Мышцу после нарезания на мелкие кусочки измельчали в гомогенизаторе типа Поттера-Эльвейема. После центрифугирования 20 мин при 3000 об/мин надосадочную жидкость использовали как источник ферментов. Гомогенизацию проводили в фосфорном буфере с pH 7,5. Протеолитическую активность кальпаина определяли, используя в качестве субстрата казеин, по Гаммерстену НПО «Биолар» (Олайне). Термостабильность кальпаина изучали, инкубируя гомогенаты мышечной ткани в буфере с pH 7,5 при различной температуре в течение 1 ч с добавлением и без добавления в систему 5% хлорида натрия, а затем определяли его активность при 25° С в течение 1 ч. Реакцию останавливали введением в реакционную смесь 12%-ного раствора трихлорук-сусной кислоты. После 24 ч выдержки проб в холодильнике в фильтрате определяли сумму тирозинсодержащих веществ спектрофотометрически при 280 нм [1]. Активность кальпаина Акп выражали в микромолях на 1 г белка за 1 ч. .Содержание белка в надосадочной жидкости фиксировали по методу [2].

Исследовали также влияние хлорида натрия

на активность кальпаина. В модельных экспериментах в инкубационную смесь вместе с буферным раствором добавляли №С1 в таком количестве, чтобы его конечная концентрация составляла 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 и 14%. Влияние продолжительности автолиза т (кривая /) и концентрации ЫаС1 С (кривая 2) на активность кальпаина Акп показано на рис. 1.

Рис. 1

Весьма вероятно, что проявление Акп в ав-толизирующей мышечной ткани определяется спецификой свойств и их локализацией в клетках. Экспериментально показано (рис. 1), что протеолитическая активность кальпаина имеет максимальное значение в парной мышечной ткани, а затем постепенно снижается при хранении мяса в условиях низких плюсовых температур I 0—4° С. Из опытов следует, что скорость падения активности наибольшая в первые 2 сут автолиза. К 72 ч активность составляет около 50% первоначальной. Можно заключить, что добавление в реакционную смесь до 3% хлорида натрия не приводит к изменению активности кальпаина, однако при доведении концентрации ЫаС1 до 6% наблюдается существенная инактивация фермента, при этом активность уменьшается на 40% по сравнению с исходной без присутствия хлорида натрия. Дальнейшее повышение кон-

центрации КаС1 менее влияло на активность кальпаина.

В специальной серии опытов исследовали термостабильность кальпаина без и при наличии в системе хлорида натрия. Данные показывают (рис. 2), что в отсутствие ЫаС1 при всех исследуемых температурах в первый

жительности инкубации реакционной смеси т. Данные рис. 3 свидетельствуют об ингибирующем действии термостатирования кальпаина в присутствии хлорида натрия. Полученные кривые с высокой достоверностью описываются эскпоненциальной зависимостью ит = = ю0е~Кг, где ит—начальная скорость ферментативной реакции; vo — скорость в процессе

Рис. 2

момент нагрева наблюдается возрастание активности фермента, а по достижении некоторого максимума, характерного для каждой температуры, происходит инактивация кальпаина. При этом, чем выше температура выдержки ферментного раствора, тем меньший период времени необходим для достижения наибольшей активности. Так, максимальная активность кальпаина для исследованных режимов термостатирования 25, 40, 50, 60 и 70° С проявляется соответственно на 60, 55, 52, 49 и 45 мин. Чем ниже температура термостатирования, тем выше абсолютное значение Ак„. Термоустойчивость кальпаина в присутствии 5% хлорида натрия имеет постоянную тенденцию к снижению с увеличением продол-

Рис. 3

инкубации к моменту времени т (за скорость реакции принимали активность кальпаина).

Из кинетического уравнения, характеризующего динамику инактивации фермента, можно определить константу скорости инактивации для разных температур из 5—7 определений

Результаты кинетических исследований активности кальпаина в зависимости от продолжительности инкубации и температуры приведены в таблице.

Таблица

т, мин и, мкМ/ ч • г К, мин 1 при 25° С т, мин V, мкМ/ ч ■ г К, мин~] при 40° С т, мин V, мкМ/ ч-г К, мин 1 при 50° С т, мин V, мкМ/ ч • г К, мин 1 при 60°-С т, мин о, мкМ / ч ■ г К, мин~1 при 70° С

\ 5 0,065 0,00684 15 0,057 0,00772 155 0.054 0,00813 10 0,052 0,01088 10 0,035 0,02176

30 0,059 0,00663 30 0,051 0,00757 30 0,047 0,00870 25 0,043 0,01198 25 0,025 0,02439

45 0,053 0,00679 45 0,045 0,00783 45 0.042 0,00825 40 0,039 0,00992 40 0,015 0,02802

75 0,043 0,00687 75 0,036 0,00767 75 0,031 0,00904 55 0,033 0,01081 55 0,010 0,02774

105 0,036 0,00660 105 0.028 0,00787 105 0,022 0,00971 85 0,020 0,01119 — — —

165 0,023 0,00692 165 0.018 0,00769 —- — — — — _ — — —

Как видно из таблицы, инактивация кальпаина характеризуется реакцией первого порядка при максимальном отклонении частных значений К и Кср не более 10%, что приемлемо в кинетических исследованиях, где допускается

отклонение кинетических констант до 15% [3].

По данным [4, 5, 6], кальцийзависимые нейтральные протеиназы — кальпаины катализируют процесс разрыхления 2-линий мио-фибрилл и осуществляют ограниченный про-

теолиз минорных белков в автолизирующих животных тканях. В связи с тем, что кальпаины проявляют оптимальную активность при величинах pH, близких к нейтральному значению, это может иметь существенное значение в послеубойных изменениях мяса с высоким уровнем pH (ДЕД). Полученные нами данные показали, что при автолизе активность кальпаина, требующего низкой концентрации ионов кальция, постоянно снижается, очевидно, как полагают авторы [7], вследствие авто-протеолиза и наличия эндогенного ингибитора — кальпостатина. Аналогичные результаты получены [8, 9].

Как показали экспериментальные данные, хлорид натрия оказывает ингибирующее действие на кальпаин только при концентрациях более 3%, что может быть обусловлено присутствием в тканевой жидкости ионов кальция, стабилизирующих каталитически активную конформацию фермента. При концентрациях ЫаС1 свыше 8% скорость ингибирования кальпаина значительно снижается. Кинетика термоинактивации кальпаина без и в присутствии хлорида натрия при концентрации, оказывающей ингибирующее действие на активность фермента, свидетельствует о разнохарактерности процессов, что связано с неустойчивостью кальпаина к температуре при наличии в системе ЫаС1. В отсутствие хлорида натрия наблюдается пик активности при всех исследованных режимах термостатирования, однако уровень и время достижения максимума уменьшаются с увеличением температуры. Полученные кривые инактивации кальпаина го-вяжьей~мышечной -ткани и рассчитанные константы позволяют со всей очевидностью утверждать, что кинетика термоинактивации описывается реакцией первого порядка.

ВЫВОДЫ

Активность кальпаина в ходе автолиза имеет тенденцию к снижению. Хлорид натрия, применяемый при посоле мяса, оказывает ингибирующее действие при концентрациях выше 3%. Термоинактивация кальпаина при наличии в системе хлорида натрия (5%) относится к- реакции первого порядка.

ЛИТЕРАТУРА

1. Anson М. L. The Estimation of Pepsin, Tripsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin//I. Gen Phvsiol. 1983,—22.—P. 77.

2. W h i t a k e r I. R., Gran urn P. E. An Absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm.//Analit. biochem.— 1980. —109,—P. 156.

3. Герасимов Я- И., Д p e в и ч В. П., Е р е-м и н Е. Н. и др. Курс физической химии.— М.: Химия, 1966.—592 с.

4. Bush W. A., St rome г М. Н., Go 11 D. Е., Suzuki А. Са2+ — Specific removal of Z-lines from rabbit skeletal muscle//I. Cell. Biol., 1972,—52,—P. 367.

5. Reddy М. K., Et linger I. D., R a b i n o-witz М., Fishman D. A., Z a k R. Removal of Z-lines and L-actinin from isolated myofibrils by calcium — activated meutral protease//!. Biol. Chem 1975,—250.—P. 4278.

6. N e 1 s о n W. I., Tr a ub P. Purification and further characterisation of a calcium — activated neutral protease from cardiac muscle//!. Biochem.--1983 —93 — P. 1435.

7. N i s h i u r a 1., Tanaka K. Jamato S., Mura-s h i T. The occurrence of an inhibitor of Ca2 + — dependent neutral protease in rat livar//Biochem. —1978 — 84.— P. 1657.

8. V i d a 1 e n с P., С о t t i n P., Merdaci N.. Du-cast ei n g A. Stability of two Ca2 + — dependent neutral proteinases and their specific inhibitor during post-mortem storade of rabbit skeletal muscle//I. Sci. Food Agric.—1983,—34.—№ 11,—P. 1241.

9. Zimmerman U. I„ Schlaepfer W. Multiple form of Ca2+ — activated protease from rat brain and muscle//!. Biol. Chem.—1984,—259,—№ 5,— P. 3210.

Кафедра технологии мяса

~и мясных продуктов Поступила 28.06.90

637.517.211.002.612

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЬПАИНОВ ГОВЯЖЬЕЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ

Л. С. КУДРЯШОВ, О. А. КОБЕЛЯНОВА, Н. Н. ПОТИПАЕВА, В. И. БРАГИНСКИЙ Кемеровский технологический институт пищевой промышленности

Кальпаины — ферменты группы Са2+ — активируемых нейтральных протеиназ, содержащихся в различных тканях животных, обладающие сходными физико-химическими свойствами и относящиеся к цистеиновым эндопептидазам, которые локализованы в саркоплазме клеток [1, 2]. Считают [3, 4], что Са2+— активируемые прбтеиназы играют определенную роль

в изменении миофибриллярной структуры животных тканей при созревании мяса. Кальпаины способны активировать некоторые ферменты, участвующие в метаболизме клеток [5]. Не менее существенную роль играют эти ферменты в технологии соленых мясопродуктов.

Цель работы — выявить зависимость скорости реакции протеолиза от концентрации суб-

стрг

калі

ным

комі

воде

Иі мыш 18-чали ленн тер а сред Пои дочн тов. диф* слу» Олаі акти 1 г СФ-' белк

Кс

мент

[9]

осно;

субсі

ЛЄКСІ

прод

Анал

устаї

подл

ции

ческс

К0НЦІ

рості

ной

V

0,075

0,093-^

0,025

О

ведеь

ОСНОЕ

M0CTI

Мент