Киллерные токсины аскомицетовых дрожжей, подавляющие фитопатогенные грибы Botrytis cinerea

Шагалова Валерия Алексеевна; Вустин Михаил Михайлович; Машенцева Наталья Геннадьевна

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

УДК 664.764:663.14.038.3

Киллерные токсины аскомицетовых дрожжей, подавляющие фитопатогенные грибы Botrytis cinerea

Российский биотехнологический университет (РОСБИОТЕХ) Биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» -ГосНИИгенетика, Москва, Россия

КОРРЕСПОНДЕНЦИЯ: Шагалова Валерия Алексеевна

E-mail: shagalovalira@gmail.com

ЗАЯВЛЕНИЕ О ДОСТУПНОСТИ ДАННЫХ:

данные текущего исследования доступны по запросу у корреспондирующего автора.

ДЛЯ ЦИТИРОВАНИЯ:

Шагалова, В.А., Вустин, М.М., & Машенцева, Н.Г. (2023). Киллерные токсины, продуцируемые различными видами аскомицетовых дрожжей. Скрининг наиболее активных штаммов против фитопатогенных грибов Botrytis cinerea. Хранение и переработка сельхозсырья, (2), 146-162. https://doi. org/10.36107/spfp.2023.440

ПОСТУПИЛА: 05.06.2023 ПРИНЯТА: 27.07.2023 ОПУБЛИКОВАНА: 30.07.2023

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ:

авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки Российской Федерации, Соглашение № 075-15-2021-1053.

В. А. Шагалова1, М. М. Вустин2, Н. Г. Машенцева1

АННОТАЦИЯ

Введение: Из года в год растет ущерб, причиняемый патогенными микроорганизмами сельскому хозяйству. Использование пестицидов может негативно сказываться на качестве сырья и здоровье потребителей. Односторонний подход в решении данного вопроса не приводит к положительным результатам. Киллерные токсины (КТ) дрожжей представляют значительный интерес для биотехнологии в качестве препаратов, подавляющих активность патогенов.

Целью данного исследования является проведение скрининга штаммов аскомицетовых дрожжей из коллекции Национального биоресурсного центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», проявляющих наибольшую киллерную активность по отношению к фитопатогенным грибам вида Botrytis cinerea, а также определение факторов, влияющих на ее эффективность.

Материалы и методы: Определение активности КТ проводилось на тонком агаре на полной дрожжевой среде YPD с добавлением 0,5 мл/л 88 % раствора молочной кислоты, pH = 4,5. Значение водородного показателя 4,5 выбрано как оптимальное для большинства исследуемых ранее видов дрожжей. Также проведены тесты при различных значениях pH и температуры. Для поддержания различных температур культивирования дрожжей использовался термостат ТС-1/80 (Смоленское СКТБ СПУ, Смоленск, Россия). Контроль уровня pH производился при помощи индикаторных полосок высокой точности Diversey-MN92110 (Macherey-Nagel, Германия). Для подтверждения видовой принадлежности дрожжей методом микроскопирования использовался микроскоп биологический Микромед 2 (2-20 inf.) (ООО «Наблюдательные приборы», Санкт-Петербург, Россия).

Результаты: Наибольшие зоны подавления роста Botrytis cinerea показаны для штаммов Schwanniomyces occidentals Y1-627, Y-1628, Y-1629, Y-1638, Y-1640, Y-1641, Metschnikowia pulcherrima Y-3698. Также небольшие зоны подавления наблюдали у штаммов Cyberlindnera mrakii Y-1211, Wickerhamomyces anomalus Y-201, Y-3836, Y-4562, Y-1182, Debaryomyces hansenii Y-1681. При проведении теста на остальных штаммах действие КТ не выявлено.

Выводы: В настоящем исследовании обнаружены штаммы киллерных дрожжей из коллекции БРЦ ВКПМ, эффективные против Botrytis cinerea F-1006, что имеет потенциальное значение для разработки и использования их в качестве средств биоконтроля.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

киллерные токсины дрожжей, фунгицидные свойства дрожжей, фитопатогенные грибы.

1

2

BIOTECHNOLOGICAL AND MICROBIOLOGICAL ASPECTS

Killer Toxins of Ascomycete Yeast Suppressing Phytopathogenic Fungi Botrytis cinerea

1 Russian Biotechnological University (ROSBIOTECH), Moscow, Russia

2 Russian State Collection of Industrial Microorganisms National Bio-Resource Center (BRC VKPM), "Kurchatov Institute" -GOSNIIGENETIKA National Research Center, Moscow, Russia

CORRESPONDENCE: Valeria A. Shagalova

E-mail: shagalovalira@gmail.com

FOR CITATIONS:

Shagalova, V.A., Vustin, M.M., & Mashentseva, N.G. (2023). Killer Toxins of Ascomycete Yeast Suppressing Phytopathogenic Fungi Botrytis Cinerea. Storage and Processing of Farm Products, (2), 146-162. https://doi.org/10.36107/ spfp.2023.440

RECEIVED: 05.06.2023 ACCEPTED: 27.07.2023 PUBLISHED: 30.07.2023

DECLARATION OF COMPETING INTEREST: none declared.

FUNDING

The work was carried out with the financial support of the state represented by the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Agreement No. 075-15-2021-1053.

Valeria A. Shagalova1, Mikhail M. Vustin2, Natalia G. Mashentseva1

ABSTRACT

Background: The problem of contamination of agricultural crops and plant raw materials by spoilage microorganisms is urgent - the damage caused by them to agriculture is growing from year to year. The use of pesticides can negatively affect the quality of raw materials and the health of consumers. A unilateral approach to solving this issue does not lead to positive results. Yeast killer toxins (KT) are of considerable interest for biotechnology as drugs that suppress the activity of pathogens.

Purpose: The purpose of this study is to screen ascomycete yeast strains from the collection of the National Bioresource Center of the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms of the Kurchatov Institute Research Center, which exhibit the greatest killer activity in relation to phytopathogenic fungi of the Botrytis cinerea species, as well as to determine the factors affecting its effectiveness.

Materials and Methods: KT activity was determined on a thin agar on a full yeast medium YPD with the addition of 0,5 ml / l of 88% lactic acid solution, pH = 4,5. The value of the hydrogen index 4,5 was chosen as optimal for most of the studied yeast species.

Results: The largest growth suppression zones of Botrytis cinerea were given by Schwanniomyces occidental's strains Y1-627, Y-1628, Y-1629, Y-1638, Y-1640, Y-1641, Metschnikowia pulcherrima Y-3698. Also small suppression zones were observed in Cyberlindnera mrakii Y-1211, Wickerhamomyces anomalus Y-201, Y-3836, Y-4562, Y-1182, Debaryomyces hansenii Y-1681 strains. During the test on the remaining strains, the effect of CT was not revealed.

Conclusion: In this study, it was found that killer yeasts from the collection of the BRC VKPM are effective against Botrytis cinerea F-1006, which gives the potential for their development and use as means of biocontrol.

KEYWORDS

yeast killer toxin, fungicidal properties of killer yeast, phytopathogenic fungi

ВВЕДЕНИЕ

В научной литературе в области микробиологии и медицины все чаще упоминается о киллерной активности дрожжей в отношении патогенных грибов. Дрожжи — это одноклеточные организмы, которые широко используются в пищевой промышленности для производства хлеба, пива и вина. Некоторые виды дрожжей проявляют киллерную активность — способность подавлять родственные виды и другие микроорганизмы, в том числе патогенные грибы и бактерии. Дрожжи-киллеры выделяют так называемые киллер-токсины или микоцины, которые подавляют рост или жизнеспособность близлежащих чувствительных клеток микроорганизмов. Предполагается, что токсины являются инструментами для интерференционной конкуренции в различных дрожжевых сообществах (Boynton, 2019).

С точки зрения биотехнологии, киллерные дрожжи полезны благодаря своей противогрибковой/ антимикробной активности (Sheppard & Dikicioglu, 2019). Они могут быть использованы в качестве консервантов для продуктов питания, так как способны предотвратить рост и размножение нежелательных микроорганизмов. Кроме того, КТ дрожжей могут быть применены в качестве альтернативы традиционным антимикотикам для лечения грибковых инфекций, таких как кандидоз, аспергиллез, криптококкоз и другие.

Виноградарство и виноделие во всем мире несут экономические потери из-за гнили гроздей винограда. В основном за появление гнили на винограде ответственны мицелиальные грибы, наиболее распространенным из которых является Botrytis cinerea (серая плесень). Короткие пептиды дрожжей ингибируют развитие чувствительных клеток,

воздействуя на основные компоненты клеточной стенки грибов.

Использование киллерных дрожжей может иметь большое практическое значение для сельского хозяйства, пищевой промышленности и медицины. Цель исследования — провести скрининг штаммов аскомицетовых дрожжей, обладающих кил-лерной активностью, из коллекции Национального биоресурсного центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» и отобрать наиболее активные по отношению к фитопатогенным грибам Botrytis cinerea.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ

Дрожжи-убийцы распространены в окружающей среде повсеместно. Они были обнаружены на всех континентах, включая Антарктиду. Однако природные штаммы изучены слабо по сравнению с лабораторными образцами. Кроме того, КТ могут выполнять функции, выходящие за рамки использования их в конкурентной борьбе (Becker & Schmitt, 2017).

Открытие пивоваренных штаммов Saccharomyces cerevisiae, выделяющих токсин, в середине шестидесятых годов прошлого века положило начало интенсивным исследованиям в области вирусологии дрожжей. К настоящему времени идентифицированы четыре различных токсина-убийцы S. cerevisiae (K28, K1, K2 и Klus), кодируемые цитоплазматиче-скими двухцепочечными РНК-содержащими вирусами семейства Totiviridae (Sheppard & Dikicioglu, 2019). Список известных дрожжей-продуцентов токсинов постоянно пополняется (Таблица 1). С мо-

Таблица 1

Дрожжи, продуцирующие КТ, и некоторые свойства токсинов

Продуцент Молекулярная масса Оптимальное значение температуры культивирования Локализация гена

Saccharomyces cerevisiae K28 (37,6 кДа), K1 (19 кДа), K2 (38,7 кДа) 60 °C дцРНК вирусоподобных частиц

Wickerhamomyces anomalus 47,0 кДа 40 °C Хромосомная ДНК

Pichia farinosa 14,0 кДа 16 °C Хромосомная ДНК

Pichia membranifaciens 8 кДа Неизвестно дцДНК плазмида

Окончание Таблицы 1

Продуцент Молекулярная масса Оптимальное значение температуры культивирования Локализация гена

Williopsis saturnus 11,0 кДа 16 °C Хромосомная ДНК

Kluyveromyces lactis (99 кДа), (30 кДа) и (27,5 кДа) субъединицы Неизвестно Линейная плазмида pGKL1

Debaryomyces hansenii 23 кДа 20 °C Хромосомная ДНК

Hansenula mrakii 10,7 кДа 60 °C Хромосомная ДНК

Schwanniomyces occidentalis 7,4 и 4,9 кДа 40 °C Неизвестно

Примечание. Из «Yeast killer toxins, molecular mechanisms of their action and their applications», by G. L. Liu, Z. Chi, G. Y. Wang, Z. P. Wang, Y. Li, Z. M. Chi, 2015, Critical Reviews in Biotechnology, 35(2), 222-234 (https://doi.org/10.3109/07388551.2013.833582). Copyright 2015 by Informa UK Limited.

мента открытия штаммов Saccharomyces cerevisiae, способных секретировать внеклеточные токсины, было получено много информации, существенно расширяющей знания по фундаментальным аспектам клеточной биологии и генетики дрожжей.

Дрожжи могут обладать дополнительной генетической информацией в виде цитоплазматических линейных молекул дцДНК, называемых вирусоподобными элементами. Некоторые из них кодируют токсины-убийцы. Известно о распространенности таких элементов в дрожжах Debaryomyces hansenii, депонированных в коллекциях культур, а также в штаммах, выделенных из голубых сыров (Polomska et al., 2021). КТ дрожжей Metschnikowia pulcherrima были протестированы против трех широко распространенных микроорганизмов: Escherichia coli, Micrococcus luteus и Candida albicans. Токсин-убийца проявлял ингибирующую активность только в отношении M. luteus (De Lima et al., 2013).

На примере дрожжей Pichia membranifaciens были описаны два токсина — PMKT и PMKT2. Они представляли собой белки с низкой молекулярной массой, которые связывались с первичными рецепторами, расположенными в структуре клеточной стенки чувствительных штаммов дрожжей — линейными (1 ^ 6)-р^-глюканами и маннопроте-инами для PMKT и PMKT2 соответственно. Было предложено несколько применений для микоцинов P. membranifaciens, начиная от биоконтроля патогенов растений до и после сбора урожая и заканчивая применением во время ферментации и выдержки вина (ингибирование Botrytis cinerea, Brettanomyces bruxellensis и др.) (Buyuksint & Kulea^an, 2022). Также Belda с соавторами в 2017 году было проанали-

зировано в общей сложности 580 штаммов дрожжей, выделенных на бразильского штата Сеара, которые были оценены согласно способности продуцировать КТ. Из них для 29 штаммов установлен положительный результат на фенотип киллера. Пять штаммов дрожжей обеспечили значительное снижение роста мицелия и прорастания конидий Colletotrichum gloeosporioides in vitro. Так, дрожжи Meyerozyma guilliermondii были способны снижать рост мицелия грибов на твердой среде (картофель-но-декстрозный агар, PDA) на 60% и блокировать на 100% прорастание конидий на жидкой среде (картофельно-декстрозный бульон, PDB) (Belda et al., 2017).

Дрожжи Wickerhamomyces anomalus способны продуцировать микоцины с высоким содержанием антимикробных веществ, поскольку даже при высоких разведениях они ингибировали Acinetobacter baumannii. В твердой среде можно было наблюдать ингибирование A. baumannii, вызванное диффузией КТ в агаре. Наконец, супернатанты не были цитотоксичными при тестировании на эритроцитах человека. Согласно полученным данным, микоцины W. anomalus оказались эффективными при разработке новых противомикробных веществ (Mazzucco et al., 2019).

Дрожжи Wickerhamomyces anomalus играют важную роль в борьбе с патогенными дрожжами и бактериями в пищевой промышленности (Muccilli et al., 2013). Установлен штамм Wickerhamomyces anomalus VKM Y-159, продуцирующий два типа токсина, обозначенных как WAKT a и WAKT b, кодируемых хромосомными генами. Токсин WAKT a термостойкий, чувствительный к проназе, активен в ди-

апазоне рН 3-4, действует на несколько дрожжей, включая патогенные виды Candida, в то время как токсин WAKT b устойчив к протеазам и термостабилен, действует в диапазоне рН 3-7 на два вида дрожжей, Candida alai и Candida norvegica. Быстрое уменьшение количества жизнеспособных клеток после обработки токсином демонстрирует, что оба токсина обладают цитолитическим действием (Farkas et al., 2012).

Немалый интерес представляет антагонистическая активность Williopsis saturnus. В качестве альтернативного решения для предотвращения роста плесени была разработана противогрибковая пищевая пленка на основе концентрата сывороточного протеина путем включения в нее Williopsis saturnus var. saturnus (0, 3, 7 и 9 КОЕ/см2). Противогрибковые свойства пленок против Penicilium expansum и Aspergillus niger были проанализированы с использованием метода дисковой диффузии (Karabulut & Cagri-Mehmetoglu, 2018).

Рисунок 1

Трехмерные структуры основных токсинов-киллеров HM-1 и SMKT

Разнообразие киллерных токсинов дрожжей

КТ дрожжей представляют собой довольно разнородную группу белков. Предполагается, что они неоднократно и независимо возникали в ходе эволюции дрожжей. Со структурной точки зрения токсины-убийцы могут быть сгруппированы в три различных класса: небольшие белки с одной субъединицей, (гетеро-) димерные белки и мультимер-ные белковые комплексы. Для некоторых КТ были определены трехмерные структуры и наблюдались разнообразные паттерны сворачивания. Например, токсин HM-1 Cyberlindnera mrakii (ранее известный как Hansenula mrakii) и SMKT Millerozyma farinosa (ранее известный как Pichia farinosa) представляли собой небольшие осн0вные белки (<20 кДа), но структурно они, как оказалось, имеют совершенно разные схемы сворачивания. HM-1 демонстрирует полностью ß-складчатую структуру, подобную кристаллинам хрусталика глаза, тогда как SMKT представляет собой белок из двух субъединиц с участками a-спиралей и ß-складчатых структур. Общей чертой является наличие большого количества внутримолекулярных дисульфидных связей (Рисунок 1), которые, вероятно, способствуют чрезвычайной термо- и рН-стабильности, характерной для некоторых токсинов, в частности HM-1 (Klassen et al., 2017).

Примечание: вверху: модели 1WKT и 1KVD из банка данных белков. Внизу: «проволочное» изображение тех же структур. Изображения были сгенерированы с помощью средства просмотра NGL (WebGL).

Из «Antagonistic Interactions and Killer Yeasts, by R. Klassen, R. Schaffrath, P. Buzzini, P. F. Ganter, 2017, Yeasts in natural ecosystems: Ecology (pp. 229-275) (https://doi.org/10.1007/978-3-319-61575-2_9). Copyright 2017 by Springer.

Механизм действия микоцинов и их химическая природа

Существуют первичный и вторичный типы рецепторов к КТ. Первичный обычно располагается на клеточной стенке, а вторичный — на плазматической мембране (Liu et al., 2017).

Первичные рецепторы

Основными компонентами клеточной стенки дрожжей являются (1,3)-Ь^^-глюкан, (1,6)^^-глюкан, маннопротеины и хитин. Известно, что некоторые компоненты клеточных стенок могут быть рецепторами токсина (Liu et al., 2017).

Вторичные рецепторы

После связывания с первичным рецептором в клеточной стенке чувствительных клеток КТ транслоцируется на вторичные рецепторы, локализованные в плазматической мембране, что является энергозависимой стадией. Обычно КТ, например зигоцин, имеют катионный суммарный заряд, в то время как плазматическая мембрана чувствительных клеток заряжена отрицательно. В связи с этим КТ могут обладать сродством к вторичным рецепторам, что облегчает адсорбцию токсина на мембране-мишени чувствительных клеток.

Считается, что КТ убивают чувствительные к ним клетки посредством различных механизмов, таких как ингибирование репликации ДНК, индукция изменений проницаемости мембран, остановка клеточного цикла в фазе G1 и другие (Рисунок 2). Более того, в некоторых случаях токсин может нарушать синтез клеточной стенки путем ингиби-рования р-1,3-глюкансинтазы или путем гидролиза основных компонентов клеточной стенки в чувствительных клетках (Liu et al., 2015). Так, K28 представляет собой уникальный пример вирусного токсина, продуцируемого инфицированными дрожжами, который проникает в чувствительную клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и достигает своей внутриклеточной мишени (мишеней) (Santos et al., 2002; Santos et al., 2007).

Выявлено, что токсин Debaryomyces hansenii в основном адсорбируется (1 ^ 6)-р^-глюканами. Этот низкомолекулярный белок, вероятно, кодируется хромосомными генами. Данное исследование является первым, в котором идентифицировано место связывания промышленно значимого КТ с клеточной стенкой (Santos et al., 2007).

Также показано, что PMKT (каналообразующий КТ, выделяемый Pichia membranifaciens) обладал антимикробной активностью в отношении дрожжей и мицелиальных грибов (Santos & Marquina, 2011; Hicks et al., 2021).

Рисунок 2

Механизм действия киллерных токсинов

Примечание: Из «Yeast killer toxins, molecular mechanisms of their action and their applications», by G. L. Liu, Z. Chi, G. Y. Wang, Z. P. Wang, Y. Li, Z. M. Chi, 2015, Critical Reviews in Biotechnology, 35(2), 222-234 (https://doi.org/10.3109/07388551.2013.83358 2). Copyright 2015 by Taylor & Francis.

Влияние рН на активность токсинов

Многие исследования указывают на то, что значительное влияние на результаты тестов оказывает водородный показатель среды. Наибольшая активность продуцируемых дрожжами токсинов наблюдается в узком диапазоне рН (4,5-6 ед.) (Таблица 2).

Опыты проводили в широком диапазоне температур и активной кислотности среды, оказывающих сильное влияние на определение фенотипа киллера. Предварительный скрининг дрожжей проводили на газонах Б. сегеу(з1ае АН22 (обычно используемых в качестве чувствительного к киллерам штамма) при значении рН 4,6, когда активно боль-

Таблица 2

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Активность некоторых киллерных дрожжей при различных значениях рН

Видовое название микроорганизма Значения pH

4,5 5 5,5 6 6,5

Saccharmyces cerevisiae + - - - -

Metschnikowia pulcherrima - + - - -

Wickerhamomyces anomalus + - - - -

Candida valida + + - - -

Pichia membranifaciens + - - - -

Debaryomyces hansenii + - - - -

Schwanniomyces occidentalis + - - - -

Kluyveromyces wickerhamii + - - - -

Kluyveromyces lactis + - - - -

Kluyveromyces marxianus + - - - -

Kluyveromyces drosophillarum + - - - -

Cyberlindera mrakii + - - - +

Cyberlindera saturnus + - - - -

Примечание. «+» - высокая активность токсина, «-» - низкая активность или ее отсутствие.

M3 «Yeast killer toxins, molecular mechanisms of their action and their applications», by G. L. Liu, Z. Chi, G. Y. Wang, Z. P. Wang, Y. Li, Z. M. Chi, 2015, Critical Reviews in Biotechnology, 35(2), 222-234 (https://doi.org/10.3109/07388551.2013.833582). Copyright 2015 by Taylor & Francis; «The oleaginous yeast Metschnikowia pulcherrima displays killer activity against avian-derived pathogenic bacteria», by R. H. Hicks, M. Moreno-Beltran, D. Gore-Lloyd, C. J. Chuck, D. A. Henk, 2021, Biology, 10(12), Article 1227 (https://doi.org/10.3390/ biology10121227). Copyright 2021 by MDPI; «The biology of Pichia membranifaciens killer toxins», by I. Belda, J. Ruiz, A. Alonso, D. Marquin, A. Santos, 2017, Toxins, 9(4), Article 112 (https://doi.org/10.3390/toxins9040112). Copyright 2017 by MDPI; «Kluyveromyces wickerhamii killer toxin: Purification and activity towards brettanomyces/dekkera yeasts in grape must», by F. Comitini, M. Ciani, 2011, FEMS Microbiology Letters, 316(1), 77-82 (https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02194.x). Copyright 2011 by MDPI; «Immuno-crossreactivity of an anti-Pichia anomala killer toxin monoclonal antibody with a Williopsis saturnus var. mrakii killer toxin», by C. Guyard, P. Evrard, A. M. Corbisier-Colson, H. Louvart, E. Dei-Cas, F. D. Menozzi, L. Polonelli, J. Cailliez, 2001, Medical Mycology, 39(5), 395-400 (https://doi.org/10.1080/mmy.39.5.395.400). Copyright 2001 by MDPI; «Williopsis saturnus yeast killer toxin does not kill Streptococcus pneumoniae», by I. Ochigava, P. J. Collier, G. M. Walker, R. Hakenbeck, 2011, Antonie van Leeuwenhoek, 99(3), 559-566 (https://doi.org/10.1007/s10482-010-9524-3). Copyright 2011 by MDPI; «Killer toxins of Candida utilis 22 and Kluyveromyces marxianus and their potential applications as biocontrol agents», by M A. Sanaa, M. H. Zeineb, M. I. Fatma, S. Z. Sanaa, 2015, Egyptian Journal of Biological Pest Control, 25(2), 317-325. Copyright 2015 by MDPI.

шинство зарегистрированных киллерных дрожжей (Banjara et al., 2016; Conti et al., 1998).

Была обнаружена взаимосвязь между чувствительным штаммом и оптимальным рН для проявления киллерной активности. Примером является изо-лят Pichia anomala A5, оптимальный рН которого составлял 4,2 для Saccharomyces cerevisiae, 5,0 для Rhodotorula sloffiae и 4,2-4,6 для Candida albicans (Chen & Chou, 2017; De Ullivarri et al., 2020; Dlamini et al., 2008).

Согласно данным литературы, большинство токсинов стабильны и действуют только при кислых

значениях рН и низких температурах, например, при рН = 4,0. Оптимальная киллерная активность КТ, продуцируемого Pichia membranifaciens CYC 1106, наблюдалась при температуре до 20 °С, а киллерная активность была выше в кислой среде. Выше рН 4,5 активность резко снижалась и была едва заметна при рН 6,0. Оба КТ Kwkt из K. wickerhamii и Pikt из W. anomalus сохраняли свою активность в диапазоне рН, совместимом с условиями производства вина. Более того, Pikt оказался более устойчив при повышенной температуре (35 °C), чем Kwkt. Фунгицидное действие, оказываемое Pikt и Kwkt против Dekkera bruxellensis в вине, сохраняется не менее 10 дней. Таким обра-

зом, эти два КТ имеют потенциальное применение при выдержке и хранении вина.

Сообщается, что Debaryomyces hansenii продуцирует микоцины, эффективные против других видов дрожжей. Изоляты D. hansenii были получены из 22 сыров и оценены на киллерную активность в отношении Candida albicans и Candida tropicalis в широком диапазоне температур и значений рН. Для 23 штаммов показана киллерная активность как против C. albicans, так и C. tropicalis, которая зависела от рН и температуры. Ни у одного штамма не наблюдалась киллерная активность при рН > 6,5 или температуре Х35 °C (физиологические условия в желудочно-кишечном тракте человека) (Banjara et al., 2017).

Однако наиболее стабильными являются КТ Hansenula mrakii (стабильны при рН 2,0-11,0 и не денатурируют после нагревания при 60 °C в течение 1 ч) и Hansenula saturnus (устойчивы при рН 3,0-11,0 и сохраняют стабильность на 75% при 80 °C в течение 1 ч). КТ Tilletiopsis albescens стабилен в интервале активной кислотности от 3,5 до 8,0 ед. рН. Убивающая активность очищенного КТ, продуцируемого Kluyveromyces siamensis HN12-1, в отношении дрожжей Metschnikowia bicuspidata WCY была самой высокой при инкубации при 25 °C и рН 4,0 (Liu et al., 2015; Baeza et al., 2008).

Область применения

Киллерный феномен широко распространен среди дрожжей, и на сегодняшний день описано около 100 видов дрожжей с таким фенотипом. В спектр действия вырабатываемых ими КТ часто попадают и патогенные микроорганизмы. Таким образом, они обладают потенциалом в качестве природных противомикробных препаратов в пищевых продуктах и для биологической борьбы с патогенами растений, а также терапевтических средств против инфекций животных и человека. Несмотря на широкий спектр возможных областей применения, их использование на промышленном уровне все еще находится в зачаточном состоянии (Mannazzu et al., 2019).

Порча вина, связанная с Brettanomyces bruxellensis, является серьезной проблемой для виноделов. Поэтому чрезвычайно важен эффективный и на-

дежный метод контроля размножения этих дрожжей. Текущее исследование было сосредоточено на выявлении и характеристике токсинов-убийц, которые являются противомикробными соединениями, обладающими потенциалом подавления B. bruxellensis в вине. Были идентифицированы и частично охарактеризованы два КТ (CpKT1 и CpKT2), выделенные из винных дрожжей Candida pyralidae (Mehlomakulu et al., 2014).

Антагонистические эффекты Debaryomyces hansenii KI2a, D. hansenii MI1a и Wickerhamomyces anomalus BS91 были протестированы против Monilinia fructigena и Monilinia fructicola в исследованиях in vitro и in vivo. Антагонистические штаммы D. hansenii и W. anomalus могут быть предложены в качестве активных ингредиентов для разработки биофунгицидов против видов Monilinia, которые являются причиной значительных экономических потерь косточковых культур (Grzegorczyk et al., 2016).

КТ, вырабатываемый дрожжами Metschnikowia pulcherrima, был очищен и добавлен в готовые к приготовлению мясные полуфабрикаты для повышения их микробиологической безопасности и продления срока годности. Добавление ингиби-рующего соединения в фарш снижало общее количество аэробных мезофильных бактерий, дрожжей и плесневых грибов, а также молочнокислых бактерий (Büyüksirit & Kulea^an, 2021).

Рассматриваются возможные последствия применения феномена дрожжевых киллеров в борьбе с инфекционными заболеваниями. Особый упор делается на некоторые токсины-киллеры широкого спектра действия (KTS), продуцируемые Wickerhamomyces anomalus и другими родственными видами. Перспектива применения этих КТ в области медицины представлена с учетом:

(1) прямого использования штаммов-киллеров, в частности, для симбиотической борьбы с болезнями, переносимыми членистоногими;

(2) прямого использования КТ в качестве экспериментальных терапевтических агентов;

(3) производство через идиотипическую сеть иммунологических производных KTs и их использование в качестве потенциальных противоинфекционных терапевтических средств.

Также описаны исследования иммунологических производных KT в контексте разработки вакцины (Giovati et al., 2021).

Помимо прочего штаммы W. anomalus, способные продуцировать KT, называемые «дрожжами-убийцами», обладают высокой конкурентоспособностью в окружающей среде. Разнообразные штаммы W. anomalus были выделены из различных местообитаний, в том числе из насекомых. Дрожжи, ассоциированные с комарами, обладают антимикробной активностью, что делает эти дрожжи достойными дальнейших исследований, учитывая их потенциал в качестве средства симбиотической борьбы с малярией (Cappelli et al., 2014).

Kpkt — это токсин-убийца дрожжей, вырабатываемый естественным путем Tetrapisispora phaffii, который может найти применение в виноделии благодаря своей антимикробной активности в отношении связанных с вином дрожжей, включая Kloeckera/Hanseniaspora, Saccharomycodes и Zygosaccharomyces. Ген, кодирующий Kpkt, был экспрессирован в Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris), что является основой биореакторного производства рекомбинантного токсина rKpkt. Для получения готового к применению препарата rKpkt бесклеточный супернатант рекомбинантно-го клона-убийцы K. phaffii концентрировали в 80 раз и лиофилизировали. Полученный препарат легко растворялся в стерильной дистиллированной воде и сохранял свою убойную активность до шести месяцев при температуре 4 °С. При добавлении в виноградное сусло он оказывал летальное действие на дикие винные дрожжи, одновременно являясь совместимым с ферментативной активностью закваски на основе штаммов Saccharomyces cerevisiae. Кроме того, препарат оказывал сильное бактерицидное действие на различные виды бактерий, включая молочнокислые бактерии и патогены, значимые для пищевой промышленности. Напротив, он не оказал летального действия на мицелиальные грибы и два вида насекомых (Ceratitis capitata и Musca domestica), которые могут служить моделью для биомедицинских исследований. Так, производство в биореакторах и ли-офилизация представляют собой перспективный вариант использования этого КТ, который может найти применение для борьбы с микробными загрязнениями в винодельческой и пищевой промышленности (Carboni et al., 2020).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты

Исследовались ранее отобранные наиболее активные штаммы различных видов дрожжей-продуцентов КТ из коллекции БРЦ ВКПМ (Таблица 3).

Таблица 3

Киллерные штаммы дрожжей

Видовое название Номер штамма

Metschnikowia pulcherrima Y-735, Y-3698

Wickerhamomyces anomalus Y-736, Y-737, Y-738, Y-201,

Y-1006

Pichia membranifaciens Y-835

Debaryomyces hansenii Y-1682, Y-1683, Y-1681

Schwanniomyces vanrijiae Y-1170

Schwanniomyces occidentalis Y-1627, Y-1628, Y-1629,

Y-1638, Y-1639, Y-1640,

Y-1641

Cyberlindnera mrakii Y-1209, Y-1211

В качестве тест-культуры для изучения действия КТ дрожжей на фитопатогенные грибы был использован плесневый гриб Botrytis cinerea F-1006 — возбудитель «серой гнили» многих сельскохозяйственных культур (Bi et al., 2023).

Материалы

Для культивирования дрожжей при различных температурах использовался термостат ТС-1/80 (Смоленское СКТБ СПУ, Смоленск, Россия). Определение значений pH производился при помощи индикаторных полосок высокой точности Diversey-MN92110 (Macherey-Nagel, Германия). Для подтверждения видовой принадлежности дрожжей методом микроскопирования использовался микроскоп биологический Микромед 2 (2-20 inf.) (ООО «Наблюдательные приборы», Санкт-Петербург, Россия).

Методы

Определение активности КТ проводили на тонком агаре на полной дрожжевой среде YPD (г/1000 см3: пептон — 10,0, глюкоза — 20,0, дрожжевой экстракт — 5,0, агар-агар — 20,0, дистиллированная вода — 1000 см3) с добавлением 88 % раствора молочной кислоты в количестве 2,0 см3 на 1 000 см3, pH = 4,5. Значение водородного показателя 4,5 выбрано как оптимальное для большинства исследуемых видов дрожжей.

В качестве тест-культур при отборе лучших по уровню киллерной активности штаммов использовали сверхчувствительные ко многим КТ культуры дрожжей Candida nitratophila ВКПМ Y-2123 и Candida tenuis ВКПМ Y-739.

Грибы Botrytis cinerea F-1006 перед проведением теста культивировали на среде YPD в течение 120 ч.

Максимальное значение продуцируемого КТ у всех дрожжей наблюдалось в экспоненциальной фазе роста дрожжей и соответствовало возрасту суточной культуры.

Тест на определение оптимального значения pH для продуцирования КТ проводили на среде YPD на основе цитратно-фосфатного буфера. Раствор цитрата с концентрацией 0,1 М и раствор фосфата натрия смешивали в разных отношениях для получения активной кислотности среды, равной 4; 4,4; 5 и 5,5 ед. рН.

Процедура

На агаризованную полную дрожжевую среду YPD в центре чашки Петри помещали часть биомассы микроскопического гриба, взятой вместе с агаром. После этого бляшками (5 мм) наносили суточную биомассу киллерных дрожжей, равноудаленных от тест-культуры примерно на 2 см. Расположение образцов схематично представлено на Рисунке 3.

Культивирование проводили в течение 120 ч при температуре 30 °С. По окончанию культивирования отмечали наличие или отсутствие киллер-ной активности по появлению или отсутствию зон подавления роста, диаметр которых коррелировал с киллерной активностью исследуемого штамма.

Рисунок 3

Схема распределения образцов на чашке Петри

Примечание: 1 — биомасса дрожжей-продуцентов КТ, 2 — тест-культура

Для выявления благоприятных условий для синтеза КТ были проведены тесты на чувствительность при различных значениях pH (4/4,5/5/5,5) и температуры (15 °C/20 °C/25 °C/30 °C).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Было обнаружено, что часть штаммов образовывала отчетливые зоны просветления, указывающие на разрушение клеток и цидный эффект. Часть штаммов образовывала вокруг себя зоны неполного подавления роста грибной культуры, что обусловлено статическим эффектом КТ конкретного штамма.

Наибольшие зоны полного подавления роста Botritis cinerea выявлены для штаммов Schwanniomyces occidentalis Y-1627, Y-1628, Y-1629, Y-1638, Y-1640, Y-1641 и Metschnikowia pulcherrima Y-3698. Небольшие зоны подавления роста наблюдали у Cyberlindnera mrakii Y-1211, Wickerhamomyces anomalus Y-201, Y-3836, Y-4562, Y-1182 и Debaryomyces hansenii Y-1681. При проведении теста на остальных штаммах действие КТ не выявлено (Рисунок 4).

При исследовании влияния рН на продуцирование дрожжами КТ установлено, что значение pH 4,5 является оптимальным для большинства продуцентов КТ (Таблица 4). Данная закономерность наглядно представлена на Рисунке 5.

Рисунок 4

Зоны подавления роста тест-культуры Botrytis cinerea F-1006 киллер-токсинами штаммов Schwanniomyces occidentalis Y-1627, Y-1628, Y-1629 Y-1638, Y-1640, Y-1641, Cyberlindnera mrakii Y-1211, Wickerhamomyces anomalus Y-201, Y-3836, Y-4562, Y-1182, Debaryomyces hansenii Y-1681

Рисунок 5

Действие КТ штаммов Schwanniomyces occidentalis Y-1638, Y-1640, Y-1641, Metschnikowia pulcherrima Y-3698 на тест-культуру Botrytis cinerea F-1006 при различных значениях pH

Примечание: А - статическое действие КТ, Б - фунгицидное Примечание: а - pH 4; б - pH 4,5; в - pH 5; г - pH 5,5 действие

Таблица 4

Киллерная активность дрожжей при различных значениях рН

Значение pH

№ штамма 4 4,5 5 5,5

Wickerhamomyces anomalus Y-736 + + - -

Wickerhamomyces anomalus Y-737 + + - -

Wickerhamomyces anomalus Y-738 + + - -

Schwanniomyces occidentalis Y-1627 - + - -

Schwanniomyces occidentalis Y-1628 - + - -

Schwanniomyces occidentalis Y-1209 + + + -

Cyberlindnera mrakii Y-1211 + + - -

Wickerhamomyces anomalus Y-201 + + + +

Wickerhamomyces anomalus Y-483 - + - -

Wickerhamomyces anomalus Y-1182 - + + -

Schwanniomyces occidentalis Y-1638 + + + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1640 + + + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1641 + + + +

Debaryomyces hansenii Y-1681 + + - -

Metschnikowia pulcherrima Y-3698 - - - -

Wickerhamomyces anomalus Y-3896 - + - -

Wickerhamomyces anomalus Y-4562 - + - -

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Примечание: «+» - высокая активность КТ, «- -» - низкая активность или ее отсутствие.

https://doi.org/10.36107/spfp.2023.440 15б ХИПС № 2 I 2023

Таблица 5

Киллерная активность дрожжей при различной температуре

№ штамма Температура культивирования, °C

15 20 25

Wickerhamomyces anomalus Y-736 + + -

Wickerhamomyces anomalus Y-737 + + -

Wickerhamomyces anomalus Y-738 + + -

Schwanniomyces occidentalis Y-1627 + + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1628 - + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1209 - + +

Cyberlindnera mrakii Y-1211 + + -

Wickerhamomyces anomalus Y-201 + + +

Wickerhamomyces anomalus Y-483 - + -

Wickerhamomyces anomalus Y-1182 - + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1638 + + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1640 + + +

Schwanniomyces occidentalis Y-1641 + + +

Debaryomyces hansenii Y-1681 - + +

Metschnikowia pulcherrima Y-3698 - + -

Wickerhamomyces anomalus Y-3896 - + +

Wickerhamomyces anomalus Y-4562 - + +

Примечание:«+» — высокая активность КТ, «-» — низкая активность или ее отсутствие.

В ходе проведения теста на продуцирование КТ дрожжами при различных значениях температуры было обнаружено, что при 15-25 °C наблюдается более быстрый и интенсивный рост тест-культуры (Таблица 5). При этом также происходит формирование зон подавления тест-культуры Botrytis cinerea.

В большинстве случаев виден статический эффект, за исключением штамма Schwanniomyces occidentalis Y-1640, который оказывает фунгицидное действие. Других различий при смене температурного режима не обнаружено (Рисунок 6).

Рисунок 6

Действие КТ штаммов Schwanniomyces occidental's Y-1638, Y-1640, Y-1641, Metschnikowia pulcherrima Y-3698 на тест-культуру Botrytis cinerea F-1006 при температурах а - 15 °C, б -20 °C и в - 25 °C

Steel с соавторами в 2013 году сообщили об исследовании дрожжей Candida oleophila, Wickerhamomyces anomalus и Pichia kluyveri как о потенциальных антагонистах различных плесневых грибов, поражающих фрукты (виноград, яблоки, черешню и клубнику) (Steel et al., 2013). Из всех перечисленных аскомицетовых дрожжей-продуцентов КТ, упоминаемых в приведенных исследованиях, явным фун-гицидным действием обладают отдельные штаммы видов Meyerozyma guilliermondii, Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomalus, Williopsis saturnus var. saturnus, Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces wickerhamii (De Lima et al., 2013, Belda et al., 2017, Mazzucco et al.,2019, Karabulut & Cagri-Mehmetoglu, 2019, Büyüksirit & Kulea^an, 2021, Grzegorczyk et al., 2017).

На тест-культуре Botrytis cinerea Maluleke E. и соавторами ранее проведено исследование фунгицидной активности в экспериментах на других видах дрожжей, которое подтверждает полученные результаты. Проявление сильной глюканазной активности антагонистических штаммов обусловливает подавление фитопатогенных грибов, что свидетельствует о наличии фунгицидных свойств (Maluleke et al., 2022).

Дрожжи-антагонисты обладают несколькими механизмами действия, включая конкуренцию за питательные вещества и пространство, а также образование ферментов, разрушающих клеточную стенку чувствительных организмов (Freimoser et al., 2019). Можно предположить, что выявленные нами наиболее активные киллерные штаммы исследуемых дрожжей также обладают ß-глюканазой, действующей на глюканы клеточной стенки гриба Botrytis cinerea.

препаратов в качестве средств биоконтроля. Подбор оптимальных условий, таких как рН, температура, обусловил повышение активности киллерных дрожжей. Так, значение pH 4,5 оказалось оптимальным для большинства продуцентов КТ, а при 1525 °C наблюдался более быстрый и интенсивный рост тест-культуры. Эффективность данных видов дрожжей может быть дополнительно оценена in vivo в отношении ряда патогенов растений с учетом различных факторов окружающей среды.

Препараты, полученные на основе выбранных штаммов, могут быть использованы как для обработки растительного сырья, так и при лечении инфекционных заболеваний. Основой эффективности таких препаратов является отсутствие у патогенных организмов резистентности к КТ и устойчивость данных соединений к факторам внешней среды. Стоит отметить специфический механизм действия, при котором гибнут только чувствительные к токсинам клетки, что обеспечивает безопасность их использования.

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

Шагалова Валерия Алексеевна: верификация данных, формальный анализ, создание черновика рукописи, визуализация, проведение исследования.

Вустин Михаил Михайлович: руководство исследованием, методология, концептуализация, администрирование проекта.

Машенцева Наталья Геннадьевна: администрирование данных, создание рукописи и её редактирование.

ВЫВОДЫ

В соответствие с целью настоящего исследования проведен скриннинг штаммов дрожжей из коллекции БРЦ ВКПМ. Обнаружено, что Schwanniomyces occidentalis Y-1627, Y-1628, Y-1629, Y-1638, Y-1640, Y-1641, Metschnikowia pulcherrima Y-3698, Cyberlindnera mrakii Y-1211, Wickerhamomyces anomalus Y-201, Y-3836, Y-4562, Y-1182, Debaryomyces hansenii Y-1681 эффективны против Botrytis cinerea F-1006, что потенциально важно для разработки препаратов на их основе и использования этих

ЛИТЕРАТУРА

Baeza, M. E., Sanhueza, M. A., & Cifuentes, V. H. (2008). Occurrence of killer yeast strains in industrial and clinical yeast isolates. Biological Research, 41(2), 173-182. https:// doi.org/10.4067/S0716-97602008000200007

Banjara, N., Nickerson, K. W., Suhr, M. J., & Hallen-Adams, H. E. (2016). Killer toxin from several food-derived Debaryomyces hansenii strains effective against pathogenic Candida yeasts. International Journal of Food Microbiology, 222, 23-29. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2016.01.016

Becker, B., & Schmitt, M. J. (2017). Yeast killer toxin k28: Biology and unique strategy of host cell intoxication and killing. Toxins, 9(10), Article 333. https://doi.org/10.3390/ toxins9100333

Belda, I., Ruiz, J., Alonso, A., Marquin, D., & Santos, A. (2017). The biology of Pichia membranifaciens killer toxins. Toxins, 9(4), Article 112. https://doi.org/10.3390/toxins9040112

Bi, K., Liang, Y., Mengiste, T., & Sharon, A. (2023). Killing softly: A roadmap of Botrytis cinerea pathogenicity. Trends in Plant Science, 28(2), 211-222. https://doi.org/10.1016/j. tplants.2022.08.024

Boynton, P. J. (2019). The ecology of killer yeasts: Interference competition in natural habitats. Yeast, 36(8), 473-485. https://doi.org/10.1002/yea.3398

Büyüksmt, B. T., & Kuleafan, H. (2021). A natural approach, the use of killer toxin produced by Metschnikowia pulcherrima in fresh ground beef patties for shelf life extention. International Journal of Food Microbiology, 345, Article 109154. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109154

Büyüksirit, B. T., & Kuleafan, H. (2022). Purification and characterization of a Metschnikowia pulcherrima killer toxin with antagonistic activity against pathogenic microorganisms. Archives of Microbiology, 204(6), Article 337. https://doi.org/10.1007/s00203-022-02940-8

Cappelli, A., Ulissi, U., Valzano, M., Damiani, C., Epis, S., Gabrielli, M. G., Conti, S., Polonelli, L., Bandi, C., Favia, G., & Ricci, I. (2014). A Wickerhamomyces anomalus killer strain in the malaria vector Anopheles stephensi. PLoS One, 9(5), Article e95988. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0095988

Carboni, G., Fancello, F., Zara, G., Zara, S., Ruiu, L., Marova, I., Pinna, G., Budroni, M., Mannazzu, I. (2020). Production of a lyophilized ready-to-use yeast killer toxin with possible applications in the wine and food industries. International Journal of Food Microbiology, 335, Article 108883. https:// doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108883

Chen, P. H., & Chou, J. Y. (2017). Screening and identification of yeasts antagonistic to pathogenic fungi show a narrow optimal ph range for antagonistic activity. Polish Journal of Microbiology, 66(1), 101-106. https://doi. org/10.5604/17331331.1234997

Comitini, F., & Ciani, M. (2011). Kluyveromyces wickerhamii killer toxin: Purification and activity towards brettanomyces/ dekkera yeasts in grape must. FEMS Microbiology

Letters, 316(1), 77-82. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02194.X

Conti, S., Magliani, W., Gerloni, M., Salati, A., Dieci, E., Arseni, S., Fisicaro, P., & Polonelli, L. (1998). A transphyletic anti-infectious control strategy based on the killer phenomenon. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 22(1-2), 151161. https://doi.org/10.1111/j.1574-695x.1998.tb01200.x

De Lima, J. R., Gonçalves, L. R., Brandäo, L. R., Rosa, C. A., & Viana, F. M. (2013). Isolation, identification, and activity in vitro of killer yeasts against Colletotrichum gloeosporioides isolated from tropical fruits. Journal of Basic Microbiology, 53(7), 590-599. https://doi.org/10.1002/jobm.201200049

De Ullivarri, F. M., Bulacios, G. A., Navarro, S. A., Lanza, L., Mendoza, L. M., & Chalón, M. C. (2020). The killer yeast Wickerhamomyces anomalus Cf20 exerts a broad antiCandida activity through the production of killer toxins and volatile compounds. Medical Mycology, 258(8), 1102-1113. https://doi.org/10.1093/mmy/myaa011

Dlamini, N. R., & Dube, S. (2008). Studies on the physico-chemical, nutritional and microbiological changes during the traditional preparation of Marula wine in Gwanda, Zimbabwe. Nutrition & Food Science, 38(1), 61-69. https:// doi.org/10.1108/00346650810848025

Farkas, Z., Márki-Zay, J., Kucsera, J., Vàgvôlgyi, C., Golubev, W. I., & Pfeiffer, I. (2012). Characterization of two different toxins of Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala) VKM Y-159. Acta Biologica Hungarica, 63(2), 277-287. https:// doi.org/10.1556/abiol.63.2012.2.9

Freimoser, F. M., Rueda-Mejia, M. P., Tilocca, B., & Migheli, Q. (2019). Biocontrol yeasts: mechanisms and applications. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 35(10), Article 154. https://doi.org/10.1007/s11274-019-2728-4

Giovati, L., Ciociola, T., De Simone, T., Conti, S., & Magliani, W. (2021). Wickerhamomyces yeast killer toxins' medical applications. Toxins, 13(9), Article 655. https://doi. org/10.3390/toxins13090655

Grzegorczyk, M., Zarowska, B., Restuccia, C., & Cirvilleri, G. (2017). Postharvest biocontrol ability of killer yeasts against Monilinia fructigena and Monilinia fructicola on stone fruit. Food Microbiology, 61, 93-101. https://doi.org/10.1016/j. fm.2016.09.005

Guyard, C., Evrard, P., Corbisier-Colson, A. M., Louvart, H., Dei-Cas, E., Menozzi, F. D., Polonelli, L., & Cailliez, J. (2001). Immuno-crossreactivity of an anti-Pichia anomala killer toxin monoclonal antibody with a Williopsis saturnus var. mrakii killer toxin. Medical Mycology, 39(5), 395-400. https://doi.org/10.1080/mmy.39.5.395.400

Hicks, R. H., Moreno-Beltrán, M., Gore-Lloyd, D., Chuck, C. J., & Henk, D. A. (2021). The oleaginous yeast Metschnikowia pulcherrima displays killer activity against avian-derived pathogenic bacteria. Biology, 10(12), Article 1227. https:// doi.org/10.3390/biology10121227

Karabulut, G., & Cagri-Mehmetoglu, A. (2018). Antifungal, mechanical, and physical properties of edible film

containing williopsis saturnus var. saturnus antagonistic yeast. Journal of Food Science, 83(3), 763-769. https://doi. org/10.1111/1750-3841.14062

Klassen, R., Schaffrath, R., Buzzini, P., & Ganter, P. F. (2017). Antagonistic interactions and killer yeasts. In P. Buzzini, M.-A. Lachance, A. Yurkov (Eds.). Yeasts in natural ecosystems: Ecology (pp. 229-275). Springer. https://doi. org/10.1007/978-3-319-61575-2_9

Liu, G. L., Chi, Z., Wang, G. Y., Wang, Z. P., Li, Y., & Chi, Z. M. (2015). Yeast killer toxins, molecular mechanisms of their action and their applications. Critical Reviews in Biotechnology, 35(2), 222-234. https://doi.org/10.3109/0 7388551.2013.833582

Maluleke, E., Jolly, N. P., Patterton, H. G., & Setati, M. E. (2022). Antifungal activity of non-conventional yeasts against Botrytis cinerea and non-Botrytis grape bunch rot fungi. Frontiers in Microbiology, 13, Article 986229. https://doi. org/10.3389/fmicb.2022.986229

Mannazzu, I., Domizio, P., Carboni, G., Zara, S., Zara, G., Comitini, F., Budroni, M., & Ciani, M. (2019). Yeast killer toxins: From ecological significance to application. Critical Reviews in Biotechnology, 39(5), 603-617. https://doi.org/1 0.1080/07388551.2019.1601679

Mazzucco, M. B., Ganga, M. A., & Sangorrin, M. P. (2019). Production of a novel killer toxin from Saccharomyces eubayanus using agro-industrial waste and its application against wine spoilage yeasts. Antonie Van Leeuwenhoek, 112(7), 965-973. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01231-5

Mehlomakulu, N. N., Setati, M. E., & Divol, B. (2014). Characterization of novel killer toxins secreted by wine-related non-Saccharomyces yeasts and their action on Brettanomyces spp. International Journal of Food Microbiology, 188, 83-91. https://doi.org/10.1016/j. ijfoodmicro.2014.07.015

Muccilli, S., Wemhoff, S., Restuccia, C., & Meinhardt, F. (2013). Exoglucanase-encoding genes from three Wickerhamomyces

anomalus killer strains isolated from olive brine. Yeast, 30(1), 33-43. https://doi.org/10.1002/yea.2935

Ochigava, I., Collier, P. J., Walker, G. M., & Hakenbeck, R. (2011). Williopsis saturnus yeast killer toxin does not kill Streptococcus pneumoniae. Antonie van Leeuwenhoek, 99(3), 559-566. https://doi.org/10.1007/s10482-010-9524-3

Polomska, X., Neuveglise, C., Zyzak, J., Zarowska, B., Casaregola, S., & Lazar, Z. (2021). New cytoplasmic virus-like elements (Vles) in the yeast Debaryomyces hansenii. Toxins, 13(9), Article 615. https://doi.org/10.3390/toxins13090615

Sanaa, M. A., Zeineb, M. H., Fatma, M. I., & Sanaa, S. Z. (2015). Killer toxins of Candida utilis 22 and Kluyveromyces marxianus and their potential applications as biocontrol agents. Egyptian Journal of Biological Pest Control, 25(2), 317-325.

Santos, A., & Marquina, D. (2011). The transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to proapoptotic concentrations of Pichia membranifaciens killer toxin. Fungal Genetics and Biology, 48(10), 979-989. https://doi.org/10.1016/j. fgb.2011.07.002

Santos, A., Marquina, D., Barroso, J., & Peinadom, J. M. (2002). Beta-D-glucan as the cell wall binding site for Debaryomyces hansenii killer toxin. Letters in Applied Microbiology, 34(2), 95-99. https://doi.org/10.1046/j.1472-765x.2002.01053.x

Santos, A., San Mauro, M., Abrusci, C., & Marquina, D. (2007). Cwp2p, the plasma membrane receptor for Pichia membranifaciens killer toxin. Molecular Microbiology, 64(3), 831-843. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05702.x

Sheppard, S., & Dikicioglu, D. (2019). Dynamic modelling of the killing mechanism of action by virus-infected yeasts. Journal of the Royal Society Interface, 16(152), Article 20190064. https://doi.org/10.1098/rsif.2019.0064

Steel, C. C., Blackman, J. W., Schmidtke L. M. (2013). Grapevine bunch rots: impacts on wine composition, quality, and potential procedures for the removal of wine faults. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(22), 5189-5206. https://doi.org/10.1021/jf400641r

REFERENCES

Occurrence of killer yeast strains in industrial and clinical yeast isolates. Biological Research, 41(2), 173-182. https:// doi.org/10.4067/S0716-97602008000200007

Banjara, N., Nickerson, K. W., Suhr, M. J., & Hallen-Adams, H. E. (2016). Killer toxin from several food-derived Debaryomyces hansenii strains effective against pathogenic Candida yeasts. International Journal of Food Microbiology, 222, 23-29. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2016.01.016

Becker, B., & Schmitt, M. J. (2017). Yeast killer toxin k28: Biology and unique strategy of host cell intoxication and killing. Toxins, 9(10), Article 333. https://doi.org/10.3390/ toxins9100333

Belda, I., Ruiz, J., Alonso, A., Marquin, D., & Santos, A. (2017). The biology of Pichia membranifaciens killer toxins. Toxins, 9(4), Article 112. https://doi.org/10.3390/toxins9040112

Bi, K., Liang, Y., Mengiste, T., & Sharon, A. (2023). Killing softly: A roadmap of Botrytis cinerea pathogenicity. Trends in Plant Science, 28(2), 211-222. https://doi.org/10.1016/j. tplants.2022.08.024

Boynton, P. J. (2019). The ecology of killer yeasts: Interference competition in natural habitats. Yeast, 36(8), 473-485. https://doi.org/10.1002/yea.3398

Büyüksirit, B. T., & Kuleafan, H. (2021). A natural approach, the use of killer toxin produced by Metschnikowia pulcherrima in fresh ground beef patties for shelf life extention. International Journal of Food Microbiology, 345, Article 109154. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109154

Büyüksirit, B. T., & Kuleafan, H. (2022). Purification and characterization of a Metschnikowia pulcherrima killer toxin with antagonistic activity against pathogenic

microorganisms. Archives of Microbiology, 204(6), Article 337. https://doi.org/10.1007/s00203-022-02940-8

Cappelli, A., Ulissi, U., Valzano, M., Damiani, C., Epis, S., Gabrielli, M. G., Conti, S., Polonelli, L., Bandi, C., Favia, G., & Ricci, I. (2014). A Wickerhamomyces anomalus killer strain in the malaria vector Anopheles stephensi. PLoS One, 9(5), Article e95988. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0095988

Carboni, G., Fancello, F., Zara, G., Zara, S., Ruiu, L., Marova, I., Pinna, G., Budroni, M., Mannazzu, I. (2020). Production of a lyophilized ready-to-use yeast killer toxin with possible applications in the wine and food industries. International Journal of Food Microbiology, 335, Article 108883. https:// doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108883

Chen, P. H., & Chou, J. Y. (2017). Screening and identification of yeasts antagonistic to pathogenic fungi show a narrow optimal ph range for antagonistic activity. Polish Journal of Microbiology, 66(1), 101-106. https://doi. org/10.5604/17331331.1234997

Comitini, F., & Ciani, M. (2011). Kluyveromyces wickerhamii killer toxin: Purification and activity towards brettanomyces/ dekkera yeasts in grape must. FEMS Microbiology Letters, 316(1), 77-82. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02194.x

Conti, S., Magliani, W., Gerloni, M., Salati, A., Dieci, E., Arseni, S., Fisicaro, P., & Polonelli, L. (1998). A transphyletic anti-infectious control strategy based on the killer phenomenon. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 22(1-2), 151161. https://doi.org/10.1111/j.1574-695x.1998.tb01200.x

De Lima, J. R., Gongalves, L. R., Brandao, L. R., Rosa, C. A., & Viana, F. M. (2013). Isolation, identification, and activity in vitro of killer yeasts against Colletotrichum gloeosporioides isolated from tropical fruits. Journal of Basic Microbiology, 53(7), 590-599. https://doi.org/10.1002/jobm.201200049

De Ullivarri, F. M., Bulacios, G. A., Navarro, S. A., Lanza, L., Mendoza, L. M., & Chalón, M. C. (2020). The killer yeast Wickerhamomyces anomalus Cf20 exerts a broad antiCandida activity through the production of killer toxins and volatile compounds. Medical Mycology, 258(8), 1102-1113. https://doi.org/10.1093/mmy/myaa011

Dlamini, N. R., & Dube, S. (2008). Studies on the physico-chemical, nutritional and microbiological changes during the traditional preparation of Marula wine in Gwanda, Zimbabwe. Nutrition & Food Science, 38(1), 61-69. https:// doi.org/10.1108/00346650810848025

Farkas, Z., Márki-Zay, J., Kucsera, J., Vágvolgyi, C., Golubev, W. I., & Pfeiffer, I. (2012). Characterization of two different toxins of Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala) VKM Y-159. Acta Biologica Hungarica, 63(2), 277-287. https:// doi.org/10.1556/abiol.63.2012.2.9

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Freimoser, F. M., Rueda-Mejia, M. P., Tilocca, B., & Migheli, Q. (2019). Biocontrol yeasts: mechanisms and applications. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 35(10), Article 154. https://doi.org/10.1007/s11274-019-2728-4

Giovati, L., Ciociola, T., De Simone, T., Conti, S., & Magliani, W. (2021). Wickerhamomyces yeast killer toxins' medical

applications. Toxins, 13(9), Article 655. https://doi. org/10.3390/toxins13090655

Grzegorczyk, M., Zarowska, B., Restuccia, C., & Cirvilleri, G. (2017). Postharvest biocontrol ability of killer yeasts against Monilinia fructigena and Monilinia fructicola on stone fruit. Food Microbiology, 61, 93-101. https://doi.org/10.1016/j. fm.2016.09.005

Guyard, C., Evrard, P., Corbisier-Colson, A. M., Louvart, H., Dei-Cas, E., Menozzi, F. D., Polonelli, L., & Cailliez, J. (2001). Immuno-crossreactivity of an anti-Pichia anomala killer toxin monoclonal antibody with a Williopsis saturnus var. mrakii killer toxin. Medical Mycology, 39(5), 395-400. https://doi.org/10.1080/mmy.39.5.395.400

Hicks, R. H., Moreno-Beltran, M., Gore-Lloyd, D., Chuck, C. J., & Henk, D. A. (2021). The oleaginous yeast Metschnikowia pulcherrima displays killer activity against avian-derived pathogenic bacteria. Biology, 10(12), Article 1227. https:// doi.org/10.3390/biology10121227

Karabulut, G., & Cagri-Mehmetoglu, A. (2018). Antifungal, mechanical, and physical properties of edible film containing williopsis saturnus var. saturnus antagonistic yeast. Journal of Food Science, 83(3), 763-769. https://doi. org/10.1111/1750-3841.14062