CC BY
67
ISSN 2304-9081
ЭЛЕКТРОННЫЙ ЖУРНАЛ
On-l i ne версия жу рнала на сайте
http://www.eimag.uran.ru
БЮЛЛЕТЕНЬ
ОРЕНБУРГСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН
2019
УЧРЕДИТЕЛЬ
ОРЕНБУРГСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УрО РАН
© Коллектив авторов, 2019 УДК 579.61
А.В. Валышев, К.Л. Чертков, Н.А. Валышева
АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КИЛЛЕРНЫХ ТОКСИНОВ ДРОЖЖЕЙ
Оренбургский федеральный исследовательский центр УрО РАН (Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН), Оренбург, Россия
В обзоре представлены данные о киллерных токсинах (КТ) дрожжей. Описаны источники выделения продуцентов, механизм действия и спектр антибактериальной активности КТ этой биотехнологически важной группы микроорганизмов.
Ключевые слова: дрожжи, грибы, бактериоцины, микоцины, киллерные токсины, антимикробное действие.
A.V. Valyshev, K.L. Chertkov, N.A. Valysheva ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF YEAST KILLER TOXINS
Orenburg Federal Research Center, UB RAS (Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, UB RAS), Orenburg, Russia
This review focuses on the yeast killer toxins (KTs). The sources of producers, mode of action, and antibacterial spectrum of KTs of this biotechnologically important group of microorganisms are described.
Key words: yeasts, fungi, bacteriocins, mycocins, killer toxins, antimicrobial action.
Феномен продукции некоторыми дрожжами киллерных токсинов (КТ), известных также как "микоцины", "зимоцины" и "зимоциды", описан в середине XX века [1, 2]. Киллерные дрожжи встречаются на всех континентах, включая Антарктиду, среди аскомицетов и базидиомицетов (табл. 1). Их источником являются разные объекты окружающей среды: поверхность листьев, опавшие листья (мёртвый покров), слизевый поток древесных растений, фрукты, стебли и кладоды кактусов, кишечник насекомых, фекалии млекопитающих, гнёзда муравьёв-листорезов, озёрная вода, океанические отложения, почва, вино, хлебобулочные изделия и молочные продукты [3].
Киллерные токсины - белки или гликопротеины, которые взаимодействуют с рецепторами на поверхности чувствительных клеток; клетки-продуценты обычно имеют иммунитет к собственным токсинам. КТ оказывают губительное действие в отношении дрожжей того же вида и/или других видов. Генетические детерминанты КТ расположены в хромосоме, либо в ци-
топлазме в виде вирусоподобных частиц, содержащих двуцепочечную РНК или ДНК. Молекулярный вес КТ варьирует от ~1,8 до >150 кДа, большинство из них состоят из одной субъединицы, хотя встречаются КТ, образованные двумя (K1, K28, SMKT) или даже тремя субъединицами (например, КТ Kluy-veromyces lactis, Pichia acaciae).
Большинство КТ стабильны в кислой среде, некоторые из них сохраняют активность в широком диапазоне значений pH, например, HM-1 культуры Cyberlindnera mrakii.
Диапазон температур, в котором КТ «работает», зависит от естественного местообитания киллерных дрожжей: КТ морских дрожжей имеют оптимальную температуру 15°C, а, например, KpKt почвенного штамма Tetrapisispora phaffii - 25°C. В целом, большинство КТ утрачивают активность при температуре более 40°C, хотя некоторые устойчивы к воздействию высокой температуры (например, HM-1 остается активным спустя 1 ч инкубации при 60°C). Более того, некоторые КТ меняют спектр действия и проявляют более выраженную активность в присутствии хлорида натрия. Это особенно характерно для КТ дрожжей, выделенных из солевого раствора при мариновании оливок или из морских местообитаний [4].
Несмотря на большое разнообразие КТ, киллинг чувствительных клеток обычно проходит в два этапа. В течение первой фазы КТ распознают и связываются с первичными рецепторами на клеточной стенке. В этой связи КТ, продуцируемые Tetrapisispora phaffii (KpKt), Pichia anomala (PiKT) и Kluyveromyces siamensis, не могут вызвать гибель сферопластов чувствительных мишеней. Плазматическая мембрана дрожжей и грибов заряжена отрицательно, а КТ заряжены в большей или меньшей степени положительно. Поэтому взаимодействие между КТ и плазматической мембраной может также зависеть от сетевого катионного заряда КТ [4].
Поскольку клеточная стенка является первичным сайтом действия КТ, различные её компоненты выполняют роль первичных рецепторов. Для большинства КТ, описанных на сегодняшний день, рецепторами обычно являются Р-1,3-0-глюканы и Р-1,6-В-глюканы, хотя для ряда КТ первичными рецепторами служат также маннопротеины и хитин (табл. 2).
Считают, что на втором этапе КТ транслоцируются в клеточную мембрану, где они взаимодействуют с вторичным рецептором. Этот этап гораздо
менее изучен и вторичные рецепторы известны только для очень небольшого числа КТ (табл. 2). После связывания с вторичным рецептором запускаются различные механизмы киллинга: пермеабилизация клеточной мембраны, подавление синтеза ДНК, пертурбация клеточного цикла, фрагментация РНК (табл. 2). В других случаях КТ действуют преимущественно на клеточную стенку чувствительной мишени. Некоторые токсины имеют Р-глюканазную активность и гидролизуют глюканы клеточной стенки, что приводит к лизису клетки. Токсин НМ-1 культуры Cyberlindnera mrakii Ш00895 нарушает биосинтез клеточной стенки, ингибируя фермент Р-1,3-глюкансинтазу [4]. Таблица 1. Семейства дрожжей, у которых обнаружена продукция киллерных токсинов [3]
Отдел Семейство Киллинг* Пример вида
внутривидовой межвидовой
Ascomycota Debaryomycetaceae Meyerozyma guilliermondii
Ascomycota Dipodascaceae Dipodascus geotrichum
Ascomycota Lipomycetaceae Lipomyces lipofer
Ascomycota Metschnikowiaceae Metschnikowia saccharicola
Ascomycota Pichiaceae Pichia punctispora
Ascomycota Saccharomycetaceae Debaryomyces hansenii
Ascomycota Saccharomycetales Incertae sedis Candida maltosa
Ascomycota Saccharomycodaceae Hanseniaspora uvarum
Ascomycota Schizosaccharomycetaceae a Schizosaccharomyces pombe
Ascomycota Wickerhamomycetaceae Wickerhamomyces anomalous
Basidiomycota Agaricostilbaceae Sterigmatomyces halophilus
Basidiomycota Bulleraceae Bullera hannae
Basidiomycota Cystofilobasidiaceae Cystofilobasidium infirmominiatum
Basidiomycota Kondoaceae Kondoa miscanthi
Basidiomycota Malasseziaceae b Malassezia furfur
Basidiomycota Mrakiaceae Tausonia pullulans
Basidiomycota Piskurozymaceae Piskurozyma capsuligena
Basidiomycota Tremellales Incertae sedis Hannaella sinensis
Basidiomycota Tremellaceae Naganishia albida
Basidiomycota Trichosporonaceae b Vanrija humicola
Basidiomycota Robbaueraceae Robbauera albescens
Basidiomycota Sporidiobolales Incertae sedis Rhodotorula mucilaginosa
Basidiomycota Sporobolomycetaceae Sporobolomyces salmonicolor
Basidiomycota Ustilaginaceae Pseudozyma tsukubaensis
Примечание:
* Серая заливка (фон) указывает, что в рамках данного семейства обнаружен внутри и/или межвидовой киллинг.
а Внутривидовой киллинг обнаружен только у сестринских спор в асках. Ь Обнаружен киллинг чувствительных представителей того же рода, но не указан вид чувствительного штамма. В случае с Vanrija Шш1со1а авторы сообщили, что микроорганизмы Cryptococcus Ыш1со1а активны в отношении представителей рода Сгур^сосст. С. Ыш1-со1а позже был переименован в V. Шш1со1а.
Таблица 2. Биоразнообразие и механизм действия киллерных токсинов [4]
Штамм дрожжей - продуцент киллерного Прежнее название Токсин Мишень в клетке Механизм действия
токсина Название Молекулярный вес (кДа) Первичная Вторичная
Хромосомные гены
Засскагошусвя сегеуШае 111 КЖ 20 ну ну ну
Засскагошусвя сегеуШае 115 КШ 75 ну ну Пермеабилизация мембраны
Candida пойаетт5 РУСС3198 СпКТ ну ну ну ну
СапдИда saturnus Ш00117 Ш заШтия. уаг. яаЫтия НУ1 9,5 ну ну ну
Cyberlindnera шгаки №00895 Ш. saturnus уаг. шткп; Н. шrakii НМ-1 или НМК 10,7 Р-глюкан ну Подавление Р-1,3-глюкансинтазы
Cyberlindnera шгаки МИСЬ41968 Ш. saturnus уаг. шткп ■дашКТ 85 Р-глюкан ну Повреждение клеточной стенки
Cyberlindnera шrakii ЫСУС500 Ш. saturnus уаг. шткп К500 ~1,8 ну ну ну
ПеЬатуошусев hansenii СУС1021 - 23 Р-1,6-глюкан ну ну
КЫ^етшусея шатапия ЫСУС587 К. fragilis К6 42 ну ну ну
КЫ^етшусея wickerhaшii ЭБУР06077 К^КТ 72 ну ну ну
Millerozyшa/аппояа КК1 Р. farinosa 8МКТ 6,6(а), 7,9(Р) ну ну Пермеабилизация мембраны
РШа Ыиууеп ЭБУРО5286 - 19 ну ну Пермеабилизация мембраны
ПсЫа шеш^ат/астепя СУС1106 РМКТ 18 Р-1,6-глюкан Cwp2p Пермеабилизация мембраны
ПсЫа шеш^ат/астепя СУС1086 РМКТ2 30 Маннопротеин ну Арест клеточного цикла
Бск^аптошусея оса/ЛеМаЬя АТСС44252 - 7,4(а), 4,9(Р) Маннопротеин ну Пермеабилизация мембраны
Tetrapisispora phaffii ЭБУР06076 К. phaffi КрКТ 33 Р-1,3/ Р-1,6-глюкан ну Р-глюканазная активность
ШтскеЛашошусея апошаЫя БСА15, БСИ24, Б891 - ну Р-1,3/ Р-1,6-глюкан ну Р-глюканазная активность
ШтскеЛашошусея апошаЫя ЫСУС434 Р. апошаЫ Рапошусост 49 Р-1,3-глюкан ну Гидролиз Р-1,3-глюкана
ШтскеЛашошусея апошаЫя ЭБУРО 3003 Р. апошаЫ Р1КТ <8 Р-1,6-глюкан ну ну
ШтскеЛашошусея апошаЫя УБ07Ь Р. апошаЫ - 47 ну ну Р-1,3-глюканазная активность
ШтскеЛашошусея апошаЫя АТСС 96603 Р. апошаЫ PaKt 85 Р-1,3-глюкан ну ну
Внехромосомные вирусоподобные частицы, содержащие двуцепочечную РНК
Hanseniaspora татш 470 - 18 Р-1,6-глюкан ну ну
Saccharoшyces сетутятае К1 9,5 (а), 9(3) Р-1,6-глюкан Кге1р Пермеабилизация мембраны
Saccharoшyces сетутятае К2 38,7 Р-1,6-глюкан ну Пермеабилизация мембраны
Saccharoшyces сетутятае К28 10,5(а), 11(Р) а-1,3-Маннопротеин Ей2р Подавление синтеза ДНК и блок клеточного цикла
Saccharoшyces cerevisiae К1ш ну ну ну ну
Zygosaccharoшyces Ьайп 2уяосш 10,4 Маннопротеин ну Пермеабилизация мембраны
Внехромосомные вирусоподобные частицы, содержащие двуцепочечную ДНК
Debaryoшyces тЬеНятае СБ86693 Ш. robertsiae ЭгТ >100 Хитин ну Фрагментация рРНК, пертурбация клеточного цикла
КЫууетшусея ^сйя Ш01267 2ушост 97(а), 31(Р), 28(у) Хитин Ipt1p Экзохитиназная активность; фрагментация тРНК; пертурбация клеточного цикла
Ба^еутеНа тояЫоуот ККЕ.ЬУ18709 Р. ттс/яис/уош Р1Т >100 Хитин ну Фрагментация рРНК
Millerozyшa асастае ЫИКЬУ18665 Р. асастае РаТ 110(а), 39(Р), 38(у) Хитин ну Фрагментация тРНК, пертурбация клеточного цикла
Примечание: ну - не установлено.
РО!: 10.24411/2304-9081-2019-14030 4
Антибактериальная активность КТ дрожжей впервые была продемонстрирована в 1986 г. в работе L. Polonelli и G. Morace [5]. Из 36 исследованных культур 33 (91,7%) штамма подавляли рост хотя бы одной тест-культуры - золотистого стафилококка, синегнойной палочки, энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens).
Продуценты антибактериальных КТ обнаружены среди представителей родов Hansenula (anomala, californica, canadensis, dimennae, fabianii, holstii, mrakii, nonfermentans, subpelliculosa, petersonii), Pichia (farinosa, guillier-mondii, kluyveri, membranifaciens, ohmeri, spartinae), Candida (guilliermondii, maltosa, pseudotropicalis), а также Saccharomyces cerevisiae. У культур Hansenula bimundalis и Pichia carsonii антибактериальная активность не была выявлена [5].
Позже этот феномен удалось подтвердить при проведении других исследований. Так, например, киллерные токсины пяти видов (Hansenula anomala, Hansenula (Williopsis) mrakii, Candida tropicalis, Kluyveromyces dro-sophilarum и Kluyveromyces lactis) подавляли рост грамположительных патогенных бактерий [6].
При изучении технологических характеристик штаммов дрожжей, выделенных из черных оливок при греческом способе ферментации, были отобраны 13 штаммов Debaryomyces hansenii и один штамм Torulaspora del-brueckii, фильтраты которых обладали антимикробным действием по отношению хотя бы к одной тест-культуре (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium) [7]. Исследование штаммов дрожжей из ферментированных овощей, приобретенных на местных рынках в южных провинциях Таиланда (Паттани и Наратхиват), показало, что дрожжи подавляют рост возбудителей кишечных и пищевых токсикоинфекций: шесть культур Candida krusei из продукта Pak-sien (клеома, Cleome rutidosperma DC.) активны в отношении Escherichia coli TISTR 887, Salmonella typhimurium TISTR 292, Staphylococcus aureus TISTR 118 и Bacillus cereus TISTR 868 [8].
Уникальную антимикробную активность проявляет киллерный токсин культуры Pichia kudriavzevii RY55 [9]. Очищенный белок (молекулярный вес 39,8 кДа) не подавляет рост Penicillium sp. и Candida sp., но оказывает губительное действие на все исследованные бактериальные патогены, включая Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Klebsiella sp., Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa и P. alcaligenes. Максимальный уровень активности наблюдали при 30°C, однако выраженное действие регистрировали также при 20, 25 и 37°C. Токсин стабилен при 4°C (активность 100%) в течение 60 дней, при 20°C активность (>90%) сохраняется на срок до 24-48 ч. При 50°C в течение первых 15-30 мин наблюдали сниженную активность, при более высокой температуре действие КТ не регистрировали. КТ проявляет активность при pH 4-7 (максимум при pH 5). Анализ влияния различных добавок на очищенный КТ показал, что ионы Mg2+ и Ca2+ не влияют, а ионы Mn2+, Fe2+ и Zn2+ существенно снижают активность. Ион NH4+ оказывает умеренное ингибирующее влияние; этилендиаминтетрауксусная кислота и додецил-сульфат натрия полностью подавляют киллерную активность [9].
Изложенные выше результаты экспериментальных исследований указывают, что дрожжи - продуценты киллерных токсинов - представляют важную в биотехнологическом плане группу микроорганизмов. Киллерные токсины и созданные на их основе пептидные производные могут получить широкое применение в медицине, ветеринарии, виноделии и пищевой промышленности.
(Работа выполнена при поддержке программы фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 18-7-8-26).
ЛИТЕРАТУРА
1. Bevan E.A., Makower M. The physiological basis of the killer character in yeast. Paper presented at the 11th International Congress on Genetics, Oxford. 1963.
2. Makower M., Bevan E.A. The inheritance of the killer character in yeast (Saccharomyces cerevisiae). Paper presented at the 11th International Congress on Genetics, Oxford. 1963.
3. Boynton P.J. The ecology of killer yeasts: Interference competition in natural habitats. Yeast. 2019. 36(8): 473-485.
4. Mannazzu I., Domizio P., Carboni G., Zara S., Zara G., Comitini F., Budroni M., Ciani M. Yeast killer toxins: from ecological significance to application. Crit. Rev. Biotechnol. 2019. 39(5): 603-617.
5. Polonelli L., Morace G. Reevaluation of the yeast killer phenomenon. J. Clin. Microbiol. 1986. 24(5): 866-869.
6. Izgu F., Altinbay D. Killer toxins of certain yeast strains have potential growth inhibitory activity on gram-positive pathogenic bacteria. Microbios. 1997. 89(358): 15-22.
7. Psani M., Kotzekidou P. Technological characteristics of yeast strains and their potential as starter adjuncts in Greek-style black olive fermentation World J. Microbiol. Biotechnol. 2006. 22(12): 1329-1336.
8. Waema S., Maneesri J., Masniyom P. Isolation and identification of killer yeast from fermented vegetables. As. J. Food Ag-Ind. 2009. 2(4): 126-134.
9. Bajaj B.K., Raina S., Singh S. Killer toxin from a novel killer yeast Pichia kudriavzevii RY55 with idiosyncratic antibacterial activity. J. Basic Microbiol. 2013. 53(8): 645-656.
Поступила 9 декабря 2019 г.
(Контактная информация: Валышев Александр Владимирович - кандидат медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории микробной экологии и дисбиозов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, ИКВС УрО РАН; тел. (3532) 775417; e-mail: valyshev@esoo.ru)
Образец ссылки на статью:
Валышев А.В., Чертков К.Л., Валышева Н.А. Антибактериальная активность киллерных токсинов дрожжей. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2019. 4. 6с. [Электр. ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2019-4/Articles/VAV-2019-4.pdf). DOI: 10.24411/2304-9081-2019-14030.
