CC BY
274
УДК 636.5.033
Э. И. Семенов, Л. Е. Матросова, Е. Ю. Тарасова,
З. А. Канарская
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АДСОРБИРУЮЩЕЙ А КТИВНОСТИ ДРОЖЖЕЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К МИКОТОКСИНАМ
Ключевые слова: дрожжи, совместное культивирование, адсорбция микотоксинов.
Показана адсорбция Т - 2 микотоксина инактивированными дрожжами. Установлено, что инактивированные дрожжи Saccharomyces cerevisiae - 11 обладают наибольшей эффективностью адсорбции Т - 2 микотоксина, что позволяет их использовать как адсорбент микотоксинов в виде кормовой добавки для профилактики микотоксикозов Показано, что совместное культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 11 и Issatchenkia orientalis - 96 может быть использовано для интенсификации роста дрожжей и повышения их выхода.
Key words: yeast, co-cultivation, the adsorption of mycotoxins.
Shows the adsorption of T - 2 mycotoxin inactivated yeast. Found that inactivated yeast Saccharomyces cerevisiae - 11 are the most effective adsorption T - 2 mycotoxin that allows their use as a mycotoxin adsorbent as a feed additive for the prevention of mycotoxicosis shown that co-cultivation of the yeast Saccharomyces cerevisiae - 11 and Issatchenkia orientalis - 96 can be used to intensify the growth of yeast and increase their output.
Последние десятилетия характеризуются возрастанием интереса применения биотехнологий во многих сферах деятельности человека. Среди разнообразия микроорганизмов, используемых в биотехнологической промышленности, привлекают внимания дрожжи. Рассматривая дрожжи как объект биотехнологии, следует отметить их условную патогенность для организма человека и животных, окружающей среды и «технологичность» - высокую скорость роста на широком спектре доступных для усвоения субстратах. Метаболический потенциал дрожжей не ниже, чем у других микроорганизмов, а ряд физиологических отличий, например, устойчивость к неблагоприятным факторам, имеет прикладной аспект. Дрожжи широко
распространены в различных экологических нишах. Изучение дрожжей является перспективным
направлением в биотехнологии.
На протяжении всей истории человечества известно широкое практическое применение дрожжей. Они используются в бродильных производствах для изготовления алкогольных напитков и хлеба, являются моделью для
физиологических, молекулярных и генетических исследований, используются как продуценты многих важных для человека соединений -витаминов, липидов, нуклеиновых кислот, ферментов, органических кислот, спиртов, полисахаридов [1]. Широко используются
дрожжевые культуры в биоремедиационных технологиях, очистки окружающей среды от ксенобиотиков [2, 3, 4, 5, 6].
Некоторые виды дрожжей используются в качестве агентов биоконтроля развития фитопатогенных микроорганизмов, выделяя вещества, подавляющие их рост [7, 8].
Дрожжи способны к биоадсорбции и биоаккумуляции тяжелых металлов с последующим образованием малотоксичных соединений [9, 10, 11].
Известно о способности дрожжей метаболизировать микотоксины и, соответственно, снижать их токсическое воздействие на организм [12, 13, 14, 15, 16].
В последнее десятилетие в нашей стране резко обострилась проблема микотоксикозов животных, представляющих собой чрезвычайно высокую экологическую и экономическую опасность. При скармливании животным кормов, контаминированных микотоксинами,
регистрируются отдаленные последствия, снижение продуктивности, повышение заболеваемости и массовая гибель животных [17].
Проблема лечения и профилактики отравлений животных, вызываемых микотоксинами, остается весьма актуальной в ветеринарной токсикологии. Средства специфической
профилактики и лечения, микотоксикозов до настоящего времени не разработаны. Наиболее распространенный метод защиты животных от микотоксинов - применение адсорбентов различного происхождения.
Наиболее совершенным адсорбентом микотоксинов, на наш взгляд, может стать клеточная стенка дрожжей. Клеточная стенка дрожжей составляет около 25 % сухой массы клетки. Полисахариды клеточной стенки (маннаны, глюкоманнаны) относятся к неперевариваемым. р -(1, 6) - глюканы дрожжей являются рецепторами киллер-токсинов, играющих, как известно, важную роль во взаимоотношениях между
микроорганизмами [14, 18, 19, 20, 21].
Дрожжи характеризуются устойчивостью к микотоксинам, что предопределяет возможность их использования для детоксикации организма животных.
Учитывая перспективность применения дрожжей в качестве адсорбентов, следует отметить и необходимость совершенствования их технологии производства, направленную на прежде всего
повышение выхода дрожжей и, соответственно, снижение их себестоимости.
В биотехнологическом производстве стоимость сырья, входящего в состав питательных сред, доходит до 40 % от себестоимости продукта. В этой связи возникает необходимость увеличения выхода биомассы дрожжей, используемых в качестве адсорбентов микотоксинов, и,
соответственно, снижения затрат на решение проблем с микотоксикозом животных.
Увеличение биомассы микроорганизмов наблюдается при совместном культивировании нескольких микроорганизмов. Выраженный эффект, в частности, отмечается у комплексных пробиотических препаратов, в которых
бактериальные культуры дополняют друг друга по спектру антагонистического действия и по
механизму влияния на макроорганизм [22].
Антагонистические свойства бактерий при межмикробных отношениях, в частности, в
микросимбиоценозе, между доминатными и
ассоциативными микроорагнизмами, недостаточно охарактеризованы. Активация автолитических ферментов антагониста может стимулировать
действие пептидогликанов бактерий-регуляторов [23]. На основе этих данных возможна разработка способов: отбора бактерийных препаратов с целью создания новых синбиотиков.
Показано ускорение роста Saccharomyces cerevisiae при совместном культивировании с Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii. При этом, в зависимости от соотношения клеток в
инокуляте отмечалось положительное,
отрицательное и нейтральное влияние симбиоза на рост клеток. Стимулирующий эффект роста дрожжей, возможно, вызван воздействием
специфических факторов, неспецифических экзометаболитов (витамины, аминокилоты и т.п.), выделяемых в среду пропионовокислыми бактериями [24] Следует ожидать, что совместное культивирование не снизит адсорбционной способности биомассы дрожжей и бактерий. Ранее было показано, что бактерии обладают достаточно высокой адсорбционной способностью по отношению к микотоксинам [18, 19, 20, 21, 25]
Целью данной работы - оценка адсорбирующей активности инактивированных дрожжей в отношении Т - 2 токсина и изучение влияния совместного культивирования
Saccharomyces cerevisiae - 11 с Issatchenkia orientalis
- 96 на выход биомассы.
Материалы и методы Объектом исследования являлись различные таксономические группы дрожжей: Saccharomyces cerevisiae - 11, Issatchenkia orientalis - 96, Candida tropicalis - 99, Candida pseudotropicalis 44 пк, Pichia jadinii - 2008, Rhodotorula glutinis - 2003, Torulopsis kefir - 2006 из коллекции штаммов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Дрожжи поддерживали в аэробных условиях на агаризованной среде Сабуро, содержащей (г/л дистиллированной воды): глюкозу - 10.0,
пептон - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0,
NaCl - 0.25, агар - 20.0.
В последующем из питательной среды методом многократных центрифугирований и промывок получали взвесь микробных клеток, которую затем высушивали до влажности 10 - 12 % и в дальнейшем использовали для исследований.
Для экспериментальных исследований использовали кристаллический Т - 2 токсин, не отличающийся от существующих стандартов, полученный в лаборатории микотоксинов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Качественное и количественное определение Т - 2 токсина проводили
хроматографическими методами (ТСХ и ГЖХ). Т - 2 токсин является одним из наиболее токсичных и достаточно распространённых трихотеценовых микотоксинов типа А. По сравнению с другими микотоксинами, Т - 2 микотоксин относится к наименее адсорбируемым микотоксинам и поэтому результаты опытов с его использованием могут являться критерием оценки адсорбционных свойств адсорбентов микотоксинов [2б].
Определение адсорбционной способности адсорбентов in vitro при рН = 7 (при температуре 37°С, в течение 30 минут) проводили по методике [27], которая учитывает специфику индикации Т - 2 токсина и прочность связывания. Изучение адсорбции проводили в десяти повторностях, за результат принимали их среднее значение.
При разработке способа увеличения выхода дрожжевой биомассы объектами исследования являлись дрожжи Saccharomyces cerevisiae-ll и Issatchenkia orientalis - 9б. Изоляты Issatchenkia orientalis - 9б и Saccharomyces cerevisiae - ll выделены в 199б и 2011 году сотрудниками «ФЦТРБ-ВНИВИ» из компостных куч.
Культуры выращивали на среде следующего
состава:
пептон - 10 г/л, глюкоза - 20 г/л, рН - 5,б ± 0,2.
Температура культивирования составила
300С.
Культуры Saccharomyces cerevisiae - ll и Issatchenkia orientalis вводили в среду одновременно, в соотношении 1 : 1, 2 : 1, 3 : 1, 1 : 2,
1 : 3. Первоначальная посевная доза инокулята составила б,0 ± 0,01 lg КОЕ/мл.
Результаты исследований
Результаты изучения адсорбирующей активности инактивированных дрожжей в отношении Т - 2 токсина представлены в таблице 1.
Из приведённых в таблице данных, следует, что все взятые в опытах инактивированные дрожжи обладают в той или иной степени способностью адсорбировать Т - 2 микотоксин. Так более активно связывают Т - 2 микотоксин микробные клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae - ll (78,8 %), рода Candida (б2,В - 72,1 %), менее Torulopsis kefir - 200б (47,9 %).
Таблица І - Адсорбирующая активность дрожжей в отношении Т - 2 токсина
Исследуемые штаммы Адсорбция, % Десорбция, %
Issatchenkia orientalis - 9б 70,6 7,6
Saccharomyces cerevisiae - ll 78,8 5,7
Candida tropicalis - 99 62,8 6,1
Candida pseudotropicalis 44 пк 72,1 4,6
Pichia jadinii - 2008 63,7 11,4
Rhodotorula glutinis - 2003 59,3 5,7
Torulopsis kefir - 200б 47,9 0,67
Таким образом, инактивированные дрожжи Saccharomyces cerevisiae - 11, обладают большей эффективностью адсорбции Т - 2 токсина, что позволяет их использовать как адсорбент микотоксинов в виде кормовой и пищевой добавки для профилактики отравлений микотоксинами.
Выращивание в монокультуре показало, что Saccharomyces cerevisiae - 11, в отличие от
Issatchenkia orientalis - 96 быстрее накапливает биомассу. На 72 ч культивирования количество клеток составила 16,0 ± 1,2 lg КОЕ/мл.
При совместном культивировании дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 11 и Issatchenkia orientalis
- 96 (соотношении клеток Saccharomyces cerevisiae -
11 - Issatchenkia orientalis - 96 в посевном материале 3:1) отмечен стимулирующий эффект. Активный рост сахаромицета происходил на 12 ч раньше, чем в монокультуре и позволил получить культуральную жидкость с титром 25,1 ± 2,3 lg КОЕ/мл.
Результаты исследований показали, что
совместное культивирование дрожжей
Saccharomyces cerevisiae - 11 и Issatchenkia orientalis
- 96 может быть использовано для интенсификации роста дрожжей и повышения их выхода.
Литература
1. И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов Биология дрожжей. М.: Товарищество научных изданий КМК. 221 с. (2004).
2. С.А. Зарипов, А.В. Наумов, Е.В. Никитина.
Микробиология. Т. 71. С. 648 - 653. (2002).
3. А.М. Зиганшин, Р. Герлах, Е.А. Науменко.
Микробиология. Т. 79. № 2. С. 199-205. (2010).
4. А.М. Зиганшин, А.В. Наумов, Е.С. Суворова.
Микробиология. Т. 76. С. 766 - 773. (2007).
5. Л.Е. Матросова, М.Я. Тремасов, А.А. Иванов.
Ветеринария. № 10. С. 42 - 43. (2012).
6. Bankar A., Kumar A., Zinjarde S. Environmental and industrial applications of Yarrowia lipolytica // Appl. Microbiol. Biotechnol. № 4. P.847 - 865. (2009).
7. Л.В. Коломбет. Микробиология и фитопатология. Т. 39. № 5. С. 81 - 89. (2005).
8. D.A. Schicler, N.I. Klan, M.J. Boehm et al. Greenhouse and field evaluation of biological control of Fusarium head bligh on gurun wheat. Plant Dis. V. 86. P. 1350 - 1356. (2002).
9. Р.А. Гаранин, И.Н. Лыков. «Вестник» при МГТУ им. Н.Э. Баумана из цикла «Естественные науки». № 1. С. 110-119. (2008).
10. Silvana A. Isotermas de adsorqao de cadmio por Saccharomyces cerevisiae // Cienc. Tecnol. Aliment. Vol.21. №.2. P.134 - 138. (2001).
11. Adamis P. Factors involved with cadmium absorption by a wildtype strain of Saccharomyces cerevisiae // Braz. J. Microbiol. Vol.34. №. 1.P.55 - 60. (2003).
12. Н.А. Мучкаева, О.Д. Доронина, И.В. Волкова. Всесоюзн. научн.- техн. конф. Тезисы докладов. Кемерово. С. 199 - 200. (1991).
13. О.П. Кобзиста. Современные проблемы токсикологии. № 1. С. 39 - 41. (2001).
14. Cardner P., Stanley V.G., Hutchincjn D.M. Use of Saccharomyces cerevisiae to suppress aflatoxin effects in broiler chick ration // Poultry Science. V. 71. P. 49. (1992).
15. V.G. Stanley, Raphael Qjo, Selamawit Woldesenbet, Dencle H. Hutchinson The use of Saccharomyces cerevisiae to suppress the effects of aflatoxicosis in broiler chicks // Poultry Science. V. 72. No. 10. P. 1867 - 1872. (1993).
16. Engler Kathryn H., Coker Raymond D., Evans Jvor H. Uptake of aflatoxin B1 and T-2 toxin by two mycotoxins bioassay microorganisms: Kluyveromyces marxianus and Bacillus megaterium//Arch. Microbiol. V. 174. No. 6. P. 381-385. (2000).
17. А.В. Иванов, М.Я. Тремасов, КХ. Папуниди, А.К. Чулков Микотоксикозы животных (этиология, диагностика, лечение, профилактика). М.: Колос. 140 с. (2008).
18. Р.А. Ахмадышин, А.В. Канарский, З.А. Канарская. Вестник Казанского технол. универ. № 2. С. 88 - 102. (2007).
19. Р.А. Ахмадышин, А.В. Канарский, З.А. Канарская. Вестник Казанского технол. универ. № 3 - 4. С. 127 -129. (2007).
20. Р.А. Ахмадышин, А.В. Канарский, З.А. Канарская. Вестник Казанского технологического университета. №
5. С. 83 - 85. (2007).
21. Р.А. Ахмадышин, А.В. Канарский, З.А. Канарская, Э.И. Семёнов Ветеринарный врач. № 1. С. 11 - 12. (2008).
22. И.Г. Царукьянова, А.И. Осадчая, Мжробюл. журн. Т. 69. №2. С.43 - 49 (2007).
23. И.В. Данилова, Т.В. Быковченко, Е.П. Рыжкова. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 42. № 4. С.428 - 433 (2006).
24. Yeast: a practical approach / Eds. I. Campbell, J.H. Duffus. Oxford, Washington: IRL Press, 289 p. (1988).
25. А.В. Канарский, З.А. Канарская, Д.А. Дулькин, Э.И. Семенов, В.К. Чеботарь, А.В. Щербаков. Вестник Казанского технол. универ. Т. 15. № 14. С. 186 - 190. (2012).
26. Э.И. Семёнов. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Казань. 26 с. (2006).
27. Э.И. Семенов, Н.Н. Курбанова. Материалы научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии». Казань. С. 53 - 54. (2007).
© Э. И. Семенов - канд. биол. наук, зав. лаб. микотоксинов Федер. центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности, г. Казань, [email protected]; Л. Е. Матросова - канд. биол. наук, зав. сектором того же Центра, M.Lilia.Evg@yandex. Яи; Е. Ю. Тарасова - канд. биол. наук, ст. научн. сотр. лаб. микотоксинов того же Центра; З. А. Канарская - канд. тех. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, [email protected].
