Микоциногения у дрожжей рода Starmera Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 582.282.23

МИКОЦИНОГЕНИЯ У ДРОЖЖЕЙ РОДА STARMERA

Голубев В.И. (в.н.с.)*

Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ), Институт биохимии и физиологии микроорганизмов Российской академии наук, Пущино, Россия

© Голубев В.И., 2017

Типовой штамм Starmera quercuum секретирует микоцин фун-гицидного действия. Наибольшую активность он проявляет при рН 6,0 и в присутствии в среде 2% NaCl. К этому микоцину чувствительны аскомицетные (преимущественно порядка Saccharomycetales) и базидиомицетные (преимущественно порядка Sporidiobolales) дрожжи, а также представители порядков Schizosaccharomycetales и Taphrinales.

Ключевые слова: Archiascomycotina, киллер-токсин, микоцин, таксономия

MYCOCINOGENY IN YEAST OF THE GENUS STARMERA

Golubev W.I. (leading scientific collaborator)

Russian Collection of Microorganisms, Institute for Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia

© Golubev W.I., 2017

Typical strain Starmera quercuum secretes fungicidal mycocin. The most activity it exhibits at pH 6.0 and in the presence in the medium of 2% NaCl. Ascomycetous (predominantly of the order Saccharomycetales) and basidiomycetous (mostly of the order Sporidiobolales) yeasts, as well as representatives of the orders Taphrinales and Schizosaccharomycetales are sensitive to this mycocin.

Key words: Archiacomycotina, killer toxin, mycocin, taxonomy

Контактное лицо: Голубев Владислав Иванович, тел.: (495)31-86-59

ВВЕДЕНИЕ

Антагонизм, обусловленный образованием антимикробных веществ, широко распространен между микроорганизмами, в том числе и среди дрожжей, у которых он часто связан с секрецией белковых соединений (киллер-токсинов, микоцинов) [1]. Последние обладают фунгицидной или фунгистатической активностью против, прежде всего, таксономически родственных микоциногенному штамму организмов. К настоящему времени микоциногению выявили более чем у 100 видов аскомицетных и базидиомицетных дрожжевых грибов, представляющих свыше 20 родов, и список их продолжает пополняться. Среди аскомицетных дрожжей микоциногения особенно распространена у представителей семейства Wickerhamomycetaceae (Saccharomycetales, Saccharomycetes), но до настоящего времени неизвестна, однако, для рода Starmera Yamada et al., сравнительно недавно выделенного на филогенетическом основании из состава Pichia Hansen (Pichiaceae).

При обследовании антагонистических взаимоотношений внутри Wickerhamomycetaceae впервые микоциногенную активность удалось обнаружить у единственного известного изолята S. quercuum (Phaff et Knapp) Kurtzman et al. ВКМ Y-1287. В настоящей работе представлены результаты исследований условий для экспрессии этой активности, спектра действия и других характеристик секретируемого им антифун-гального агента.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кроме культур Protomyces и Taphrina, все использованные в работе штаммы поддерживаются в секторе дрожжей Всероссийской коллекции микроорганизмов (http://www.vkm.ru/), вследствие чего аббревиатура (BKM Y-) перед их номерами далее не приведена.

Тестирование чувствительности к антифунгаль-ному агенту проводили на глюкозо-пептонном агаре (глюкоза - 5, пептон - 2,5, дрожжевой экстракт - 2, агар - 20 г/л) с цитрат-фосфатным буфером. На поверхность этой среды наносили 0,05 мл суспензии (примерно 105 клеток/мл) обследуемых 2-3 -суточных культур, выращенных на сусло-агаре (СА), тщательно растирали шпателем и затем штрихом наносили обильный инокулюм штамма S. quercuum. Засеянные чашки инкубировали при комнатной температуре до появления роста газона. При формировании вокруг штамма 1287 зоны подавления роста шириной несколько миллиметров обследуемый штамм регистрировали как чувствительный, если она не превышала 1-2 мм такие штаммы относили к слабо чувствительным, а при отсутствии ингибирования роста - к нечувствительным.

Для получения содержащей антифунгальный агент культуральной жидкости штамм 1287 выращивали в покое две недели при комнатной температуре в той же, но неагаризованной глюкозо-пептонной среде (100 мл). Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин), супернатант фильтровали через стеклянные фильтры GF/A («Sigma», США) и использовали для определения устойчивости агента к протеолизу и повышенной температуре (методом лунок в агаре), а также установления действия его на жизнеспособность чувствительных клеток, что после их инкубации в су-

пернатанте определяли высевами на СА. Для ориентировочной оценки молекулярной массы агента штамм 1287 выращивали на покрытой диализной мембраной («Spectrum», США) среде для тестирования чувствительности. После семи суток инкубации мембрану с выросшей на ней культурой удаляли и среду засевали газоном чувствительного штамма S. amethionina 2617.

В целях элиминации антифунгальной активности штамм 1287 высевали на чашки с СА и инкубировали при максимальной для его роста температуре, другие чашки 2-4 мин облучали УФ (254 нм, ~200 Дж/м2).

РЕЗУЛЬТАТЫ

На глюкозо-пептонном агаре с цитрат-фосфатным буфером штамм 1287 проявлял антифунгальную активность при значениях рН от 5,0 до 7,0. Ширина зон подавления роста чувствительных культур не превышала 3 мм, но при введении в среду NaCl (2-5%) она увеличивалась в несколько раз, а диапазон эффективных значений рН возрастал от 3,5 до 9,0 (цитрат-фосфатный и трис-буфер). Внесение в среду глицерина (50-100 мл/л) такого влияния не оказывало. Наиболее широкие зоны наблюдали при рН 6,0 и 2% NaCl (Рис. 1). Более высокие концентрации соли не способствовали увеличению зоны.

8 -

6 -

3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

рн

Рис. 1. Влияние значения рН в присутствии (□) и без 2% №С! (■) в среде на ширину (мм) зон подавления роста Starmera расЬусеггапа ВКМ У-2617 штаммом Starmera диегсиит ВКМ У-1287.

При наличии в среде метиленового синего (0,03 г/л) по краю зоны подавления роста на газоне культур, чувствительных к выделяемому 5. quercuum агенту, возникала синяя кайма, а при инкубации их в куль-туральной жидкости штамма 1287, содержащей анти-фунгальный агент, численность жизнеспособных клеток быстро снижалась (Рис. 2).

Агент, секретируемый S. quercuum, полностью инактивировался после 5 мин прогревания при 100 оС и обработки протеазой Streptomyces griseus (Sigma). Он задерживался диализной мембраной, не пропускающей соединения с молекулярной массой 3,5 кДа, но проходил через мембрану, отсекающую вещества с массой 6-8 кДа.

После выращивания штамма 1287 при 35 оС (максимальной для его роста на СА температуре) на наличие антифунгальной активности проверено 50 клонов, а после облучения УФ - 64. Ни у одного из них утраты активности не обнаружили.

На чувствительность к агенту, образуемому S. quercuum, обследовано более 500 штаммов около 300 видов дрожжей, представляющих свыше 140 родов аско- и базидиомицетов. Среди них нечувствительными оказались 156 видов (233 штамма) 107 родов (табл. 1).

Таблица 1.

Рода, виды которых нечувствительны к микоцину Starmera quercuum (количество обследованных видов, штаммов)

Рис. 2. Снижение численности (%) жизнеспособных клеток Stаrmerаpachycereana ВКМ У-2617 (исходная концентрация - 104 кл./мл) при инкубации в микоцин-содержащей культуральной жидкости Starmera quercuum ВКМ У-1287.

Apiotrichum (1, 1) Papiliotrema (1, 1)

Atractogloea (1, 1) Peterozyma (1, 1)

Babjeviella (1, 1) Phaeotremella (1, 1)

Ballistosporomyces (2, 2) Phragmotaneium (1, 1)

Bensingtonia (1, 1) Phyllozyma (1, 1)

Buckleyzyma (2, 2) Piskurozyma (4, 7)

Bullera (1, 1) Priceomyces (1, 1)

Bulleribasidium (1, 1) Pseudobensingtonia (1, 1)

Bulleromyces (1, 1) Pseudohyphozyma (3, 3)

Christiansenia (1, 1) Pseudoleucosporidium(1,1)

Chrysozyma (1, 1) Pseudotremella (1, 1)

Clavispora (1, 1) Robbaurea (1, 1)

Colacogloea (4, 4) Saccharomycodes (1, 11)

Cutaneotrichosporon (1, 1) Saccharomycopsis(1, 1)

Cystobasidiopsis (1, 1) Saitozyma (1, 1)

Cystofilobasidium (1,1) Sakaguchia (1, 1)

Debaryomyces (1, 1) Saturnispora (5, 5)

Dekkera (1, 1) Scheffersomyces (2, 2)

Eremothecium (1, 1) Schwanniomyces (6, 10)

Farysia (1, 1) Sebacina (1, 1)

Fellozyma (2, 2) Septobasidium (1, 1)

Fibulobasidium (1, 1) Sirobasidium (1, 1)

Filobasidiella (1, 1) Slooffia (2, 2)

Filobasidium (1, 1) Solicoccozyma (1, 1)

Goffeauzyma (1, 1) Spencerozyma (1, 1)

Hannaella (1, 1) Sphacelotheca (1, 1)

Hanseniaspora (2, 2) Sporisorium (1, 1)

Holtermannia (1, 1) Sporobolomyces (2, 2)*

Hyphopichia (1, 1) Sporopachydermia (1, 1)

Itersonilia (1, 1) Sterigmatosporidium (3, 3)

Kalmanozyma (1, 1) Symmetrospora (1, 1)

Kazachstania (1, 1) Sympodiomycopsis (1, 1)

Kluyveromyces (1, 1) Tausonia (1, 1)

Kodamaea (1, 1) Tortispora (1, 1)

Komagataella (1, 1) Torulaspora (1, 1)

Kondoa (1, 1) Tremella (1, 1)

Kregervanrija (1, 1) Trichosporon (1, 1)

Kuraishia (2, 3) Trigonosporomyces (1, 1)

Kwoniella (1, 1) Trimorphomyces (1, 2)

Lachancea (5, 5) Udeniomyces (1, 1)

Lodderomyces (1, 1) Udeniozyma (1, 1)

Mastigobasidium (1, 1) Ustilago (1, 1)

Metschnikowia (1, 1) Ustilentyloma (1, 1)

Meyerozyma (1, 1) Vanrija (1, 1)

Millerozyma (1, 1) Vishniacozyma (1, 1)

Mrakia (2, 2) Vonarxula (1, 1)

Naematelia (1, 1) Wickerhamiella (1, 1)

Naganishia (2, 3) Xanthophyllomyces (1, 1)

Nakaseomyces (1, 1) Yamadamyces (1, 1)

Naumovozyma (1, 1) Yamadazyma (1, 1)

Oberwinklerozyma (3, 6) Yarrowia (1, 1)

Ogataea (13, 23)* Yunzhangia (2, 2)

Pachysolen (1, 1) Zygoascus (1, 1)

Zygotorulaspora (2,2)

12 -

10 -

4

2 -

0

У аскомицетов чувствительные виды обнаружили в 17 родах, принадлежащих к трем порядкам классов Saccharomycetes, Schizosaccharomycetes и Taphrinomycetes (табл. 2).

Таблица 2.

Спектр действия микоцина Starmera quercuum среди аскомицетов классов Schizosaccharomycetes, Taphrinomycetes и Saccharomycetes

Порядки, семейства, виды Реакция Порядки, семейства, виды Реакция

Schizosaccharomycetales Schizosaccharomycetaceae B. pratensis 2136T, 2794 2795,2796 c

Schizosaccharomyces japonicus 651T, 655,656,667, 668 - B. salicaria 1288T -

Sch. octosporus 654T, 2195 c Candida dendrica 2278 +

Sch. pombe 646-650, 652, 653, 657665, 669, 1349, 1580, 1874-1876, 1895,1911-1916, 1921, 2051, 2543 - C. melinii 50T, 2357, 2358 -

Taphrinales Protomycetaceae Cyberlindnera americana 1409T -

Protomyces lactucae-debilis RBF 651 - Cyb. bimundalis 1407T -

P. macrosporus BKM F-2977 c Cyb. fabianii 1405, 1406, 1450T, 2557 2221,2556 c

Taphrina bergeniae BKM F-2965 - Cyb. jadinii 768 -

T. carnea RBF 662 c Cyb. mrakii 173T, 2142 -

T. pruni BKM F-2966 + Cyb. petersonii 1410 +

T. purpurescens RBF 690 + Cyb. rhodanensis 277, 1371,1604 c

T. tospuinette RBF 699 c Cyb. sargentensis 2087T -

Saccharomycetales Lipomycetaceae Cyb. saturnus 1403, 2551, 2552NT -

Lipomyces kononenkoae 2715T + Cyb. suaveolens 2990T -

L. lipofer 218T c Cyb. veronae 2163 -

L. starkeyi 219T c Starmera amethionina 2614T, 2615 +

Pichiaceae c St. dryadoides 2148T -

Candida ethanolica 2300T, 2676 c St. pachycereana 2616T, 2617 +

Pichia deserticola 246 + Wickerhamomyces alni 2509T, 2510 c

P. fermentans 244, 296T, 1452, 1518 - W. anomalus 60, 61, 118, 153-156, 163, 170, 174, 175, 177, 225, 1086T, 1431, 2037 -

P. kluyveri 290, 297T - W. bisporus 1065T -

P. kudriavzevii 191T - W. bovis 1106T -

P. manshurica 298T, 312 - W. canadensis 1395T +

P. membranifaciens 248,288,292, 299T, 1105, 2648 - W. chambardii 276 +

P. nakasei 2070 - W. ciferrii 169T -

P. norvegensis 1512, 2009 + W. lynferdii 2205T -

P. occidentalis 1461 - W. mucosus 2086T -

P. terricola 317 - W. pijperi 310T -

Saccharomycetaceae W. rabaulensis 2197T -

Saccharomyces bayanus 349T, 523 + W. strasburgensis 278, 1376, 1387 +

S. cariocanus 2878T c W. wingei 1398T, 1399, 1400 -

S. cerevisiae 375NT, 482 c Incertae sedis

S. kudriavzevii 2880T + Ambrosiozyma angophorae 2218T c

S. mikatae 2882T c A. llanquihuensis 2646T +

S. paradoxus 483T c A. monospora 2202T -

S. pastorianus 507NT, 510 - A. platypodis 2082T +

Tetrapisispora blattae 2216T c Nadsonia commutata 1573T -

Vanderwaltozyma polyspora 1524T + N. fulvescens 2531, 2532T c

Zygosaccharomyces bailii 419, 850T - Nakazawaea anatomiae 1522T -

Z. bisporus 853T - Nak. ernobii 725T -

Z. kombuchaensis 2920 + Nak. holstii 2558T -

Z. mellis 877T - Nak. peltata 1482T +

Z. rouxii 866T c Nak. wickerhamii 148 +

Wickerhamomycetaceae

Barnettozyma californica 167, 168, 901, 902, 1164, 1165, 1917, 1918, 2036, 2553 838T, 839 c

+: чувствительны, с: слабо чувствительны, -: нечувствительны, Т: типовые, NT: неотиповые штаммы. BKM F-: коллекция культур мицелиальных грибов ВКМ, RBF: Raiffeisen-Bioforschung GmbH (Австрия)

У базидиомицетов они выявлены в 20 родах 9 порядков классов Agаricostilbomycetes, Cystobasidiomycetes, Microbotryomycetes, Tremellomycetes и Ustilaginomycetes (табл. 3).

Таблица 3.

Спектр действия микоцина Stamera quercuum среди базидиомицетов классов Aдaricostilbomycetes, Cystobasidiomycetes, Microbotryomycetes, Tremellomycetes и Ustilaginomycetes

Классы, порядки, виды Реакция Классы, порядки, виды Реакция

Agaricostilbomycetes Aqaricostilbales Rh. glutinis 262, 332T +

Ruinenia rubra 2767T c Rh. bacarum 2171T +

Sterigmatomyces elviae 2580, 2772T - Rh. dairenensis 1975T +

St. halophilus 2091, 2666T c Rh. nothofagi 2914T +

St. pulcherrimus 2684 - Rh. mucilaginosa 7, 17, 261, 339T, 341, 2088 +

Cystobasidiomycetes Cystobasidiales Sporidiobolus johnsonii 678, 2606 +

Cyst. laryngis 1544 - S. microsporus 2607T +

Cyst. minuta 338T 1120,1264, 1292, 1541, 2281, 2285 c S. pararoseus 680T, 704 +

Cyst. pallidum 1329, 1953, 2279, 2280 1952,1976T c S. ruineniae 2608T c

Cyst. slooffiae 1547 - S. salmonicolor 326, 679, 685,2290 +

Erythrobasidiales Incertae sedis

Hasegawazyma lactosa 1355T, 1356 c Curvibasidium cygneicollum 1532T, 2776, 2777, 2651, 2859 -

Incertae sedis C. pallidicorallinum 1135, 2284T, 2860, 2861 c

Buckleyzyma aurantiaca 327T - Hamamotoa lignophila 2620T +

B. phyllomatis 2819T + H. singularis 1299T +

Microbotryomycetes Leucosporidiales Sampaiozyma ingeniosa 741T +

Glaciozyma antarctica 2083, 2661,2707T + Sam. vanillica 2839T +

Leucosporidium creatinivorum 2838T - Tremellomycetes Cystofilobasidiales

L. fellii 2757T - Krasilnikovozyma curviuscula 2953 c

L. scottii 68, 2774T + K. huempii 2637T c

L. yakuticum 2837T - Tremellales

Sporidiobolales Trimorphomyces papilionaceous 2921, 2922 -

Rhodosporidium babjevae 705,1310, 1629, 1631, 2275T, 2276,2911,2913 c Sugitazyma miyagiana 2769T c

R. diobovatum 1111, 1571T + Trichosporonales

R. fluviale 2753T + Bandonia marina 1587T +

R. kratochvilovae 329, 1113, 2754T + Ustilaginomycetes Microstromatales

R. lusitaniae 2781T + Microstroma phylloplanum 2664T, 2665 +

R. paludigenum 2758T, 2759 + Mic. juglandis 2696 -

R. sphaerocarpum 1567T, 1568 c Ustilaginales

R. toruloides 333, 334T, 337 + Moesziomyces antarcticus 2604T +

Rhodosporidiobolus colostri 330T, 2965 + M. aphidis 2090T +

Rhodotorula alborubescens 2450T c Incertae sedis

Rh. araucariae 2194T + Pseudozyma tsukubaensis 2190T +

Как правило, реакция к микоцину S. quercuum штаммов одного вида однотипна. В редких случаях на-

блюдали гетерогенность в этом отношении. В частности, она отмечена для видов Barnettozyma californica, B. pratensis, Cyberlindnera fabianii, Cystobasidium minuta, C. pallidum и Ogataea pini (табл. 1-3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Чувствительность к повышенной температуре и действию протеазы служит показателем белковой природы секретируемого S. quercuum антифунгально-го агента. При ориентировочной оценке его молекулярной массы с использованием диализных мембран можно предположить, что он представляет собой полипептид. Последний обладает фунгицидной активностью, на что указывает формирование синей каймы на газоне чувствительных культур при наличии в среде метиленового синего, проникающего в мертвые клетки. При непосредственно фунгицидном действии выявили падение численности жизнеспособных клеток в процессе инкубации в токсин-содержащей культу-ральной жидкости штамма 1287 (Рис. 2).

В связи с резким повышением чувствительности дрожжей при увеличении осмотического давления за счет наличия в среде NaCl (Рис. 1) можно предположить, что вероятный механизм действия внеклеточного агента штамма 1287 заключается в повреждении им проницаемости цитоплазматической мембраны.

Синтез данного агента кодируется, очевидно, хромосомными генами, поскольку обработки, эффективно элиминирующие внехромосомные генетические элементы, не приводили к утрате антифунгаль-ной активности штамма 1287.

Белковая природа агента, секретируемого S. quercuum, а также условия проявления активности дают возможность отнести его к микоцинам. Принципиальной характеристикой их, однако, является таксономическая специфичность, т.е. активность против родственных микоциногенному штамму организмов, что неоднократно было продемонстрировано [2]. В то же время имеются сообщения, что отдельные микоци-ны действуют (как правило, слабо) и против некоторых таксономически далеких организмов [Голубев В.И. // Микробиол. журн. - 1992. - Т. 54, №5; Голубев В.И. и др. // Изв. РАН. Сер. биол. - 1996. - №5; Golubev W.I., et al. // Mycoscience. - 1997. - Vol. 38, №1]. В этом плане наиболее значительное исключение представляют

микоцины, образуемые тянь-шаньскими изолятами Barnettozyma pratensis (Bab'eva et Reshetova) Kurtzman et al. (= Williopsis pratensis Bab'eva et Reshetova, Komagataea pratensis (Bab'eva et Reshetova) Yamada et al.)), которые активны как против ряда аскомицетных, так и базиди-омицетных дрожжей [Вустин М.М. и др. // ДАН СССР. - 1988. - T. 302, №3; Вустин М.М. и др. //Микробиология. - 1991. - T. 60, №2]. Кавказские изоляты данного вида такой активностью не обладают, отличаясь от тянь-шаньских по молекулярно-биологическим, физиолого-биохимическим признакам и чувствительности к микоцинам Pichia manshurica Saito (=P punctispora (Melard) Dekker)) [Голубев В.И., Благодат-ская В.М. // Микробиология. - 1994. - Т. 63, №4]. Аналогично тянь-шаньским изолятам, S. quercuum тоже действует против аскомицетных и базидиомицетных дрожжей, причем среди последних также фигурируют, главным образом, виды родов порядка Sporidiobolales (Microbotryomycetes) (табл. 3). Среди аскомицетных дрожжевых грибов чувствительные к микоцину S. quercuum виды наиболее многочисленны в семействе Saccharomycetaceae (Saccharomycetales).

Причины разной реакции отдельных таксонов к микоцинам могут быть вызваны разными факторами, особенно их таксономической гетерогенностью и наличием иммунитета. В каждом случае установление этого требует специальных исследований.

В отличие от микоцинов B. pratensis, синтезируемый микоцин S. quercuum термолабилен, обладает меньшей молекулярной массой и максимальным фунгицидным эффектом при слабокислом значении рН среды.

Особо отметим активность S. quercuum против представителей Schizosaccharomycetales и Taphrinales (Archiascomycotina). Чувствительные клетки, как известно, несут на клеточной стенке специфичные по-лисахарид-содержащие рецепторы, связывающие микоцины [2]. Эти рецепторы, сорбирующие мико-цин S. quercuum, возникли, по-видимому, на самых ранних этапах эволюции грибов, о чем свидетельствует чувствительность к нему видов Protomyces, Schizosaccharomyces и Taphrina (табл. 2). Сравнительный анализ геномов помещает эти организмы у основания филогенетического древа, вблизи дивергенции на аскомицетную и базидиомицетную линии [3].

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Golubev W.I. Antagonistic interactions among yeasts / In: Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts (eds. C.A. Rosa, G. Peter). -Berlin: Springer-Verlag, 2006. - P. 197-219.

2. Голубев В.И. Микоцинотипирование // Микология и фитопатология. - 2012. - Т. 46, №1. - С. 3-13.

3. Kuramae E.E., Robert V., Snel B., et al. Phylogenomics reveal a robust fungal tree of life // FEMS Yeast Res. - 2006. - Vol. 6. -№8. - P. 1213-1220.

Поступила в редакцию журнала 01.02.2017 Рецензент: С.М. Игнатьева