CC BY
21УДК 616.992: S76.882.8
КИААЕРНАЯ АКТИВНОСТЬ CANDIDA ALBICANS (ROBIN) BERKHOUT ПО ОТНОШЕНИЮ К КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМ ДРОЖЖАМ
Арзуманян В.Г., Ожован И.М., Сердюк О.А.
ГУ НИИ Вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН, Москва, Россия
© Коллектив авторов, 2005
Изучена антагонистическая активность 11 клинических изолятов С. albicans по отношению к 5родам клинически значимых дрожжей: Rhodotorula spp. (2 штамма), Cryptococcus spp. (2), Trichosporon spp. (2), Geotrichum spp. (2), Malassezia spp. (10). О цен-ку антагонистической активности проводили количественным методом отсроченного антагонизма на «перевернутом» агаре и путем обработки клеток концентратом культуральной жидкости С. albicans.
Установлено, что чувствительность к метаболитам С. albicans значительно варьировала между штаммами одного и того же вида и между родами. Средние количественные показатели чувствительности убывали в ряду: Cryptococcus - Trichosporon
- Malassezia - Rhodotorula - Geotrichum. Наиболее антагонистически активным явился штамм С. albicans № 927 - 61,1 % изученных дрожжевых культур проявляли чувствительность к его метаболитам, которые были термолабильны, обладали доза-эффектом и содержали белки с молекулярной массой примерно 118 кДа и 130 кДа.
При одновременном заселении экотопа дрожжами С. albicans и М. furfur они испытывали взаимное фунгистатическое воздействие.
Ключевые слова: антагонизм, дрожжи, Candida albicans, киллеры, микоцины
KILLER ACTIVITY OF CANDIDA ALBICANS (ROBIN) BERKHOUT DIRECTED TO SOME CLINICAL YEASTS
Arzumanian V.G., Ojovan I.М., Serdiuk O.A.
SI Mechnikov's Scientific Research institute of Vaccinae and Sera, Moscow, Russia
© Collective of authors, 2005
Antagonistic activity of 11 C. albicans isolates toward 5 genera of clinical yeasts — Rhodotorula spp. (2 strains), Cryptococcus spp. (2), Trichosporon spp. (2), Geotrichum spp. (2), Malassezia spp. (10) was
investigated. The activity was estimated by: 1) the quantitative "reversed” agar method and 2) the treatment of yeast cells with concentrated C. albicans culture liquid. Sensitivity of the yeasts to C. albicans metabolites varied significantly among different strains/ species / genera. Averaged quantitative characteristics of sensitivity decreased among Cryptococcus - Trichosporon - Malassezia - Rhodotorula
- Geotrichum. The most antagonistically active was strain C. albicans № 927 - 61,1 % of investigated cultures were sensitive to the metabolites, which was thermolabile, demonstrated a dose-effect and contained two proteins 118 kDa and 130 kDa. When seeded simultaneously on the both sides of thin agar layer, C. albicans and M. furfur cultures underwent the reciprocal fungistatic action.
Key words: antagonism, Candida albicans, killer, mycocins, yeasts
Антагонизм имеет место во всех группах микроорганизмов, при этом реализуется наиболее важная экологическая функция - защита своего биотопа, которая осуществляется с помощью антагонистически активных субстанций: токсинов (бактерии), антибиотиков (мицелиальные грибы и актиномице-ты) и киллерных субстанций (дрожжи). Киллерные вещества дрожжей описаны в виде микоцинов и гликолипидов. Микоцины - белки или гликопротеины с молекулярной массой 10-20 кДа (реже — 100 кДа), термо- и протеазолабильные, активные в пределах вида, рода или нескольких родов [1]. Гликолипиды -с молекулярной массой около 1 кДа, термо- и проте-азостабильные с широким спектром действия [2, 3].
Из списка клинически значимых грибов наиболее широко известным и хорошо изученным видом является Candida albicans. У здоровых людей эти микроорганизмы заселяют слизистые оболочки, однако у иммунокомпрометированных носителей их можно обнаружить на коже и её придатках.
Несмотря на обилие сведений об активности различных родов дрожжей в отношении С. albicans [4, 5], данные литературы о наличии киллерной активности у самого атого вида весьма скудны [6]. В то же время вероятно, что С. albicans могут противостоять прочим родам дрожжей, например, при попадании на кожу. Особенно реальна подобная ситуация в отношении дрожжей рода Malassezia - представителей нормальной микробиоты кожи человека, также обладающих антагонистической активностью [7].
Цель настоящего исследования — изучение спектра действия киллерных токсинов С. albicans в пределах нескольких родов клинически значимых дрожжей, а также взаимного влияния С. albicans и М. furfur.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы дрожжей: Rhodotorula spp. (2 культуры), Cryptococcus spp. (2), Trichosporon spp. (2), Geotrichum spp. (2), C. albicans (11), Malassezia spp (10) взяты из коллекции ГУ НИИВС им. Мечникова.
Антагонистическую активность С. albicans оценивали двумя методами. Первым способом оценки был описанный ранее количественный метод отсроченного антагонизма на «перевернутом» агаре [8]. Культуры С. albicans выращивали на агаризован-
ЭКШШМШАДШМШКОДОШ
ной среде 2ПД [9] при температуре 25°С в течение
2 суток. Контролем служили чашки с питательной средой 2ПД, инкубированные при тех же условиях. По истечении 2 суток агар переворачивали тонким изогнутым металлическим шпателем и на обратную поверхность агара засевали подопытные штаммы дрожжей, используя предварительно оттитрованную посевную дозу, при которой на контрольном агаре вырастало от 10 до 70 колоний. Чашки инкубировали при температуре 25-27 “С в течение 14 суток, после чего результат в виде количества или размера колоний сравнивали с контролем. Для количественной характеристики роста культур использовали следующие показатели: S - стабильность - процент изученных штаммов С. albicans, не останавливающих рост подопытных культур; АА - антагонистическая активность - процент подопытных культур, рост которых полностью тормозится под действием данного штамма С. albicans. Второй способ оценки антагонистической активности заключался в обработке клеток дрожжей концентратом культуральной жидкости (ККЖ) С. albicans. ККЖ из С. albicans получали путем лиофильного высушивания бесклеточной культуральной жидкости после выращивания на синтетической среде [10] до поздней стационарной фазы с последующими разведением сухого вещества
0,1 М фосфатным буфером pH 4,6 соответственно 10-кратному концентрированию и стерилизацией фильтрованием. Три 3 мм петли 2 суточных культур Malassezia sp. суспендировали шприцем в 0,6 мл буфера и вносили по 50 мкл этой суспензии в стерильные 4 мл флаконы, куда добавляли по 200 мкл ККЖ. Флаконы инкубировали при 32 °С в течение 1 суток. Контроль - 50 мкл суспензии и 200 мкл буфера. Затем из флаконов отбирали по 100 мкл в отдельные пробирки, добавляли в них по 1 мл раствора 2 мМ бромкрезолового пурпурного в том же буфере и инкубировали 1 час при 32 °С. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 минут при угловой скорости 5000 об/мин., осадки микроскопировали (суммарное увеличение микроскопа ж 1750) и подсчитывали живые (белые) и мертвые (желтые) клетки [11]. Термообработку ККЖ проводили путем авто-клавирования при 0,5 атм в течение 30 минуг.
ПААГ-электрофорез ККЖ проводили методом Лэммли [12] в присутствии додецил-сульфата натрия в градиенте 5-20% полиакриламида с 3%-ным концентрирующим гелем. Образцы готовили в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях (с 10% меркаптоэтанола и кипячением в течение 5 мин). Разделенные в электрофорезе белковые фракции окрашивали с помощью раствора соли серебра [13], Маркеры молекулярных масс HMW - high molecular weights («Amersham-Pharmacia») — готовили в невосстанавливающих условиях; 50-кратный концентрат культуральной жидкости приготовлен в невосстанавливающих условиях; маркеры LMW - low molecular weights («Amersham-Pharmacia») — приготовлены в восстанавливающих условиях. Расчеты
молекулярных масс неизвестных белков проводили по калибровочному графику, построенному на основании данных, полученных с метчиками.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты экспериментов на «перевернутом» агаре представлены в таблице, из которой видно, что культуры дрожжей разных родов/видов имели различную чувствительность к метаболитам С. albicans: от полного торможения роста до отсутствия какой-либо реакции. Количественные показатели стабильности культур - S - варьировали в пределах от 54,5% до 100%, причем имели значительный разброс среди штаммов одного рода и, даже, вида. Средние значения S, подсчитанные для культур одного рода, возрастали в ряду Cryptococcus - Trichosporon - Malassezia
- Rhodotorula - Geotrichum. Данным результатом не подтверждается устоявшееся представление о большей активности микоцинов в отношении дрожжей более близкого аффинитета [1].
В свою очередь, в данной серии экспериментов выявлено, что штаммы С. albicans обладали различной антагонистической активностью по отношению к испытуемым культурам. Количественный показатель антагонизма - АА - варьировал в пределах от 11,1% до 61,1%. Наиболее активным был штамм С. albicans № 927. Метаболитами данного штамма обрабатывали клетки трех видов Malassezia в экспериментах в жидких средах (Рис. 1). Оказалось, что после 24-часовой инкубации с ККЖ численность живых клеток, по сравнению с контролем, снижалась на 29,8% у М. sympodialis № 1, на 30,8% — у М. furfur № 607 и на 36,2% — у М. globosa № 9. Для сравнения приведем данные по антагонистической активности М. furfur № 607: при обработке С. albicans метаболитами из М. furfur число живых клеток снижалось на 19,9% [7].
Доза-эффект и термолабильность метаболитов С. albicans № 927 изучены на культуре дрожжей М. globosa № 9 (Рис. 2). Видно, что термообработка ККЖ сопровождалась полной потерей киллерной активности, а субстанция обладала выраженным дозозависимым действием; 100%-ная Термолабильность ККЖ является аргументом в пользу белковой (ми-коциновой) природы антагонизма у С. albicans.
Для уточнения наличия белковых компонентов среди метаболитов С. albicans проводили электрофоретическое разделение 50-кратного концентрата культуральной жидкости в полиакриламидном геле. В целях повышения чувствительности метода для окрашивания гелей использовали не Кумасси синий, а соль серебра (Рис. 3). Очевидно наличие двух четких, но относительно слабых, полос, соответствующих белкам с молекулярной массой примерно 118 кДа и 130 кДа. Остальные (более низкомолекулярные) полосы — это артефакты, поскольку треки по обе стороны от трека № 4 пустые, а полосы видны и в них.
Взаимное и одновременное влияние наиболее антагонистически активных штаммов С. albicans № 927
и М. furfur № 607 оценивали в опытах на агаризован- ВЫВОДЫ
ной среде Диксона и синтетической среде, разработанной специально для Malassezia spp. [14]. Резуль- 1. Белоксодержащие метаболиты дрожжей
таты представлены на рис. 4. Теплый агар наносили С. albicans представлены белками с молекулярной
по обе стороны капроновой сетки, натянутой между массой примерно 118 кДа и 130 кДа.
пластиковыми кольцами. На одну сторону агара засе- 2. Киллерная активность дрожжей С. albicans
вали С. albicans, на другую, через 5 минут — М. furfur. представлена термолабильным веществом, скорее
Количество посевного материала рассчитывали та- всего - микоцином, которое активно по отношению
ким образом, чтобы получить порядка 100 колоний к изученным 5 родам клинически значимых дрож-
на кольцо. Аналогично засевали контрольные чашки жей.
Петри с той же средой. Все образцы инкубировали 3. Чувствительность к метаболитам С. albicans
при 32 “С в течение нескольких суток, ежедневно варьировала между штаммами одного и того же вида
оценивая численность и размеры колоний. На обе- и между родами. Средние количественные показате-
их средах результат оказался одинаковым: культура ли чувствительности убывали в ряду: Cryptococcus
С. albicans вырастала на первые сутки, всего на 6-8 — Trichosporon — Malassezia - Rhodotorula -
часов опережая М. furfur. По обилию колоний ни та, Geotrichum.
ни другая культура не отличалась от контрольной, 4. Наиболее антагонистически активным явил-
однако размеры колоний у обоих штаммов были зна- ся штамм С. albicans № 927, к которому были чувс-
чигельно меньше в опытных вариантах. Так, на 7 сут- твительны 61,1% изученных дрожжевых культур,
ки средний диаметр колоний в контрольных чашках 5. При одновременном заселении акотопа
составлял 1,5-2 мм, тогда как на опытных сетках дрожжами С. albicans и М. furfur они испытывали
- 0,3-0,5 мм. взаимное фунгистатическое воздействие.
ЛИТЕРАТУРА
1. Golubev W.I. Mycocins (Killer toxins)/ In: The Yeasts, A Taxonomic Study. — 1998. - Elsevier,- Ed.by Kurtzman C.P., Fell J.W.- P. 55-62.
2. Golubev Wl, Shabalin Y Microcin production by the yeast Cryptococcus humkolall FEMS Microbiology Letters. - 1994 . - Vol. 119.- P. 105-110.
3. Kulakovskaya T.V., Kulakovskaya E.V., Golubev W.I. ATP leakage from yeast cells treated by extracellular glycolipids of Pseudozymafusiformata/J FEMS Yeast Research. -2003. - Vol. 3. - P. 401-404.
4. Polonelli L., Archibusacci C., Sestito М., Morace G. Killer system: a simple method for differentiating Candida albicans strains // J. Clin. Microbiol. -1983. - Vol. 17,№ 5,- P. 774-780.
5. Buzzini P., Martini A. Discrimination between Candida albicans and Other Pathogenic Species of the Genus Candida by Their Differential Sensitivities to Toxins of a Panel of Killer Yeasts 11 J. Clin. Microbiol. - 2001.- Vol. 39, № 9. - P.3362-3364.
6. Philliskirk G., Young T.M. The occurrence of killer character in yeasts of various genera// Antonie Van Leeuwenhoek Journal of Microbiology and Serology. - 1975.- Vol. 41. - P. 147- 151.
7. Арзуманян В.Г., Шелемех O.B., Ожован И.М. Киллерная активность дрожжей Malassezia по отношению к прочим клинически значимым родам дрожжей // Мат. II Всерос. конг. по мед. микологии «Успехи мед. микологии». - М., 2004.- Т.З- С.24.
8. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А. и др. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма на примере пробиотических культур и оппортунистических дрожжей // Клиническая и лабораторная диагностика,- 2005.- № 5..- С. 53-55.
9. Арзуманян В. Г, Мельникова В. А. Усовершенствованная среда для выделения изолятов клинически значимых дрожжей// VII Международная конференция MAKMAX/ESCMID «Антимикробная терапия». - М., 2005. — С.12.
10. Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts/ In: The Yeasts, A Taxonomic Study.- 1998.-Elsevier.- Ed.by Kurtzman C.P., Fell J.W.- P.77-100.
11. Kurzweilova H., Sigler К. Fluorescent staining with bromocresol purple: a rapid method for determining yeast cell dead count developed as an assay of killer toxin activity// Yeasts .- 1993. - Vol. 9.- P.1207-1211.
12. Laemmly U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. - 1970.
- Vol. 227. -P. 680-685.
13. Merril C.R., Goldman D., Sedman S.A., EbertM.H. Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins// Science. - 1981, - Vol. 211.- P. 1437.
14. Арзуманян В.Г. Синтетические среды для культивирования дрожжей Malassezia (Pityrosporum) //Вестник РАМН. -1999,- № 11,- С.54-56.
Поступила в редакцию журнала 08.12.2005
Рецензент: Н.П.Елинов
Антагонистическая активность Candida albicans в опытах на плотных средах
Действующие штаммы С.albicans, коллекционный №
Таблица 1.
S,
%
Подопытные штаммы дрожжей, вид, колл.
№ **_____________________
Cryptococcus albidus N 975 С. albiclus N 220 Т. ovoides N18 Т. cutaneum N566 R. mucilaginosaN132 R. aurantiaca N 786 Geotrichum sp. N1206 Geotrichum sp. N M M. furfur N 607 M. sympodialis N1 M. sympodialis N 2 M. sympodialis N 3 M. sympodialis N 4 M. sympodialis N 5 M. sympodialis N 6 M. sympodialis N 7 M. sympidialis N 8 M. globosa N 9
AA*,%
* К — контрольный агар; S - стабильность; AA - антагонистическая активность
Черный цвет ячейки означает, что рост культур аналогичен контрольному варианту (обильный рост); серый цвет — культура выросла, но число колоний и/или их размер меньше, чем в контроле; белый цвет. — отсутствие какого-либо роста.
** Полные таксономические названия видов:
Cryptococcus albidus (Saito) Skinner Rhodotorula mucilaginosa (Jorgensen) Harrison Rhodotorula aurantiaca (Saito) Lodder Trichosporon ovoides Behrend Trichosporon cutaneum (de Beurmann et al.) Ota Malassezia furfur (Robin) Baillon Malassezia sympodialis Simmons & E. Gueho Malassezia globosa Midgley, Guillot & Gueho
120
100
Я 80
п
— 60
н
я о 40
й
20
0
50
150
Доза, мкл
200
200
терм
Рис. 1. Киллерный эффект метаболитов С.albicans на клетки дрожжей Malassezia spp.
Левые столбцы - содержание живых клеток в исходном образце клеток (контроль); правые столбцы - содержание живых клеток после обработки ККЖ (опыт).
Рис. 2.Доза-эффект и термолабильность метаболитов С. а1Ысапз № 927 при обработке ими клеток дрожжей М. д!оЬо$а № 9 Абсцисса - доза ККЖ, которой обрабатывали клетки; последний столбец - на клетки действовали ККЖ, которая была предварительно подвергнута термообработке.
0
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2005. Т.7. №4
330 000220 000-
67 ООО— 60 ООО-—
36 ООО—
■ «*
Мол. Масса (Da)
- 67 000
— 43 000
— 30 000
— 20 000 — 14 500
Рис. 3. Электрофоретическое разделение белковых метаболитов культуры Candida albicans N 927
1, 2, 3 - маркеры HMW, приготовленные в невосстанавливающих условиях (2, 5 и 10 мкл разведенного в 5 раз раствора, соответственно);
4 - 50-ти кратный концентрат культуральной жидкости, приготовленный в невосстанавливающих условиях,
40 мкл; слева и справа от него - пустые треки -отрицательный контроль;
5,6 - маркеры LMW, приготовленные в восстанавливающих условиях
(2 и 5 мкл разведенного в 10 раз раствора, соответственно).
3
4
Рис. 4. Взаимное влияние культур С. albicans N 927 и М. furfur N 607 в экспериментах на агаризованных средах
1 — М. furfur контроль — синтетическая среда;
2 — М. furfur — та же среда, на обратной стороне которой одновременно росла культура С. albicans;
3 — С. albicans контроль — синтетическая среда;
4 — С. albicans — та же среда, на обратной стороне которой одновременно росла культура М. furfur.
1
2
18 000—
1
2
3
4
5
6
