CC BY
36УДК 616.992:616-057
КЕРАТИНОЛИТИЧЕО КАЯ АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ МИКРОМИЦЕТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НОГТЕВЫХ ПЛАСТИН ПАЦИЕНТОВ С
онихомикозом
Пупкова М.А. (аспирант) , Кубасова Н.Я. (аспирант)
НИИ медицинской микологии им.П.Н.Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО, Санкт-Петербург, Россия
© Пупкова М.А., Кубасова НА., 2010
В статье приведены результаты определения кератиноли-тической активности дерматомицетов и недерматомицетов, выделенных из ногтевых пластин при онихомикозе.
Ключевые слова: дерматомицеты, кератин, кератинолитиче-ская активность, недерматомицеты
KERATINOLYTIC ACTIVITY OF FUNGI ISOLATED FROM PATIENTS' NAILS WITH ONYCHOMICOSIS
Pupkova M.A. (postgraduate student), Kubasova N.L. (postgraduate student)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology SEI APE SPb MAPE, Saint Petersburg, Russia
© Pupkova M.A., Kubasova N.L., 2010
The article presents the results of determination of keratinolytic activity of dermatomycetes and non-dermatomycetes isolated from patients' nails with onychomicosis.
Key words: dermatomycetes, keratin, keratinolytic activity, nonderma tomycetes
* Контактное лицо: Пупкова Марианна Андреевна
Тел.: 921-398-26-17
Наиболее частыми возбудителями онихомико-за признаны первичные патогены - дерматомицеты (Trichophyton rubrum, Т. mentagrophytes и др.). Условно-патогенные недерматомицеты, такие как дрожжевые (Candida spp. и др.), нитчатые (Fusarium spp., Acremonium spp., Aspergillus spp. и др.) также могут играть важную роль в возникновении этого заболевания, и их доля в этиологической структуре онихоми-коза, по данным разных авторов, составляет 10-30% [1-3]. Однако существуют объективные трудности при интерпретации результатов культурального исследования патологического материала (ногтевых пластин) в случае выделения недерматомицетов. Поскольку ногтевые чешуйки не являются в норме стерильным субстратом, то имеет место контаминация на разных этапах проведения материала от пациента до чашки Петри при посеве. Поэтому нередко гри-бы-недерматомицеты относят к контаминантам и не учитывают как истинных возбудителей онихомико-за. В этой связи определение кератинолитической активности микромицетов может быть полезным при оценке результатов микологического исследования ногтевых пластин при онихомикозе.
Цель исследования - изучить кератинолитиче-скую активность дерматомицетов и недерматомицетов (дрожжевых и нитчатых грибов), выделенных из ногтевых пластин при онихомикозе.
Среди наиболее часто используемых методов, с помощью которых оценивают кератинолитическую активность грибов, выделяют пять основных:
1. определение содержания в среде цистеина, белка и внеклеточной кератиназы с помощью спектрофотометра и/или электрофореза [4];
2. рост на кератиновых субстратах с последующей их микроскопией [5, 6];
3. визуальное определение лизиса на твердой питательной среде с кератином [7];
4. определение pH жидкой среды после инкубации [8];
5. с помощью химических реагентов - кератин-азура [9].
Для изучения кератинолитической активности грибов в данном исследовании использовали метод посева исследуемых микромицетов на кератиновые субстраты [5, 6].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали кератинолитическую активность дерматомицетов и недерматомицетов (дрожжевые и нитчатые грибы), выделенных с ногтевых пластин пациентов с подозрением на онихомикоз. Среди дерматомицетов регистрировали наиболее частых возбудителей инфекции ногтевых пластин - Trichophyton rubrum и Т. interdigitale”, среди дрожжевых недерматомицетов - в основном, грибы рода Candida (С. parapsilosis, C. albicans, C. dubliniensis, C. lusitaniae)
** Самостоятельный таксон вида (а не варианта) приведен
в версии атласа медицински значимых грибов де Хоога с
коллегами в 2009 г. [17].
и Trichosporon mucoides, среди нитчатых недерма-томицетов - Acremonium potronii, A. hyalinulum, Aspergillus versicolor, A. nidulans, A. terreus, Fusarium oxysporum, Mucor racemosus и Pénicillium commune.
Использовали специальную жидкую питательную среду для теста на перфорацию волоса, содержащую 5 мл дистиллированной воды и 20 мкл 10% дрожжевого экстракта [10]. В качестве кератинового субстрата в данную среду вносили несколько стерильных светлых детских волоса и 5 срезов со здоровых детских ногтей в каждую чашку Петри. Затем в среду с кератином вносили взвеси испытуемых культур густотой 10 ЕД (для нитчатых грибов) и 5 ЕД (для дрожжевых) по стандарту мутности в объеме 400 мкл. Контролем служила среда с кератином без культуры гриба. Инкубация проходила при 28 °С для нитчатых грибов, при 32°С - для дрожжевых грибов в течение 2 недель. Затем кератин-содержащие субстраты отмывали от мицелия механическим путем в дезинфицирующем растворе и просматривали в световом микроскопе с использованием раствора КОН (10%) и DMSO с целью обнаружения перфорации волоса грибом, а в ногте - инвазии микромицета [5, 6,
П].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Кератинолитическую активность грибов оценивали по наличию и интенсивности поражения волоса (поверхностная эрозия и перфорация), а также по наличию инвазии гриба и его распространенности в ногте по четырехбалльной шкале (таблица 1).
Таблица 1.
Система оценки поражения волос и ногтевых пластин
исследуемыми культурами микромицетов
Оценка Наличие перфорации и эрозии волос (активность) Наличие инвазии микромицета в ноготь
++++ (очень высокая) В каждом волосе В каждом или почти каждом поле зрения
+++ (высокая) Почти в каждом волосе В 2/3 полей зрения
++ (умеренная) В половине из исследуемых волос В1/3 полей зрения
+ (низкая) Редко Редко (единичныеэлементы гриба в 1-м или 2-х полях зрения)
- отрицательная) отсутствует отсутствует
Для того, чтобы провести дифференцирование между истинным присутствием гриба и случайно попавшим на ноготь из среды, учитывали тот мицелий в качестве истинного, который был обнаружен в глубине ногтевой пластины после ее размягчения с помощью КОН и 1)М8(). Тот же мицелий, который обнаруживали у свободного края размягченной пластинки, не учитывали.
Результаты исследования представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Результаты теста на перфорацию волоса и способность к инвазии ногтевой пластины
Груп- пы гри- бов Исследуемая культура, штамм № Наличие перфо- рации волоса Наличие поверх- ностной эрозии волос Инвазия гриба в ногтевую пластину Примечание
Грибы - дерматоми-цеты Trichophyton rubrum 597 - + ++++
Trichophyton interdigitale 148 ++++ ++++ ++++
Грибы - не дерматомицеты Mucor racemosus 100 +++ ++ - В ногте обнаружены единичные споры.
Pénicillium commune 550 - - -
Aspergillus nidulans 424 ++ +++ ++
Aspergillus versicolor 557 +++ ++ +
Aspergillus versicolor 514 ++ +++ -
Aspergillus versicolor 290 - ++ + Мицелий в ногте оченьтонкий (1,6 мкм).
Aspergillus terreus 213 ++++ - - В ногте обнаружены единичные споры
Acremonium hyalinulum Ы1 +++ ++ ++ Мицелий в ногте оченьтонкий (1,5 мкм).
Acremonium potronii 9 ++++ +++ +++
Fusarium oxysporum 39 ++ ++ ++ У данного штамма мицелий в ногте тоньше, чем у других штаммов этого рода гриба (2,2 мкм).
Fusarium oxysporum 566 - ++++ ++++
Fusarium oxysporum 671 +++ + ++++
Дрожжевые организмы Candida albicans 362 +++ ++ ++ Кутикула волос лизированав 80%, в ногтевой пластине обнаружены только дрожжевые почкующиеся клетки
Candida albicans 499 ++ ++ +
Trichosporon mucoides 281 ++ ++ +
Candida parapsilosis 504 ++ ++ +
Candida parapsilosis 614 +++ ++ +
Candida lusitaniae 126 +++ ++ +
Candida dubliniensis 343 +++ ++ +
В контрольной чашке Петри, где культура гриба
отсутствовала изначально, волосы и ногти оставались интактными (Рис. 1).
Рис. 1. Контрольная чашка Петри (среда с кератином без посева гриба). Отсутствие роста гриба на среде с кератином в контрольной чашке (А), здоровый волос (Б) и отсутствие мицелия в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DfvlSO). Увеличение х 400
Нами обнаружено, что Trichophyton rubrum (Рис. 2.) волосы не перфорирует, но слабо эрозирует кутикулу волоса, что совпадает с известными видовыми характеристиками; распространенность мицелия в ногте оценили максимальной (++++) как для Т. rubrum, так и для Т. interdigitale (Рис. 3.). Причем, для Т. interdigitale перфорацию и поверхностную эрозию также оценивали максимально (++++).
Рис. 2. Trichophyton rubrum. Рост на среде с кератином (А), эрозированный волос (Б) и активная инвазия гриба в чешуйки ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Рис. 4. Мисог гасето$и$. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и отсутствие инвазии гриба в чешуйки ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и 0М50). Увеличение х 400
Рис. 3. Trichophyton interdigitale. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и активная инвазия гриба в чешуйки ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Мисог racemosus (Рис. 4) обладал умеренной активностью при перфорации волоса (+++) и поверхностной эрозии (++), но не инвазировал ногтевую пластину. Pénicillium commune был не активен по этим показателям (Рис. 5)
1 li I
Рис. 5. Pénicillium commune. Рост на среде с кератином (А), здоровый волос (Б) и отсутствие мицелия в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400.
Aspergillus nidulans (Рис.6) и Acremonium hyaline lum (Рис. 7) были сравнимы по оцениваемым показателям (++).
Б
Рис. 6. Aspergillus nidulans. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и наличие мицелия в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
В
Рис. 7. Acremonium hyalinulum. Рост на среде с кератином (А), измененный волос (Б) и наличие тонкого мицелия (1,5 мкм) в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DM SO). Увеличение х 400
Штаммы Aspergillus versicolor (557, 514, 290) были умеренно активными в отношении волос и, как правило, неактивными - в отношении инвазии ногтевой пластины. Хотя A. versicolor 557 (Рис. 8.) перфорирует волос (+++) и эрозирует кутикулу волоса (++), размножение этого штамма в ногте оценивали как низкое (+). Примерно такую же картину отмечали в ногте для A. versicolor 290 (Рис. 9), однако, в отличие от предыдущего штамма, перфорация волос отсутствовала при наличии их слабой эрозии. Для 514-го штамма A. versicolor (Рис. 10) было характерно разрушение волос при отсутствии размножения в ногте.
В
Рис. 8. АврегдШтщг$Ыог 5Ш Рост на среде с кератином (А), поврежденный волос (Б) и наличие мицелия в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и 0М$0). Увеличение х 400
В I
Рис. 9. Aspergillus versicolor 290. Рост на среде с кератином (А), поврежденный волос (Б) и отсутствие инвазии гриба в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
В
Рис. 10. Aspergillus versicolor 514. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и отсутствие размножения гриба в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Несмотря на то, что разрушительная активность Aspergillus terreus (Рис. 11) и Trichophyton interdigitale в отношении волоса была оценена как очень высокая, следует отметить разный характер поражения волоса. Так, Т. interdigitale практически «пробуравливает» волос, тогда как Aspergillus terreus сильно изменяет конфигурацию волоса, i.e. его стенки не параллельны друг другу и сильно бугристы, а перфорация, как таковая, незначительна, однако поражение наблюдали в каждом волосе. В ногте A. terreus не размножался.
Рис, 11. Aspergillus terreus. Рост на среде с кератином (А), поврежденный волос (Б) и отсутствие инвазии гриба в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
В результате исследования Acremonium potronii (Рис. 12) обнаружили высокую активность по оцениваемым показателям, сравнимую с активностью Т. inter digitale. Примечательно, что Fusarium oxysporum 566 (Рис. 13) не перфорирует волосы при высокой поверхностной эрозии и обильном размножении в ногтевой пластине. Для F. oxysporum 671 (Рис. 14) характерно не только его обильное наличие, как у предыдущего штамма, но и высокая активность в отношении перфорации волос (+++). F. oxysporum 39 (Рис. 15) обладает умеренной активностью по перечисленным выше показателям (++).
В
Рис. 12. АсгетопШтроиопи. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и обилие тонкого мицелия (2 мкм) в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и ОМЮ). Увеличение х 400
В
Рис. 13. Fusarium oxysporum 566. Рост на среде с кератином (А), поверхностная эрозия волоса (Б) и обилие широкого мицелия (3 мкм) в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличениех400
В
Рис. 14. Fusarium oxysporum 671, Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и обилие широкого мицелия (4 мкм) в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Ч
Рис. 1 S. Fusarium oxysporum 39. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и мицелий в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
При оценке дрожжевых микромицетов, установлено, что почти все дрожжи оказались малоактивными в отношении волоса (в основном, это была поверхностная эрозия в виде лизиса кутикулы и небольшого изменения структуры волоса) и неактивными в отношении ногтевой пластины (единичные, редко почкующиеся дрожжевые клетки, которые вызывают сомнение в действительном размножении внутри ногтя), за исключением штамма Candida albicans 362 (Рис. 16). Этот штамм отличали высокая перфорирующая активность по отношению к волосу (+++), способность к лизису кутикулы и размножение в ногте (скопление активно почкующихся клеток).
В
Рис. 16, Candida albicans 362. Рост на среде с кератином (А перфорация волоса (Б) и активно почкующиеся клетки в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Trichosporon mucoides (Рис. 17) обнаруживали в ногтевой пластине редко (+), однако сомнений о том, что гриб размножается именно внутри ногтя не было, т.к. наблюдали растущий мицелий, наряду с единичными почкующимися клетками. Т. mucoides так же, как и Candida albicans 499 (Рис. 18) и С. parapsilosis 504 (Рис.19), перфорировали волос с умеренной активностью (++).
Б
И
Рис. 17. ТгкЬозрогоп тисоШе$. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и мицелий в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и ОМБО). Увеличение х 400
В
Рис. 18. Candida albicans 499. Рост на среде с кератином (А), измененный волос (Б) и единичные клетки в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
В
Рис. 19. Candida parapsilosis 504. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и почкующиеся клетки в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Candida parapsilosis 614 (Рис. 20), Candida lusita-niae (Рис. 21) и Candida dubliniensis (Рис. 22) изменяли структуру волоса (+++), однако наличие их в ногте регистрировали редко, в единичных полях зрения, равно как и у ос тальных дрожжевых организмов.
в
Рис. 20. Candida parapsilosis 614. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и единичные клетки в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
В
Рис. 21. Candida lusitaniae. Рост на среде с кератином (А), сильно измененная структура волоса (Б) и почкующиеся клетки в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO). Увеличение х 400
Б
В
Рис. 22. Candida dubliniensis. Рост на среде с кератином (А), перфорация волоса (Б) и единичные клетки в чешуйках ногтевой пластины (В). Световая микроскопия (раствор 10% КОН и DMSO), Увеличение х 400
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
По данным научной литературы [12], среди высокоактивных кератинолитиков - микромицетов, способных образовывать инвазивные структуры, вызывающие радиальную пенетрацию и поверхностную эрозию волоса одновременно, выделяют Chrysosporium keratinophilum, Microsporum gypseum, Penicillium frequentas, Rhizopus stolonifer, Trichophyton ajelloi. Acremonium sp., Aspergillus carneus, Nectria inventa, Penicillium citrinum, Paecilomyces vnrioli, Plectosphaerella cucumerina, Verticillium nubilum не проявляли такой активности. Эти же авторы впервые
описали кератинолигическую активность по аналогичным критериям у следующих грибов: Acremonium strictum, Chrysosporium pannorum, Cladosporium herbarum, Fusarium tricinctum, Gliocladium viride, Humicola fuscoatra var. fuscoatra, Nectria ventricosa, Penicillium griseofulvum, P. islandicum, Verticillium catenulatum, V psalliotae. Также к высокоактивным видам в отношении перфорации и эрозии относят Scopulariopsis brevicaulis [11], Chrysosporium georgiae, C. lucknowense, С. queenslandicum и C. tropicum [5].
Что касается других методов исследования кера-тинолитической активности, то были проанализированы дерматомицеты на предмет лизиса кератина на плотной среде вокруг колоний. Установлено, что T. verrucosum дает рост маленьких колоний (около 2 мм в диаметре), но при этом широкую зону лизиса (22-26 мм в диаметре), в связи с этим считают, что вид активен в секреции ферментов, разрушающих кератин. Большинство же штаммов формировали колонии 10-40 мм в диаметре, в то время как диаметр зоны лизиса был либо равен диаметру колонии, либо — немногим больше [7]. Ряд других авторов исследовали, кроме дерматомицетов, и другие грибы. Среди них по широкому диаметру лизиса вокруг колоний лидерами являлись виды рода Chrysosporium (C. indicum, C. keratinophilum, C. tropicum, C. queenslandicum, C. georgiae, C. luteum, C. pannicola). Для видов рода Microsporum характерны очень маленькие зоны лизиса, хотя рост на среде с нативным кератином был обильным. Trichophyton spp., в сравнении с Microsporum spp., отличался более высокой активностью в образовании зон лизиса и слабым ростом на среде с кератином. Активными из них были Trichophyton mentagrophytes и T. equinum. Aspergillus spp. и Penicillium spp. не образовывали зоны лизиса, что может свидетельствовать об отсутствии у них кератинолитической активности [13]. При сравнении результатов, полученных Этим методом и определением кератинолитической активности с помощью спектрофотометра, установили, что Acremonium spp. и Geotrichum sp образуют широкие зоны лизиса - на всю чашку, однако кератиназная активность, оцениваемая биохимическим методом, равна нулю. И, наоборот, для Aspergillus flavus характерна высокая, в сравнении с другими грибами, ферментативная активность (781 мЕд/мл), но зоны лизиса на чашках не слишком большие [14]. Показано, что Aspergillus niger и Trichoderma viride образуют широкую зону лизиса (010 и 9,5 мм соответственно), но при низкой кератинолитической активности (0,66 и 0,27 КЕ/мл соответственно)*", Однако авторы выделяют два рода, имеющие наивысшие значения как зон лизиса, так и ферментативной активности. К ним относят Scopulariopsis brevicaulis и Trichophyton mentagrophytes (зоны лизиса 10 и 11,5 мм в диаметре, и 1,9 и 1,7 KÈ/мл соответственно). При исследовании кератинолитической активности методом подще-лачивания среды выяснили, что оба вида изменяли
*** КЕ - единица кератинаэной активности.
pH с 7,5 до 8,7 на солевой среде с перьями домашних птиц [8].
Индийские ученые [15] сравнили несколько методов: содержание цистина и белка в среде, определение кератинолитической активности с помощью спектрофотометра и определение pH центрифугата. По содержанию цистина наиболее активен Chrysosporium spp. (от 28 мкг/мл), белка Scopulariopsis brevicaulis (65 мкг/мл) и Crysosporium раппогит (56 мкг/мл), по кератиназной активности
- Chrysosporium keratinophillum (12,5 КЕ/мл), и наименее активен - Microascus manganii (4,0 КЕ/мл). Исследуемые грибы, за исключением М. manganii, заще-лачивали среду, в которой они росли [15]. При оценке результатов несколькими методами [16] (определение конечного pH среды, содержание в среде белка, цистеина и внеклеточной кератиназы) максимальные изменения pH были вызваны Chrysosporium queenslandicum (9,2), минимальные - Sepedonium maheshwarianum (7,9). По количеству высвобождаемого в среду цистеина максимальные значения установлены для Chrysosporium tropicum (27 мкг/ мл) и Malbranchea chrysosporoidea (26 мкг/мл), минимальные - для Sepedonium maheshwarianum и Aspergillus flavus (10 мкг/мл). Максимум белка в среде обнаруживали у Scopulariopsis brevicaulis (60 мкг/мл) и Chrysosporium tropicum (54 мкг/мл), минимум - у Chaetomium globosum и Curvularia lunata (24 мкг/мл). Содержание внеклеточной кератиназы было максимальным у Chrysosporium keratinophillum (12 КЕ/мл) и Ch. tropicum (11,3 КЕ/мл), минимальным
- у Chaetomium globosum (5,5 КЕ/мл). Как следует из вышесказанного, совпадения результатов, полученных разными методами, имели место для некоторых культур.
Многие штаммы микромицетов, протестированные другими авторами на кератинолитическую активность с помощью кератин азура, давали очень быстрый результат (окраска появлялась в течение недели). Однако несколько изолятов, известных а priori как кератинолитики, показали негативную реакцию по разрушению кератина в течение 4-х недель инкубации и, только по истечении 6 недель, давали слабую положительную реакцию (например, Trichophyton rubrum). Густота роста гриба на этой среде не была взаимосвязана со степенью окрашивания среды. Например, Amauroascus purpureus давал хорошее окрашивание среды при отсутствии видимого роста и, наоборот, Chrysosporium vallenarense
давал хороший рост, но без окрашивания среды [9].
С помощью этого метода было протестировано 20 штаммов из семейства Arthrodermataceae, выделенных из кератиновых субстратов. По некоторым данным, 14 из них разрушали волос перфорацией или эрозией. В основном, это члены рода Microsporum с позитивным тестом на перфорацию волоса и, как правило, с позитивным тестом с кератин азуром после 7 дней инкубации. Trichophyton spp. медленнее реагировал на кератин азур с тенденцией к положительному результату между 7 и 28 днями инкубации. Ни один из тестируемых членов семейств Gymnoascaceae (5 видов) и Trichocomaceae (6 видов) не давал положительного результата с тестами ни на перфорацию волоса, ни на эрозию.
30% тестируемых видов порядка Onygenales (исследовали 24 вида) дали положительную реакцию с кератин азуром в течение 7 дней инкубации, после 28 дней процент возрос до 39. Также были исследованы Chaetomium globosum, Pochonia chlamydosporia и Schizophyllum commune. Первые два вида, хотя и образуют органы перфорации на волосе, но ни один из перечисленных трех не окрашивал среду с кератин азуром [9].
Таким образом, можно сделать вывод о том, что универсального метода определения кератинолитической активности не предложено до настоящего времени, т.к. ни один из этих методов, ни при использовании нескольких методов не давали сравнимых результатов по кератинолитической активности гриба.
На основании данных настоящего исследования кератинолитической активности микромицетов можно заключить, что наиболее активными были дерматомицеты как в отношении волос, так и ногтевых пластин. Нитчатые недерматомицеты обладали высокой, умеренной или низкой активностью, дрожжевые организмы - высокой или умеренной, за исключением низкого показателя инвазии в ногтевую пластину. Наряду с этим, необходимо помнить о межштаммовых различиях микромицетов.
Следовательно, инвазия гриба вглубь здоровой ногтевой пластины является ярким показателем способности микромицета поражать кератинизиро-ванные ткани и может служить одним из критериев определения патогенности микромицета в свете оценки результатов культурального исследования поражения ногтевых пластин при онихомикозе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева Н.В., Разнатовский К.И., Котрехова А.П. и др. Этиология онихомикоза стоп в г. Санкт-Петербурге и г. Москве. Результаты проспективного открытого многоцентрового исследования //Ж.Проблемы мед. микологии. -2009 - Т.11, №2. - С. 14-18.
2. Сергеев А.Ю. Грибковые заболевания ногтей: 2-е изд. - М.: «Национальная академия микологии», 2007. - 156 с.
3. Baran R., et al. Onychomycosis. The current approach to diagnosis and therapy. 2nd edition, 2006.
4. Gradisar H., Friedrich J, Krizaj I. and Jerala R. Similarities and Specificities of Fungal Keratinolytic Proteases: Comparison of Keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to Some Known Proteases// Appl. and Env. Microbiol. - 2005. - P. 3420-3426.
5. Mitola G., Escalona F., Salas R., et al. Morphological characterization of in-vitro human hair keratinolysis, produced by identified wild strains of Chrysosporium species//Mycopathologia.- 2002. - Vol.156. - P.163-169.
6. Kushwaha R.K.S. and Gupta P. Relevance of keratinophilic fungi//Current Science.- 2008. -Vol. 94, №6.
7. WawrzkiewiczK., Wolski T. &Lobarzewski J. Screening the keratinolytic activity of dermatophytes in vitro// Mycopathologia. -1991. -Vol.114. -P. 1-8.
8. Anbu P., Gopinath S.C.B., Hilda A., etal. Secretion of keratinolytic enzymes and keratinolysis by Scopulariopsis brevicaulis and Trichophyton mentagrophytes: regression analysis// Can. J. Microbiol. - 2006. - Vol.52. - P. 1060-1069.
9. Scott J.A. & Untereiner W.A. Determination of keratin degradation by fungi using keratin azure// Med. Mycology. - 2004.
- Vol. 42. - P. 239-246.
10. Shu-hui Tan C.,HoekstraE.S. and Samson R. A. Fungi that cause superficial mycoses. CentraalbureauvoorSchimmelcultures, Baarn. In collaboration with the Dr. Paul Janssen Medical Institute. - 1994. - P.108.
11. Marchisio V.F., FusconiA. and Querio F.L. Scopulariopsis brevicaulis: a keratinophilic or a keratinolytic fungus? // Mycoses.
- 2000. - Vol.43. - P. 281-292.
12. Gupta R., Ramnani P. Microbial keratinases and their perspective applications: an overview// Appl. Microbiol. Biotechnol.
- 2006. - Vol.4.-P.l-13.
13. El-Naghy M. A., El-Ktatny M.S., Fadl-Allah E.M. & Nazeer WW. Degradation of chicken feathers by Chrysosporium georgiae// Mycopathologia. - 1998. - Vol.143. - P. 77-84.
14. Friedrich J., Gradisar H., Mandin D. and Chaumont J.P. Screening fungi for synthesis of keratinolytic enzymes// Letters in Applied Microbiology. - 1999. - Vol.28. - P. 127-130.
15. Kaul S. & Sumbali G. Keratinolysis by poultry farm soil fungi // Mycopathologia. - 1997. - Vol.139. - P. 137-140.
16. Kaul S. & Sumbali G. Production of extracellular keratinases by keratinophilic fungal species inhabiting feathers of living poultry birds (Gallus domesticus): A comparison // Mycopathologia. - 1999. - Vol.146. - P. 19-24.
17. de Hoog G.S. et al. Atlas of clinical fungi. Atlas version 2009.05 CBS, Universität Rovira i Virgili. 2009.
Поступила в редакцию журнала 30.06.2010 Рецензент: Богомолова Т. С.
