CC BY
64УДК 616.992:616-057
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЕРАТИНОЛИТИЧЕО КОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ МИКРО-МИЦЕТОВ: (ОБЗОР)
Пупкова М.А. (аспирант)*
НИИ медицинской микологии им.П.Н.Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО, Санкт-Петербург, Россия
© Пупкова М.А., 2010
В статье приведен краткий обзор литературы по определению кератинолитической активности преимущественно дерма-томицетов и некоторых других грибов.
Ключевые слова: дерматомицеты, кератин, кератинолитиче-ская активность, недерматомицеты
DEFINITION OF KERATINOLYTIC ACTIVITY OF FUNGI (REVIEW)
Pupkova M.A. (postgraduate student)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology SEI APE SPb MAPE, Saint Petersburg, Russia
© Pupkova MA., 2010
The article describes a brief overview of the literature on the evaluation of keratinolytic activity dermatomycetes and non-dermatomycetes.
Key words: dermatomycetes, keratin, keratinolytic activity, nonderma tomycetes
* Контактное лицо: Пупкова Марианна Андреевна
Тел.: 921-398-26-17
Кератин содержит большое количество различных связей, к примеру, дисульфидные, водородные, поэтому он является достаточно устойчивой структурой к разрушению протеолитическими ферментами, такими как трипсин, пепсин и папаин [1]. Однако в природе имеются микроорганизмы, синтезирующие кератиназы, способные разрушать нативный кератин до малых пептидов, которые затем могут быть ассимилированы клетками.
Кератинолитические ферменты образуются многими бактериями, включая актиномицеты, и грибами [2]. Среди последних значительная роль принадлежит дерматомицетам, которые в сапротрофном состоянии обладают способностью переваривать кератин in vitro и использовать его как субстрат, а некоторые могут проникать в ткани (in vivo) и провоцировать дерматомикозы [3] у людей и животных. Однако не все грибы, изолируемые от инфицированных лиц, имеют патогенетическое значение, поскольку так называемые недерматомицеты не включают в свой метаболизм кератин, содержащийся в эпидермисе млекопитающих, волосах, ногтях, шерсти, рогах, копытах, соединительной ткани, костях, перьях домашних птиц. Субстраты, содержащие кератин и попадающие в почву, разрушаются медленно и могут выступать резервуаром патогенных грибов. Декомпозиция кератина в почве сопровождается возрастанием соотношения углерода и азота, что, в свою очередь, стимулирует рост и развитие непатогенных кератинофилов.
Кератин имеет достаточно жесткую химическую структуру, устойчивую к протеолитическим ферментам. Он «укомплектован» сверхспиральными поли-пептидными цепочками, соединенными межмоле-кулярными дисульфидными мостиками и другими связями.
Известны два типа кератина:
♦ а-кератин - содержит много простых аминокислот с преобладанием цистина и, соответственно, дисульфидных мостиков; ригидная, ломкая структура в рогах и ногтях содержит до 22% цистина; мягкая, пластичная, гибкая структура в коже, волосах и шерсти содержит 10-14% цистина.
♦ (3-кератин - имеет меньше цистина и цистеина, но богат такими аминокислотами, как глицин, аланин и серин; обнаружен в чешуе, когтях, клюве птиц.
Только а-кератин заметно устойчив к разрушению микробами, что является результатом плотно упакованных полипептидных цепочек в а-спиральной структуре и дисульфидных мостиков. Всего несколько организмов способны разрушить такой вид кератина, среди них: дерматомицеты, некоторые почвенные грибы, принадлежащие к аскомицетам, митоспо-ровым грибам и мукорам.
Кератинолизис, вызванный грибами, сопровождается специфическим ростом и образованием особых морфологических грибных элементов, проявляющих специфическое воздействие на субстрат, включая механическое и ферментативное.
In vitro морфологические признаки колонизации и проникновения в субстрат исследуют с помощью световых микроскопов и сканирующей электронной микроскопии ультратонких срезов. Ряд авторов, используя световую микроскопию, выделяют два типа одинаковой эрозии и радиальной пенетрации (с помощью «балонообразных пробуравливающих» и «широких пробуравливающих» гиф) [4].
Некоторые грибы, заселяющие кератиновые субстраты, не способны разрушать их, но просто используют продукты распада кератина после воздействия других грибов. Показано, что водные экстракты неповрежденных человеческих и животных волос содержат заметное количество мочевой кислоты, мочевины, аммиака, пентозы, гликогена, фенолов и аминокислот, которые, вероятно, достаточны для поддержания роста некоторых грибов. Простой рост микромицета на кератиновых остатках, видимый невооруженным глазом, не является показателем его кератинолитической активности.
Морфологическое исследование различных уровней повреждения - единственный способ определить способность каждого вида гриба лизировать кератин, невзирая на наличие специфических грибных элементов в области лизиса белкового полимера. Тем не менее, механизмы распада кератина еще не ясны до конца, хотя «сульфитолизис» (неферментативное разрушение кератина), по-видимому, является одним из наиболее правдоподобных.
Ранее ученые предполагали, что термин «керати-нолитик» применим для «колонизаторов», которые способны воздействовать на кератин и разрушать его, в то время как «транзитные колонизаторы», способные лишь использовать более легко разрушаемые субстанции, должны называться кератинофилами. Кератинолитический гриб может разложить кератин в окружающей среде, будучи потенциально болезнетворным для человека и животных. Кератинофильные грибы лишь используют материалы, естественно связанные с кератином, или используют продукты его деструкции [3]. Также и по V.E Marchisio [4] грибы-кератинофилы включают в себя природные колонизаторы кератиновых субстратов, в то время как грибами-кератинолигиками являются те, которые способны воздействовать на сам субстрат (кератин) определенным способом.
Наиболее активными кератинолитиками являются следующие дерматомицеты и их «сподвижники»: Microsporum, Trichophyton и его телеомор-фы, Aphanoascus, Arthrographis, Chrysosporium, Geomyces, Gymnoascus, Sporendonema, Cladobotryum, Pectinotrichum, Renispora, Malbranchea и Myceliophthora, хотя способы их воздействия на кератин сходны с описанными для прочих видов микромицетов - Alternaría, Beauveria, Cladosporium, Mucor, Paecilomyces, Penicillium и Scopulariopsis, и прочие роды, принадлежащие к семействам Arthrodermataceae и Onygenaceae, порядка Onygenales, класса Ascomycetes [5].
Кератинолизис, подобно прочим биохимическим реакциям грибов, постоянен и невидоспецифичен, поскольку ферменты, участвующие в нем, активны не у каждого гриба. Активные и неактивные штаммы встречаются внутри каждого из перечисленных выше родов в одинаковых условиях окружающей среды обитания.
В качестве субстратов для определения кератиназ наиболее часто используют волосы и ногти. Динамику их разрушения прослеживают по анатомическим и гистохимическим особенностям.
Волос имеет сложное, гетерогенное строение. Распространение и организация кератина его некоторых частей одинаково разнообразны. Форма кутикулы волоса - очень эффективная защита от повреждений окружающей среды (воздействия УФ лучей, механического воздействия). Ее клетки содержат большое количество аморфного кератина, особенно - в тонком поверхностном слое (слой А) и во внутренних слоях, оба они содержат большое количество цистина (Рис. 1), Экзокутикула также богата цистином, и, наоборот, в эндокутикуле очень мало кератина, в ней преобладают «цитоплазматические остатки» (митохондрий, ядер и ретикулюма).
Рис. 1. Схематичное изображение продольного среза области луковицы человеческого волоса. Р - сосочек,
/? - зародышевый листок, О - область разделения, и - недифференцированный матрикс, М - область меланоцитов, Г-область, в которой формируется волокнистый кератин, К-область начинающейся кератинизации. Цифры 1-6 обозначают кортекс, кутикулу волоса, оболочку кутикулы, слой Хюкслея, слой Хенле, внешнюю корневую оболочку соответственно
Ногтевые пластины имеют дорзальный, промежуточный и вентральный слои, которые различны по толщине, плотности и типу соединений между ними. Однако, в общей сложности, ноготь более однородный, чем волос. Анализами кератина ногтя показано, что волосы и ногти обладают почти сходной фракцией, тогда как на основании исследования ультраструктуры и ультрагистохимии установлено, что микро- и макрофибрилы организованы подобно волосяному кортексу, и что их слои содержат большое количество дисульфидных мостиков по периферии каждой клетки ногтя.
Исследования способности грибов разрушать ке-
ратин относят, в основном, к разряду биохимических и морфологических. Биохимические исследования кератинолизиса базируются на активности секрети-руемых ферментов, поскольку они могут быть важными в определении вирулентности и/или патогенности гриба и, кроме того, потому, что они имеют биотехнологическое применение в устранении остаточных материалов на птицефермах, кожевенных заводах, производстве пищи для животных, удобрений, клея, редких аминокислот.
Многие кератиназы имеют общие характеристики, но, несмотря на это, различны по происхождению. Они принадлежат, главным образом, к внеклеточным сериновым протеазам, за исключением кератиназ дрожжей, являющихся аспарагиновыми протеазами. Они наиболее активны в щелочной среде (pH 6,0-8,0) при оптимальной температуре 30 'С..
Возможные пути применения кератиназ совершенно различны. В основном, они необходимы там, где нужен гидролиз кератина, например в медицине, где насущна доставка лекарственного вещества через ногтевую пластинку или разрушение гиперкера-тинизированной кожи [6].
Разрушение дисульфидных мостиков наиболее вероятно сульфитолизисом, который является начальным этапом разрушения кератина, доступного для протеолитических ферментов. Это может объяснить отсутствие внеклеточных кератиназ на ранних этапах разрушения субстрата. Следовательно, по-настоящему демонстрация кератинолизиса предоставляется in vitro морфологическими исследованиями.
Первыми исследователями, проводившими световую микроскопию разрушенного кератина, были Ванбрезегем [7], Barlow & Chattaway [8]. Однако основополагающим было исследование English М.Р., который представил детальное описание изменений гифов в процессе колонизации волоса дерматомице-тами [9,10] и другими кератинофильными грибами [11,12], которые были выделены из кератина посредством его разрушения.
Морфологическими проявлениями кератинолизиса в волосе являются вовлеченные в процесс элементы грибов и их взаимосвязь с матриксом, последовательность событий глубоко исследуют с помощью светового микроскопа. Определяют две основные формы воздействия, именуемых поверхностной эрозией и радиальным проникновением. При поверхностной эрозии происходит постепенное разрушение волоса снаружи внутрь благодаря проникновению гифы, путь которой лежит на поверхности кутикулярных чешуек. Они приподнимают кутикулу и затем разрушают чешуйки, начиная с внутренних слоев.
Задействованная в этой активности гифа может сохранять свой нормальный внешний вид или расширяться до формы коротких ответвлений и давать начало дочерним структурам [9] (Рис.2). В кортексе эти гифы развиваются еще дальше, и некоторые мо-
гут привести к образованию уплощенных разветвленных листов (эрозийный мицелий Инглиша). Эти измененные гифы, вместе с теми, которые сохраняют свой нормальный внешний вид, формируют различное обширное покрытие вокруг волоса, которое обусловливает равномерность поверхностной эрозии. Гифа может развиваться и далее, проникать в другие области кортекса через межклеточные пространства.
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия поверхности кутикулы. Отдельная гифа (Н) на поверхности кутикулы образует короткое ответвление, что является начальной стадией образования пробуравливающей гифы. Единица измерения — 0,1 мм
Радиальное проникновение является случайным воздействием различных специализированных гиф, проникающих в волос под прямым углом по отношению к поверхности. Они и являются «пробуравливающими гифами Инглиша» и органами перфорации. Широкая пробуравливающая гифа средних размеров в диаметре и вздутая пробуравливающая гифа, подобная широкой пробуравливающей гифе, поражают внешние слои кортекса, но расширяясь до баллонообразной формы, возрастает радиус ее распространения, что, возможно, и снижает плотность частей волоса. Зоны лизиса вокруг этих органов перфорации значительно больше, чем сами гифы, их образующие. Обе формы воздействия обычно сосуществуют.
Дальнейшую информацию получают с помощью электронной микроскопии (Рис.З).
Рис.З. Сканирующая электронная микроскопия. Гифа (Н), проникающая в клетки ногтя и активно расслаивающая их. Единица измерения — 1 мм
Дерматомицетам уделяют внимание в заметном числе работ, в большинстве которых показана ферментативная сторона разрушения.
Проникновение гифы под чешуйки в кутикуле сопровождалось инвазией некератинизированных клеточных мембран и эндокутикулы. Экзокутикула является тонким слоем, соседствующим с внутренней поверхностью чешуек, и, особенно, внешнего, наиболее устойчивого слоя А. В кортексе клеточные мембраны разрушаются первыми, за ними следуют межмакрофибриллярный матрикс, тонкий слой и микрофибриллы. Наиболее устойчивой областью является межмакрофибриллярный матрикс. Подобные заключения были сделаны в исследованиях двух недерматомицетов, но кератинолитиков -Скгувозрогшт 1горкит и Бсори1апорт Что касается поверхностной эрозии, но не радиальной пенетрации, то в этом случае пробуравливающая гифа проходит через слои волоса независимо от степени кератипизации. Это может иллюстрировать их способность концентрировать свою секреторную активность на своих верхушках и, таким образом, действовать словно дрель. Однако, согласно этому представлению, ферменты распространяются еще и латерально после пробуравливания и постепенного переваривания компонентов волоса в описанной последовательности. Пробуравливающая гифа, прорастая подобным образом, может давать ответвления, что еще больше увеличивает зону лизиса.
Ногти, в качестве фактора роста для керати-нолитических грибов, используют в меньшей степени. Имеются данные, касающиеся 'Ясорьйаг'юрш ЬгеукаиНя, который, как правило, наблюдают при онихомикозах [13], иногда в качестве первичного патогена, но чаще, в качестве вторичного при дерматомикозах или травмах. Такие повреждения ногтей подобны повреждениям кортекса волоса и следуют порядку, определенному содержанием цистина. Некоторые исследователи показывают, что гифы также ведут себя, как и в волосе.
Эпителий является главным барьером на пути «пассивной» инвазии грибов. Проникновение в него, несомненно, является результатом ферментативного разрушения его поверхностных макромолекул, включая кератины (Рис. 4).
Рис.4. Сканирующая электронная микроскопия. Приподнятое чешуйки (СБ), прорывающей под ней гифой (Н). Единица измерения — 1 мм
Следовательно, кератинолитическая активность грибов может быть расценена как возможный фактор вирулентности.
Если способность грибов разрушать а-кератин in vitro имеет реальное значение в прогнозировании способности поражать in vivo, тогда все почвенные кератинолитики - потенциальные патогены для человека и животных. Многие кератинолитические сапротрофы часто выделяют с кожи животных и людей, меха и перьев, но не всегда возможно определить транзиторный, случайный ли это '«гость» или способный вызывать повреждение кожи. В лаборатории их часто рассматривают контаминантами. Следовательно, вопрос об их патогенетической роли еще остается открытым.
В процессе роста дерматомицетов исключительно на чешуйках кожи, ногтях или волосах, используя их в качестве единственных источников углерода и азота, резонно предположить, что в течении инфекции дерматомицеты ведут себя, как на белковой среде, и также секретируют различные зкзопротеазы. Совместное действие экзо- и эндопротеаз обеспечивает разрушение кератинизированых тканей до аимнокислот и коротких пептидов, ассимилируемых дерматомицетами [14].
Секретируемые дерматомицетами протеазы являются антигенными структурами и вызывают клеточно-опосредованную и гуморальную иммунные реакции. Специфический лимфопролиферативный иммунный ответ по отношению к рекомбинантным протеазам М. canis был исследован при экспериментальном заражении этим грибом свиной щетины [15, 16]. Два антигена-протеазы, похожие на те, которые секретирует Trichophyton sp., вызывают гиперчувствительность немедленного или замедленного типа в кожных пробах у различных индивидуумов [17]. Гиперчувствительность немедленного типа сопровождается хроническими инфекциями и присутствием IgE - антител к очищенным антигенам Trichophyton. В противовес сказанному, гиперчувствительность замедленного типа сопровождается сильными воспалительными явлениями, появляющимися остро и спонтанно.
Эндо- и экзопротеазы многих микроорганизмов очень эффективно взаимодействуют в процессе разрушения белка. Очевидно, высокая кератинолитическая активность эндопротеаз Т. rubrum и других дерматомицетов играет важную роль в вирулентности этих микроорганизмов. Aspergillus spp. также секретируют ряд эндо- и экзопротеаз, способных разрушать белки до олигопептидов и свободных ами-покислот, которые затем ассимилируются ими [14]. Четыре аминопептидазы Т. rubrum проявили активность, подобную активности таковым у A. fumigatus [18]. Множество пептидаз, которые высвобождаются после воздействия эндопротеаз, могут впоследствии быть разрушены до аминокислот и дипептидов тем же путем, который используют Aspergillus spp. [19]. Эффективное разрушение белка кератиновых тка-
ней гидролитическими ферментами сопровождается одновременным снижением цистиновых дисульфид -ных мостиков, которые являются важным структурным признаком кератинового комплекса [1, 20,21].
Эффективна in vitro деградация гидролитическими ферментами кератин-азура, имеющего структуру волоса, что возможно только в присутствии восстановителя, такого как 1% (З-меркаптоэтанол или дитиотреитол (ДТТ). В процессе инфекции дерма-томицеты и другие септированные грибы выделяли сульфит в качестве редуцирующего агента. В присутствии сульфита дисульфидные мостики кератинового субстрата немедленно расщеплялись на цистеин и .S'-сул ьф о ц ис те и 11. Присутствие сульфоцистеина подтверждается после воздействия Microsporum gypseum на человеческие волосы [67]. Это соединение было обнаружено в свободной форме и в виде олигопептидов - основных продуктов кератинолизи-са. Дерматомицеты как высоко специализированные грибы способны использовать цистин в составе питательного субстрата и выделять сульфит, который появляется среди продуктов метаболизма цистеи-новых остатков. При наличии дисульфидных связей сульфит переходит в форму S-сульфоцистеина. Сульфит, очевидно, не мешает ферментам, секре-тируемым грибами in vivo. В подтверждение этому, только сульфит обнаруживается in vitro, когда его количество превышает количество цистина [21].
Кератинофильные грибы проявляют выраженную способность потреблять белки в качестве единственных источников углерода и азота. К тому же белковые субстраты содержат больше азота, чем углерода, и поэтому кератинофильные грибы при росте на белоксодержащих средах (равно, как и на средах с пептидами и/или аминокислотами) обычно, в отличие от большинства других грибов, подщелачивают среды.
Имеются интересные данные об источниках и метаболизме серы, включая образование сульфата и связанного сульфита в форме S-сульфоцистеина, из которого сульфит освобождается («сульфито-
лизис») благодаря «цианидной реакции». Главным продуктом окисления сульфоцистеина является сульфат, но свободный сульфит также обнаруживается в культуральной жидкости, а при сравнительно быстром росте культуры кератинофильного гриба он оказывается преобладающим.
Если разрушить кератин до его заражения грибами (мелко размолоть), то он будет с большей готовностью поражаться различными грибами, даже теми, которые не поражают нативный кератин. Дело в том, что размалывание резко снижает содержание цистина в кератине. Дисульфидные мостики в кератине стабилизируют его стереохимическую конфигурацию, которая и отвечает за сопротивление к химическим веществам и ферментативному воздействию. После разрушения дисульфидных мостиков, кератин становится легко разрушаемым и затем теряет свою естественную нерастворимость и сопротивляемость протеазам. Возникновение небольшой степени деградации может произвести визуально обманчивое впечатление о степени разрушения кератина. К примеру, при воздействии протеолитических ферментов на шерсть, только 10% ее веса может быть растворено, но клеточные компоненты нерастворенных волокон шерсти могут быть полностью разрушены. И, наоборот, хотя внешне может показаться, что волокна сильно разрушены, 90% шерсти может остаться морфологически и химически не измененными. Это, очевидно, отражает то, что визуальное определение роста гриба на кератине не является показательным для определения его способности разрушать субстрат.
При определении кератинолитической активности важно определение каждого участвующего и высвобождающегося компонента: цистина, цистеина, неорганического тиосульфата, сульфита, кератина-зы, общего белка, изменения щелочности в культуральном фильтрате, роста на кератиновых субстратах и образования на них соответствующих грибных элементов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Williams С.М., Richter С.S., Mackenzie J.M. Jr., Shih j.C. Isolation, identification and characterization of a feather degrading bacterium // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - Vol.56. - P. 1509-1515.
2. Gupta R., Ramnani P. Microbial keratinases and their perspective applications: an overview // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. - Vol.4. - P. 1-13.
3. Блинов Н.П. Рецензия на книгу «Биология дерматофитов и других кератинофильных грибов». Под ред. Р.К.С. Куш-вага и X. Гуарро, 2000, 176 с. // Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2000. - Т.2, №4. - С. 50-59.
4. Marchisio V. F. Keratinophilic fungi: Their role in nature and degradation of keratinic substrates // Revista Iberoamericana de Micologia Apdo. - 2000. - 699 p.
5. Kushwaha R. K. S. and Pallavi Gupta. Relevance of keratinophilic fungi // Current science. - 2008. - Vol. 94, №6. - 706
P- ^ ^
6. Gradisar H., Friedrich J, Krizaj I. and Jerala R. Similarities and Specificities of Fungal Keratinolytic Proteases: Comparison of Keratinases of Paecilomyces marquandii and Doratomyces microsporus to Some Known Proteases // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - P. 3420-3426.
7. Vanbreuseghem R. Keratin digestion by dermatophytes: a specific diagnostic method // Mycologia. - 1952. - Vol. 44. - P. 176-182.
8. Barlow A.J.E., Chattaway EWW. Attack of chemically modified keratin by certain dermatophytes II]. Invest. Dermatol. -1955. - Vol. 24. - P.65-74.
9. English M.P. The saprophytic growth of keratinophilic fungi on keratin // Sabouraudia. - 1963. - Vol. 2. - P. 115-130.
10. English M.P. The developmental morphology of the perforating organs and eroding mycelium of dermatophytes // Sabouraudia. - 1968. - Vol. 6. - P. 218-227.
11. English M.P. Destruction of hair by two species of Chrysosporium // Trans. Br. Mycol. Soc. - 1976. - Vol. 66. - P. 357-358.
12. English M.P. The saprophytic growth of non-keratinophilic fungi on keratinized substrata and a comparison with keratinophilic fungi // Trans. Br. Mycol. Soc. - 1965. - Vol. 48. - P. 219-235.
13. Hoogde G., Guarro J, Gene J., Figueras M. Atlas of clinical fungi. - 2-ed. - CBS, The Netherlands, Reus, Spain, 2000. - 56 P-
14. Monod M. Secreted Proteases from Dermatophytes //Mycopathologia. - 2008. - Vol. 166. - P.285-294.
15. Descamps F., Brouta F., Vermout S., et al. Recombinant expression and antigenic properties of a 31.5-kDa keratinolytic subtilisin-like serine protease from Microsporum canis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2003. - Vol. 38. - P.29-34.
16. Brouta F., Descamps F., Vermout S., et al. Humoral and cellular immune response to a Microsporum canis recombinant keratinolytic metalloprotease (r-MEP3) in experimentally infected guinea pigs// Med. Mycol. -2003. - Vol. 41. - P. 495502.
17. Woodfolk J.A. Allergy and dermatophytes // Clin. Microbiol. Rev. - 2005. - Vol. 18. - P.30-43.
18. Monod М., Le'chenne B., Jousson O., et al. Aminopeptidases and dipeptidyl-peptidases secreted by the dermatophyte Trichophyton rubrum // Microbiology. - 2005. - Vol. 151. - P.145-55.
19. Byun Т., KofodL., Blinkovsky A. Synergistic action of an X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase and a no specific aminopeptidase in protein hydrolysis // J. Food Chem. - 2001. - Vol. 49. - P.2061-3.
20. Jousson O., Le 'chenne B., Bontems O., et al. Secreted subtilisin gene family in Trichophyton rubrum // Gene. - 2004. - Vol. 339. - P.79-88.
21. Kunert J. Physiology of keratinophilic fungi / In: Kushwaha R.K.S., Guarro J., editors. Biology of dermatophytes and other keratinophilic fungi. - Bilbao: Revista Iberoamericana de Micologi'a, 2000. -P.77-85.
Поступила в редакцию журнала 12.03.2010
Рецензент: Н.П. Блинов
