Переработка отходов птицефабрик: современные подходы и перспективы Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.6

ПЕРЕРАБОТКА ОТХОДОВ ПТИЦЕФАБРИК: СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ*

© 2017 О. А. Подосокорская

канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник лаборатории метаболизма экстремофильных прокариот e-mail: podosokorskaya@gmail. com

Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук

Переработка отходов предприятий пищевой промышленности является одним из приоритетных направлений развития современных биотехнологий. Биодеградация отходов птицефабрик - наиболее безопасный и перспективный подход к их утилизации. Использование термофильных протеолитических микроорганизмов позволяет легко контролировать процесс переработки и проводить его с высокой скоростью. Продукты разложения пухо-перьевого сырья могут служить ценным сырьем для получения биополимеров, биотоплива и сельскохозяйственных удобрений.

Ключевые слова: утилизация отходов, термофильные микроорганизмы, микробные биотехнологии

Безопасная и энергоэффективная утилизация отходов животного происхождения является одной из важнейших задач для предприятий пищевой промышленности. Создание высокоэффективных технологий биоконверсии возобновляемого сырья позволяет не только снизить экологическую нагрузку, но и получать продукты с добавочной стоимостью. Особую актуальность проблема утилизации отходов имеет для животноводства в целом и птицеперерабатывающей промышленности в частности. В процессе забоя скота и птицы и переработки продуктов животноводства образуется большое количество отходов белковой природы, в то же время переработка отходов животного происхождения практически отсутствует.

В настоящее время в России сокращается ввоз мяса птицы в рамках Госпрограммы развития АПК на 2013-2020 гг., подразумевающей стимулирование внутреннего производства. Доля мяса птицы в общем объеме производства мяса достигла 42% против 18% в 1990 г., что соответствует мировым тенденциям. Отечественное производство мяса птицы на душу населения в 2016 году составило 31,8 кг. С увеличением объемов производства мяса птицы возрастают и объёмы отходов ее потрошения. Особые трудности возникают при переработке пухо-перьевых отходов, составляющих около 7,5% от живого веса птицы. Несложно посчитать, что современный уровень производства мяса птицы в России соответствует выработке около 350 тыс. тонн сухого пера в год (рис.).

Пухо-перьевые отходы отличаются высоким содержанием кератина. Кератин -это нерастворимый структурный белок, составляющий основу не только пера, но и волос, шерсти и т. д. Кератин слабо подвержен деградации из-за большого числа внутримолекулярных дисульфидных связей и уникальной трехмерной структуры [Lynch et al. 1986]. Пепсин, трипсин и бактериальные протеиназы не действуют на кератины. В перьевой муке содержатся важные аминокислоты, но сама по себе она не

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 15-34-70041 «мол_а_мос».

имеет кормовой ценности. Вместе с тем при рациональном подходе к биоконверсии кератинсодержащих отходов можно получить множество полезных продуктов - от белковых гидролизатов до биополимеров и биоводорода. Одними из наиболее привлекательных продуктов переработки кератинсодержащих отходов с экономической точки зрения являются биоразлагаемые полимеры. Интерес к ним обусловлен ухудшением экологической обстановки и истощением полезных ископаемых [Vroman and Tighzert 2009]. Наконец, стоит вспомнить, что дефицит биогумуса в России достигает 1,5 млн тонн в год, а в каждом килограмме пера содержится до 750 г чистого белка в форме, пригодной после определенной обработки для использования в качестве удобрения и биодобавок.

Выработка пухо-перьевых отходов от производства мяса птицы в России до 2016 г. и прогноз до 2020 г.

Тем не менее в настоящее время в Российской Федерации нет общепринятого способа утилизации отходов птицефабрик и мясоперерабатывающих предприятий. До 2000-х гг. потенциально ценное сырье зачастую сжигалось или же перерабатывалось методом гидролиза в котлах Лапса. Данная технология не только стара, энергоемка и низкопроизводительна, но еще сопровождается вредными выбросами в окружающую среду. Сегодня в большинстве своем отходы выбрасываются на близлежащие территории или вывозятся на поля. Такие свалки являются причиной возникновения различных человеческих заболеваний, включая хлороз, микоплазмоз, птичью холеру и различные дерматофитные инфекции [Williams et al. 1990]. Вместе с тем достигнут высокий уровень мировых и отечественных разработок в области создания новых технологий комплексной утилизации пухо-перьевого сырья и других малоценных отходов птицеперерабатывающей промышленности. Так, ключевыми подходами к переработке кератинсодержащих отходов являются кислотный гидролиз, щелочной, гидротермический и ферментативный гидролиз.

Основным достоинством метода кислотного гидролиза является высокая степень гидролиза. Кроме того, кислотный гидролиз имеет некоторые преимущества перед щелочным: предотвращается распад аминокислоты аргинина на орнитин и аммиак, а также

исключается дезаминирование таких аминокислот, как серин, треонин, цистин, цистеин и метионин. Однако при кислотном способе разрушаются аминокислоты триптофан и тирозин, и кроме того, некоторые из них превращаются из L-формы в D-форму, не усвояемую животными. Помимо этого, кислотный гидролиз кератинсодержащего сырья достаточно длителен, поэтому в настоящее время такой подход на практике не находит широкого применения для переработки перьевых отходов.

При щелочном гидролизе получают кератиновые гидролизаты из различных видов сырья. В качестве химических реагентов используют растворы едкого натра, едкого калия с последующей нейтрализацией полученного гидролизата соляной или ортофосфорной кислотами. К недостаткам щелочного гидролиза относят разрушение аминокислот цистеина и метионина, частичную их рацемизацию. При нейтрализации образуется до 22% поваренной соли. Соли, образующиеся при использовании ортофосфорной кислоты, придают щелочным гидролизатам горький вкус. При хранении эти соли выпадают в осадок, что затрудняет быстрое приготовление эмульсий. Ко всему вышеперечисленному к недостаткам данного способа гидролиза кератинового сырья относится длительность процесса.

Гидротермический способ является более простым и наиболее часто встречающимся способом обработки кератинового сырья, так как представляет собой термическую обработку в водной среде под давлением. После обработки кератиновый материал сушат, измельчают и просеивают. Полученные продукты используют в качестве кормовой муки. По сравнению с щелочным и кислотным гидролизом гидротермический способ имеет следующие преимущества: непродолжительность процесса, исключение необходимости использования химических веществ, аппаратов для очистки гидролизата от соли, сложного оборудования. Это обусловливает применение только продуктов водного гидролиза в качестве компонентов кормовых смесей.

Наконец, наиболее перспективным технологическим подходом является ферментативный гидролиз, использование которого позволяет проводить процесс при достаточно низких температурах и нейтральных рН. К очевидным преимуществам данного подхода относятся сокращение энергозатрат, сохранение компонентов, обладающих биологической активностью, и высокая степень извлечения потенциально доступного полноценного белка. Технология на основе ферментативного гидролиза пухо-перьевого сырья позволяет получать белковый гидролизат с высокой физиологической доступностью, естественным аминокислотным составом или с определенным (желаемым) профилем пептидов и аминокислот в L-форме.

Одним из вариантов ферментативного гидролиза является гидролиз микроорганизмами при их инкубации в среде с субстратом. Этот подход более всего близок к природным процессам, где основным агентом разложения белков различного типа являются мезофильные микроорганизмы (грибы и бактерии), вырабатывающие внеклеточные ферменты - кератиназы. Среди микроскопических грибов кератиназной активностью обладают патогенные грибы (дерматофиты), а также ряд почвенных грибов. Дерматофитные грибы, относящиеся к родам Keratinomyces, Microsporum, Trichophyton, Epidermophiton, интенсивно разлагают кератиновые материалы. Так, например, Keratinomyces ajelloi разрушает до 58,5% нативного кератина в течение 10 суток. Наибольшее распространение в почве имеют кератинразлагающие грибы Penicillium rubrum, P. lilacium и Fusarium nivale. Среди бактерий к настоящему моменту также известно немало штаммов, способных гидролизовать кератины. Впервые на это обратили внимание специалисты медицинской микробиологии. Они отмечали разрушение волос и ороговевших частиц тела человека (ногтей, покрова кожи и других) и выделяли культуры актиномицетов. Одна из таких культур названа

Actinomyces keratolyticus. Позже кератинрасщепляющие актиномицеты выделялись многими исследователями из природных субстратов (почвы, водоемы) и из тела животных. Кроме того, кератинолитики были найдены и среди мезофильных бактерий родов Streptomyces (S. rimosus, S. griseus, S. parvus и др.), Nocardia (N. rubra) Bacillus (B. subtilis и B. coagulans) и Pseudomonas (P. caviae).

Сегодня в мире активно ведутся исследования по разработке теоретических и практических основ биокаталитической переработки пухо-перьевых отходов птицефабрик с использованием мезофильных микроорганизмов или ферментов из них. Так, в работе индийских исследователей описаны результаты биодеградации отходов птицы новым бактериальным штаммом Bacillus altitudinis GVC 11, выделенным из сточных вод убойного цеха [Kumar et al. 2011]. В Германии Böckle и соавторы охарактеризовали кератинолитическую сериновую протеазу из штамма Streptomyces pactum DSM 40530 [Böckle et al. 1995]. В работе китайских исследователей представлены результаты выделения и очистки щелочной кератиназы из Bacillus sp. 503 [Zhang et al. 2010]. Тем не менее широкого внедрения в процесс переработки пухо-перьевого сырья ни один из перечисленных микроорганизмов или ферментов не получили. Связано это во многом с принципиальными трудностями, возникающими при работе с мезофильными микроорганизмами в условиях производства: сложностью технологического контроля и высоким риском контаминации нежелательной микрофлорой.

Одним из возможных решений данной проблемы может стать использование термофильных (оптимум роста - выше 50°C) протеолитических микроорганизмов. Относительно высокие температуры, необходимые для успешного роста данных микроорганизмов, позволяют исключить возможность контаминации, повысить эффективность и скорость процесса, а также получить ряд неразрушенных продуктов гидролиза (органические кислоты, спирты, водород), которые могут представлять интерес для биотехнологии. К настоящему моменту среди термофильных бактерий и архей, разлагающих кератины пера, известно менее двух десятков организмов. В 1996 г. была опубликована работа о первом среди представителей филума Thermotogae кератинолитике - Fervidobacterium pennivorans [Friedrich and Antranikian 1996], для которого оптимальная температура роста 70°С. Авторами было показано, что при инкубации перьевой муки с фракциями клеток F. pennivorans высвобождаются все присутствующие в перьях аминокислоты. Однако кератиназа осуществляет первичный гидролиз субстрата; в дальнейшем продукты ее гидролиза подвергаются действию других, внутриклеточных, пептидаз. Позднее данный фермент был подробно исследован и охарактеризован в работе Kluskens et al. [2002]. В тот же период был выделен в чистую культуру и описан второй кератинолитик из рода Fervidobacterium - F. islandicum, для которого было показано, что его эндопептидазы являются мембранно-связанными ферментами [Nam et al. 2002]. Среди представителей типа Firmicutes также известны бактерии, способные к разложению кератина. К ним относятся Thermoanaerobacter keratinophilus [Riessen and Antranikian 2001], Brevibacillus thermoruber [Bihari et al. 2010], Keratinibaculum paraultunense [Huang et al. 2013], Geobacillus stearothermophilus [Gegeckas et al. 2015], Caldicoprobacter algeriensis [Bouacem et al. 2016]. Кроме того, совсем недавно кератинолитик был обнаружен и среди представителей типа Deinococcus-Thermus - Meiothermus ruber [Kataoka et al. 2014]. Наконец, и среди термофильных актиномицетов были обнаружены и описаны представители, способные расти на кератинах: Thermoactinomyces candidus [Ignatova et al. 1999], Actinomadura keratinilytica [Habbeche et al. 2014] и др. Интересно отметить, что кератиназы, продуцируемые всеми перечисленными микроорганизмами, в отличие от кератиназ представителей рода Fervidobacterium, не связаны с клеточной стенкой и секретируются в среду.

Существенный вклад в расширение знаний о термофильных организмах, разлагающих трудногидролизуемые белки, внесли работы, проводимые в нашей лаборатории. За несколько последних лет была создана коллекция чистых культур бактерий и архей, растущих на белковых субстратах. Для некоторых из них уже был продемонстрирован эффективный рост на трудногидролизуемых белках, в том числе и на необработанных перьях. Так, для гипертермофильных (оптимум роста выше 80°С) архей родов Desulfurococcus и Thermogladius впервые была показана способность к разложению а- и ß-кератинов. Показано наличие у этих организмов высокомолекулярных, связанных с клеткой эндопептидаз, активных по отношению к негидролизованным и частично гидролизованным белкам при высоких температурах и pH [Бнджнева и соавт. 2014]. Среди бактерий была выделена термофильная анаэробная бактерия, относящаяся к роду Thermoanaerobacter и способная к росту на белковых субстратах: альбумине, желатине, казеине, альфа- и бета-кератинах. Ответственной за процесс гидролиза у нее оказалась сериновая протеиназа размером около 150 кДа, обнаруженная в супернатанте и обладающая оптимальной активностью при 60°C и рН 9.3 [Кубланов и соавт. 2009]. Кроме того, выделены кератинолитические бактерии родов Caldanaerobacter и Fervidobacterium (Кубланов, Подосокорская,

неопубликованные данные). Для ряда коллекционных штаммов, ранее описанных как целлюлолитические бактерии, также была показана способность к разложению нативных перьев (Thermosipho activus, Thermotoga caldifontis). Наконец, была выделена и настоящее время исследуется первая кератинолитическая бактерия внутри филума Bacteroidetes, представляющая новый род.

Таким образом, исследования, проводимые в разных странах, свидетельствуют об актуальности разработки новых технологий утилизации пухо-перьевых отходов птицефабрик и значимости данных разработок для развития кормовой базы животноводства и охраны окружающей среды. В целом следует отметить, что, несмотря на распространение протеолитических ферментов в природе и высокие объемы их производства в промышленности, протеолитические ферменты с кератиназным действием требуют более детального изучения. О существовании продуцентов истинных кератиназ известно мало, и вследствие этого они не нашли широкого применения в биотехнологии до сих пор. Тем не менее, в связи с перспективой биомодификации кератинсодержащего сырья, весьма важными становятся исследования, связанные с открытием новых продуцентов, разработкой эффективных методов выделения, очистки и изучения их ферментов.

Библиографический список

Биджиева С.Х., Дербикова К.С., Кубланов И.В., Бонч-Осмоловская Е.А. Способность гипертермофильных Creanarchaeota к разложению труднодоступных белков (а- и ß-кератинов) // Микробиология. 2014. Т. 83 (6). С. 743-751. URL: https://elibrary.ru/item.asp?id=22477806

Кубланов И.В., Цирульников К.Б., Калиберда Е.Н., Румш Л.Д., Эртле Т., Бонч-Осмоловская Е. А. Кератиназа из анаэробной термофильной бактерии Thermoanaerobacter sp. штамм 1004-09, выделенной из горячего источника Байкальской рифтовой зоны // Микробиология. 2009. Т. 78 (1). С. 79-88. URL: https://elibrary.ru/item .asp?id=11672432

Bihari Z., Videki D., Mihalik E., Szvetnik A., Szabo Z., Balazs M., Kesseru P., Kiss I. Degradation of native feathers by a novel keratinase-producing, thermophilic isolate,

Brevibacillus thermoruber T1E // Z Naturforsch C. 2010. V. 65. P.134-140. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20355333

Böckle B., Galunsky B., Müller R. Characterization of a keratinolytic serine proteinase from Streptomyces pactum DSM 40530 // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61. Р. 37053710. URL: http://aem.asm.org/content/61/10/3705.long

Bouacem K., Bouanane-Darenfed A., Zarai Jaouadi N., Joseph M., Hacene H., Ollivier B., Fardeau M.L., Bejar S., Jaouadi B. Novel serine keratinase from Caldicoprobacter algeriensis exhibiting outstanding hide dehairing abilities // Int J Biol Macromol. 2016. V. 86. P. 321-328. URL:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813016300757

Friedrich A.B., Antranikian G. Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 2875-2882. URL: http://aem.asm.org/content/62/8/2875.long

Gegeckas A., Gudiukaite R., Debski J., Citavicius D. Keratinous waste decomposition and peptide production by keratinase from Geobacillus stearothermophilus AD-11 // Int J Biol Macromol. 2015. V. 75. P. 158-165. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S01418130150004227via%3Dihub

Habbeche A., Saoudi B., Jaouadi B., Haberra S., Kerouaz B., Boudelaa M., Badis A., Ladjama A. Purification and biochemical characterization of a detergent-stable keratinase from a newly thermophilic actinomycete Actinomadura keratinilytica strain Cpt29 isolated from poultry compost // J Biosci Bioeng. 2014. V. 117. P. 413-421. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172313003472

Huang Y., Sun Y., Ma S., Chen L., Zhang H., Deng Y. Isolation and characterization of Keratinibaculumparaultunense gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity // FEMS Microbiol Lett. 2013. V. 345 (1) P. 56-63. URL: https://academic.oup.com/femsle/article-lookup/doi/10.1111/1574-6968.12184

Ignatova Z., Gousterova A., Spassov G., Nedkov P. Isolation and partial characterisation of extracellular keratinase from a wool degrading thermophilic actinomycete strain Thermoactinomyces candidus // Can J Microbiol. 1999. V. 45 (3). P. 217-222. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10408094

Kataoka M., Yamaoka A., Kawasaki K., Shigeri Y., Watanabe K. Extraordinary denaturant tolerance of keratinolytic protease complex assemblies produced by Meiothermus ruber H328 // Appl Microbiol Biotechnol. 2014. V. 98 (7). P. 2973-2980. URL: https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00253-013-5155-8

Kluskens L.D., Voorhorst W.G., Siezen R.J., Schwerdtfeger R.M., Antranikian G., van der Oost J., de Vos V.M. Molecular characterization of fervidolysin, a subtilisin-like serine protease from the thermophilic bacterium Fervidobacterium pennivorans // Extermophiles. 2002. V. 6(3). P. 185-194. URL: https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs007920100239 Kumar E., Srijana M., Kumar K., Harikrishna N., Reddy G. A novel serine alkaline protease from Bacillus altitudinis GVC11 and its application as a dehairing agent // Bioprocess Biosyst Eng. 2011. V. 34. Р. 403-409. URL: https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00449-010-0483-x

Lynch, D.C., Zimmerman, T.S., Ling, E.H.,Browning, P.J. An explanation for minor multimer species in endothelial cell-synthesized von willebrand factor // J Clin Invest. 1986. V. 77. P. 2048-2051. URL: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2672.2011.04949.x/abstract

Nam G.W., Lee D.W., Lee H.S., Lee N.J., Kim B.C., Choe E.A., Hwang J.K., Suhartono M.T., Pyun Y.R Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe // Arch Microbiol. 2002. V. 178 (6). P. 538-547. URL: https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00203-002-0489-0

Riessen S., Antranikian G. Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity // Extremophiles. 2001. V. 5 (6). P. 399-408. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11778841

Vroman I., Tighzert L. Biodegradable Polymers // Materials. 2009. V. 2 (2). P. 307344. URL: http://www.mdpi.com/1996-1944/2/2/307

Williams C.M., Richter C.S., Mackenzie J.M., Shih J.C.H. Isolation, identification, and characterization of a feather-degrading bacterium // Appl and Environm Microbiol. 1990. V. 56. P. 1509-1515. URL: http://aem.asm.org/content/56/6/1509.long

Zhang, J., Wang J., Fang C., Song F., Xin Y., Qu L., Ding K. Bacillus oceanisediminis sp. nov., isolated from marine sediment // Int J Syst Evol Microbiol. 2010. V. 60. P. 29242929. URL: http://ijs.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijs.0.019851-0#tab2