CC BY
78
Кариотипическая изменчивость и цитогенетический скрининг коз оренбургской пуховой породы
А.И. Жигачев, д.б.н., профессор, Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины, А.Н. Екимов, к.с.-х.н, Оренбургский ГАУ
В настоящее время в связи с интенсивным использованием современных методов идентификации и кариотипирования хромосом в цитогенетическом анализе широко дискутируется вопрос о структурно-функциональном разнообразии индивидуальных кариотипов и о границах кариотипической нормы для отдельных видов животных. По мнению ряда исследователей (А.Ф. Яковлев, 1985; А.В. Бакай, Ю.А. Перчи-хин, Л.С. Семенов, 1986; Л.К. Эрнст, А.И. Жигачев, 1990), понятие «нормальный кариотип» применимо при скрининге таких хромосомных аномалий, как гетероплоидия, транслокации, де-леции и инверсии. Обнаружение большого числа структурных вариантов у отдельных особей свидетельствует о том, что представления о ка-риотипической норме должны быть расширены.
Случаи конституциональной кариотипичес-кой изменчивости у животных выявляются довольно редко. Многие хромосомные аномалии, как правило, имеют низкую повторяемость и различны у одного и того же животного, что не дает оснований говорить об общем их генезисе. Такая кариотипическая изменчивость называется неконституциональной. Резонность ее изучения сводится к решению не только теоретических, но и прикладных проблем. Во-первых, возможен контроль спонтанного мутагенеза, кото -рому подвергаются сами исследуемые животные. Это дает возможность выявлять и освобождаться от носителей генетического груза. Во-вторых, существует определенное соответствие хода мутационного процесса в генеративной ткани и в тканях, доступных для прижизненного цитологического анализа (клетки системы крови), что позволяет проводить мониторинг ге-
нетической полноценности племенных ресурсов.
До настоящего времени подобного рода исследования на козах оренбургской пуховой породы не проводились. В связи с этим в нашу задачу входило изучить изменчивость кариотипи-ческой нестабильности у коз оренбургской пуховой породы в возрастном и половом аспектах.
Исследования проводили на поголовье коз стада ФГУ КПР «Губерлинский» Гайского района Оренбургской области в 2002-2004 гг. Материалом для цитогенетического анализа служили клетки культуры лейкоцитов периферической крови. Препараты метафазных хромосом готовили по методу P. Moorhead et.al. (1960). Анализ и учет числа хромосомных аномалий проводили согласно методическим указаниям А.Ф. Яковлева (1981), А.В. Бакая, Ю.Ф. Перчихина, А.С. Семенова (1986).
Следует отметить, что популяционно-генетической особенностью оренбургской пуховой породы коз является локальность ее ареала, замкнутость и ограниченность генофонда, относительно малая доля эффективно-репродуктивного объема в общем массиве. Именно в таких популяциях в процессе эволюции, как правило, возникают и распространяются сбалансированные хромосомные мутации, существенно не влияющие на приспособляемость и фенотипы особей. В наших исследованиях ни у одного из обследованных животных не было выявлено каких-либо конституциональных аномалий хромосомного набора. В то же время изучение неконституциональной кариотипической изменчивости в зависимости от возраста и пола показало, что наряду с нормальными диплоидными клетками некоторая часть в культуре лейкоцитов крови коз имеет гетероплоидный набор и структурные аберрации (табл. 1, 2).
Суммарный средний уровень гетероплоидии в клетках крови коз составлял 6,97%. В структу-
1. Показатели гетероплоидии коз
Возраст, лет Пол Изучено метафаз Дипло- идных клеток Гетеро- плоид- ных клеток Из них
поли- плоиды анеуплоиды
всего из них истинные ги-попло-иды генети- ческая анеупло- идия физиоло- гическая гипопло- идия
гипо- плоиды гипер- плоиды
Козел 1605 1468 137 17 120 104 16 16 32 88
При 100 91,4 8,54 1,06 7,48 6,48 1,00 1,00 1,99 5,48
рождении Коза 421 388 33 5 28 25 3 3 6 22
100 92,16 7,84 1,13 6,65 5,94 0,71 0,71 1,43 5,23
Всего 2026 1856 170 22 148 129 19 19 38 110
100 91,61 8,39 1,09 7,31 6,37 0,94 0,94 1,88 5,43
Козел 1724 1616 108 36 72 60 12 12 24 48
100 93,74 6,26 2,09 4,18 3,48 0,70 0,70 1,39 2,78
1 Коза 546 521 25 8 17 13 4 4 8 9
100 95,42 4,58 1,46 3,11 2,38 0,73 0,73 1,47 1,65
Всего 2270 2137 133 44 89 73 16 16 32 57
100 94,14 5,86 1,94 3,92 3,22 0,70 0,70 1,41 2,51
Козел 1336 1267 69 40 29 24 5 5 10 19
100 94,84 5,16 2,99 2,17 1,80 0,37 0,37 0,75 1,42
5 Коза 418 403 15 7 8 7 1 1 2 6
100 96,41 3,59 1,67 1,91 1,67 0,24 0,24 0,48 1,44
Всего 1754 1670 84 47 37 31 6 6 12 25
100 95,21 4,79 2,68 2,11 1,77 0,34 0,34 0,68 1.43
Козел 691 603 88 30 58 51 7 7 14 44
100 87,26 12,74 4,34 8,39 7,38 1,01 1,01 2,03 6,37
7 Коза 300 284 16 7 9 8 1 1 2 7
100 94,67 5,33 2,33 2,99 2,66 0,33 0,33 0,66 2,33
Всего 991 887 104 37 67 59 8 8 16 51
100 89,51 10,49 3,73 6,76 5,95 0,81 0,81 1,61 5,15
Козел 5356 4954 402 123 279 239 40 40 80 199
100 92,49 7,51 2,3 5,21 4,46 0,75 0,75 1,49 3,72
Итого Коза 1685 1596 89 27 62 53 9 9 18 44
100 94,72 5,28 1,60 3,68 3,15 0,53 0,53 1,07 2,61
Всего 7041 6550 491 150 341 292 49 49 98 243
100 93,03 6,97 2,13 4,85 4,15 0,70 0,70 1,39 3,45
ре гетероплоидии основную часть - 69,5% - занимала анеуплоидия и 30,5% - полиплоидия. В возрастном аспекте частота встречаемости учтенных показателей, независимо от половой принадлежности животных, имеет характерную изменчивость. Анализ частоты спонтанной анеуп-лоидии показывает, что величина ее у коз разных возрастов неодинакова. Из всех возрастных групп наименьший уровень анеуплоидных клеток (2,11%) наблюдался в крови 5-летних животных. Относительно высокое содержание анеуплоидных клеток обнаружено у новорожденных козлят (7,31%) и 7-летних коз (7,76%). Анализ количества анеуплоидных клеток у животных разного пола указанных групп показывает, что частота их у новорожденных козлят обоего пола приблизительно одинакова (мужская 7,48%, женская - 6,65%). В крови годовалых животных наблюдается незначительное, статистически недостоверное увеличение анеуплоидии у козликов по сравнению с козочками (мужская - 4,12%, женская - 3,11%). Значительное увеличение анеуплоидии у козлов наблюдается в более старшие возрастные периоды. Так, в 5-летнем возрасте число анеуплоидных клеток в крови козлов достигло 2,17%, а у коз этот показатель равнялся 1,91%. В семилетнем
возрасте анеуплоидия соответственно составила 8,39% у козлов и 3,0% у коз, что, видимо, обусловлено более жесткой браковкой маточного поголовья по воспроизводительной функции.
Повышенный уровень анеуплоидии у новорожденного молодняка, по мнению ряда авторов (A.M. Мурзамадиев, Р. Жапбасов, 1979; P.M. Абдурагимова, 1989 и др.), связан с тем, что в период новорожденности идет интенсивный рост и развитие животных, более того, они попадают в новые условия среды, поэтому клетки очень восприимчивы к влиянию внешних факторов. А к 5-летнему возрасту, периоду зрелости и функционального расцвета животного, клетки оказываются наиболее стабильными в отношении цитогенетических нарушений.
У коз оренбургской пуховой породы анеуплоидия формировалась преимущественно за счет гипоплоидных клеток (87,5%) при незначительной доле гиперплоидных клеток (12,5%). Считается, что основным источником гиперпло-идии является нерасхождение хромосом в митозе, гиполплоидию наряду с нерасхождением хромосом может вызвать и отставание хромосом в анафазе и элиминация аберрантных хромосом.
2. Показатели аберраций хромосом коз
Возраст, лет Пол Под- робно просмот- рено метафаз Аберрации хромосом Всего абер- раций
фрагменты хрома- тидные обрывы деле- нии инвер- сии пробелы дубли- кации трансло- кации
одиноч- ные парные
Козел 119 1 1 1 0 0 0 0 0 3
При 100 0,85 0,85 0,85 0 0 0 0 0 2,55
рождении Коза 126 1 0 1 0 0 0 0 0 2
100 0,79 0 0,79 0 0 0 0 0 1.5Х
Всего 244 2 1 2 0 0 0 0 0 5
100 0,82 0,40 0,82 0 0 0 0 0 2,04
Козел 108 1 0 0 1 0 1 0 0 3
100 0,93 0 0 0,93 0 0,93 0 0 2,79
1 Коза 106 1 0 0 0 0 1 0 0 2
100 0,04 0 0 0 0 0,94 0 0 1,88
Всего 214 7 0 0 1 0 2 0 0 5
100 0,94 0 0 0,47 0 0,94 0 0 2,35
Козел 124 2 1 1 0 0 1 0 0 5
100 1,61 0,81 0,81 0 0 0,81 0 0 4,14
5 Коза 118 0 1 0 0 0 0 0 0 1
100 0 0,85 0 0 1) 0 0 0 0,85
Всего 242 2 2 1 0 0 1 0 0 6
100 О.ХЗ 0,83 0,41 0 0 0,41 0 0 2,48
Козел 116 2 2 1 0 0 1 0 0 6
100 1,72 1,72 0,86 0 0 0,86 0 0 5,16
7 Коза 108 1 0 0 0 0 0 0 0 1
100 0,93 0 0 0 0 0 0 0 0,93
Всего 224 3 2 1 0 0 1 0 0 7
100 1,34 0,89 0,45 0 0 0,45 0 0 3,13
Козел 466 6 4 3 1 0 3 0 0 17
100 1,29 0,96 0,64 0,21 0 0,64 0 0 3,74
Итого Коза 458 3 1 1 0 0 1 0 0 6
100 0,66 0,22 0,22 0 0 0,22 0 0 1,32
Всего 924 9 5 4 1 0 4 0 0 23
100 0,97 0,55 0,43 0,11 0 0,43 0 0 2,49
Ряд арторов полагает, что уменьшение числа хромосом в части клеток происходит в основном в результате их утраты в процессе обработки препаратов. В то же время наличие индивидуальных особенностей животных по этому показателю, зависимость от гормональных воздействий (Т.Н. Бужевская, Т.В. Выгодская, 1990) и связь с продуктивными признаками (В.И. Евсиков, 1970, П.М. Кленовицкий, 1982; А.В. Бакай, 1995 и др.) свидетельствуют о неслучайном характере этого феномена. Из приведенных данных можно видеть, что клетки с уменьшенным числом хромосом встречаются чаще, чем клетки с другими аномалиями. Если клетки с аберрациями, полиплоидные и гиперплоидные являются редкими событиями с очень высокой индивидуальной вариабельностью, то гипоплоидные клетки обнаруживаются у каждого животного с умеренной индивидуальной вариабельностью частоты.
Теоретически, при нерасхождении гомологичных хромосом должно образовываться столько же гипоплоидов, сколько и гиперплоидов. Значительное превышение частоты гипоплоидных клеток над частотой гиперплоидных обычно считают техническим артефактом, связанным с пониженной осморезистентностью клеточных мембран. По мнению А.В. Бакая, Ю .А. Перчихина,
А.С. Семенова (1986), это явление, связанное с клеточной физиологией и обнаруживаемое в результате гипотонической обработки клеток, обусловлено не только нерасхождением хромосом в митозе. Данный феномен, названный ими как «физиологическая гипоплоидия», можно выделить в чистоте при вычитании гиперплоидных клеток из доли гипоплоидных. Вычтенная часть клеток характеризует гипоплоидные клетки, которые утратили хромосомы при нерасхождении гомологов, то есть истинно гипоплоидные. Тогда сумма частот гиперплоидных клеток, численно равная удвоенной частоте гиперплоидных клеток, характеризует анеуплоидию, возникшую за счет нерасхождения гомологов. А.В. Бакай, Ю.А. Перчихин, А.С. Семенов (1986) назвали ее «генетической анеуплоидией». Таким образом, общеупотребляемый признак «анеуплоидия» дифференцируется в зависимости от происхождения входящих в него клеток на физиологическую гипоплоидию и генетическую анеуплоидию. Это обстоятельство имеет не только теоретическое, но и большое прикладное значение, так как относительно невысокая доля гиперплоидных клеток обуславливает то, что возрастная динамика суммарного показателя анеуплоидии в целом повторяет динамику гипоплоидии. Как показали наши
исследования, структура гипоплоидии в онтогенезе коз оренбургской пуховой породы меняется. У козлят при рождении анеуплоидия на 25,7% обусловлена нерасхождением хромосом в митозе (генетическими факторами) и на 74,3% - низкой осморезистентностью клеток. Следует отметить, что в этом возрасте наблюдается самая высокая физиологическая гипоплоидия (5,48%), маркирующая в какой-то мере об относительно низкой общей резистентности козлят. По данным В.М. Мешкова и др. (1990), новорожденные козлята имеют потенциал гуморальной и клеточной неспецифической защиты соответственно в 1,95 и 3,16 раза меньше, чем половозрелые особи. В годовалом возрасте структура генетического и негенетического компонента анеуплоидии соответственно 32,2 и 67,8%. В возрасте 7 лет доля негенетических факторов в структуре анеуплоидии у коз возросла до 78%. В целом же стабильно низкие показатели анеуплоидии (4,84%), обнаруженные нами у коз оренбургской пуховой породы, относительно других видов животных, позволяют считать их характерными породными особенностями.
Следует отметить, что в периферической крови коз среди лейкоцитов с ортоплоидном числом наборов хромосом суммарно 1,85% клеток имели измененные полиплоидные наборы. Как генетический феномен, полиплоидия состоит в кратном увеличении диплоидного числа хромосом в ядрах клеток. Среди домашних животных полиплоиды практически неизвестны, вместе с тем полиплоидные клетки у них являются нормальной составной частью различных соматических тканей. По данным Л.К. Эрнста, А.И. Жигачева (1990), количество полиплоидных клеток может меняться в зависимости от физиологического состояния животного и его здоровья.
Наши исследования (табл. 1) показали, что полиплоидия клеток системы крови коз оренбург-ской пуховой породы носит закономерный характер. Доля полиплоидных клеток с возрастом увеличивается, однако суммарные различия между отдельными возрастными периодами не всегда достоверны. Максимальный суммарный уровень доли полиплоидных клеток (2,72%) наблюдается у 7летних животных, что достоверно превышает уровень полиплоидии (1,09%) у новорожденных козлят. В годовалом возрасте и в возрасте 5 лет данный показатель соответственно составил 1,97 и 2,11%. Следует отметить, что во все возрастные периоды, за исключением периода новорожденно-сти, доля полиплоидных клеток в крови козликов хотя и была несколько выше, чем у козочек, но разница несущественна и статистически не достоверна. Полиплоидные лейкоциты в основном были представлены тетраплоидными клетками и лишь в одном случае нами был зафиксирован гек-саплоид. Материалы исследований показывают определенную устойчивость полиплоидии. Несом-
ненно, что этот факт можно признать в качестве кариологической нормы, характеризующей данный вид животных.
Помимо вышеперечисленных спонтанных хромосомных нарушений нередко в кариотипе животных обнаруживаются такие аномалии, как хрома-тидные и изохроматидные пробелы, разрывы де-леции и обнаруживающиеся в результате этого различные фрагменты генетического материала. Исследования ряда авторов (А.В. Бакай, 1978; В.Ф. Красота и др., 1982; Н.Г. Дмитриев, А.И. Жига-чев, 1984; А. И. Жигачев, 1985;
Л.К. Эрнст, А.И. Жигачев, 1990 и др.) показали, что пока еще не найден тот уровень наличия спонтанных структурных аномалий хромосом, который можно было бы считать генетической нормой.
Структурные аберрации хромосом в крови коз оренбургской пуховой породы наблюдались относительно редко. Из 924 подробно просмотренных метафаз только 23 (2,49%) характеризовались изменением морфологической структуры хромосом. Спонтанная структурная изменчивость хромосом была обусловлена в основном аберрациями хро-матидного типа. Суммарно из всех аберраций 39,13% приходилось на одиночные и 21,74% на парные фрагменты хромосом, по 17,39% составляли хроматидные обрывы и пробелы, 4,35% в общей структуре аномалий занимали делеции.
Следует отметить, что в кариотипах коз оренбургской пуховой породы мы не обнаружили конституциональных перестроек хромосом, в том числе и транслокаций робертсоновского типа. В основном аберрации хромосом носили неконституциональный характер. Во все возрастные периоды доля хромосомных нарушений в клетках крови козликов была выше аналогичного показателя козочек. Причем наблюдается противоположная тенденция возрастной динамики хромосомных аберраций в зависимости от половой принадлежности коз. Так, суммарная доля хромосомных аберраций в лейкоцитах крови с возрастом козликов возросла с 2,55% при рождении до 2,79% в годовалом, 4,14% - в пятилетнем и 5,16% - в семилетнем возрасте, тогда как морфологические нарушения хромосом лейкоцитов крови козочек в соответствующие периоды составляли: 1,58%, 1,88, 0,85 и 0,93%. На существование у животных возрастной и морфофункциональной изменчивости хромосом кумулятивного мутагенеза указывают в своих исследованиях и Л.К. Эрнст, А.И. Жига-чев (1990).
Установленные нами уровни хромосомной нестабильности у коз оренбургской пуховой породы, не имеющих фенотипических отклонений, позволяют предположить о существовании ка-риотипи-ческой нормы реакции организма в ходе онтогенеза, адекватной воздействию факторов внешней среды и эволюционно закрепленной филогенезом.
