CC BY
57
УДК 616.12-005.4+616.379-008.65)-02:611-018.5-068]-076.5
КИЯКЮ.Г., КОГУТМ.А., АНДРУШЕВСЬКА О.Ю., КОГУТЛ.М., КИЯКГ.Ю., БАРНЕТТ О.Ю. Льв'вський нацональний медичний унверситетiменiДанила Галицького, м. Льв'в, Украна
КАЛЬЦИФкАШЯ Й АПОПТОЗ КЛПИН KPOBi ЯК МАРКЕР НАЯВНОСП, ТЯЖКОСТ i ПРОГРЕСУВАННЯ ^EMi4HOI ХВОРОБИ СЕРЦЯ У ПОеДНАНЫ З ЦУКРОВИМ ДiАБЕТОМ 2-го ТИПУ: УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ТА ЦИТОЛОПЧЫ ДОСЛiДЖЕННЯ
Резюме. Актуальнсть. Збпьшення внутрiшньокпiтинного вм>сту Са2+ призводить до запуску про-
цеав апоптозу/ капьцифiкацiíкп^ин кров\ та серцево-судинноIсистеми. Тсний зв'язокм'жапоптозом кптин кров\ та 1х капьцифiкацieю дае пдстави вважати капь^й важпивим маркером та iнiцiатором ць-ого процесу. Мета роботи — доспдити упьтраструктурн змiни та стан кп^инного \мунтету у па^енлв
з гострим коронарним синдромом (ГКС) \ цукровим дiабетом (ЦД) 2-го типу i виявити асо^а^ю м'ж
збiпьшенням внутрiшньоклiтинного капь^ю в еритроцитах та капьцифiкацiею вiнцевих артерiй. Ма-терiали та методи. Обстежен 20 па^енлв \з ГКС у поеднаннi з ЦД 2-го типу. Контропьну групу стано-
випи 10 оаб. Середн^й вiк па^енлв — 65,0 ± 5,6 року. Бупо проведено: мупьтиспiрапьну комп'ютерну томографiю; цитопопчне визначення сопей капь^ю в еритроцитах за методом Мак-П-Рассепа; \муно -
погiчнi доспiдження апоптозу пейкоцит'1в за допомогою набору Лро1.ео1, епектронну микроскопию дпя
виявпення упьтраструктурних ознак апоптозу кп^ин кров '1. Результати. У па^енлв з високим i дуже
високим iндексом капьцифiкацií вiнцевих артерiй цитопопчно спостер^гаеться наявнсть в еритроцитах грануп капь^ю рiзноí вепичини / форми, ф'юпетово-синього забарвпення, ан'1зо- та пойюпоцитоз
еритроцит'1в; 'шунопопчно — збiпьшення юпькост апоптотично змiнених \ поява некротично змiнених кптин кровi; характернi також класичнi упьтраструктурн ознаки апоптозу пейкоцит'1в. Висновки. На-
явнсть ГКС у па^енлв iз ЦД 2-го типу супроводжуеться активац^ею процеав апоптозу пейкоцит'1в, накопиченням юн'1в капь^ю в еритроцитах, що асо^юеться з високим i дуже високим индексом капь-цифiкацií вiнцевих артерiй. Виявпення таких зм<н при досп '1дженн'1 периферично1 кров/ па^енлв дае можпив'1сть вчасно запщозрити загрозу виникнення iшемiчноí хвороби серця й запоб'1гти розвитку
II тяжких ускпаднень.
Ключовi слова: апоптоз, капьцифiкацiя, гострий коронарний синдром, цукровий д1абет2-го типу, кпти-ни кровi.
о £ ® Оригинальные исследования
/Original Researches/
International journal of endocrinology
Вступ
Апоптоз — це природний процес генетично запро-грамовано! смерт клгган, на штенсивнють якого в ор-ганiзмi може впливати низка зовшшшх i внутршшх чинниюв. Зпдно iз сучасними уявленнями, кшьюсть кштин, яы шдлягають запрограмованш загибел^ за-лежить вщ сшввщношення активаторiв та iнгiбiторiв апоптозу, тому апоптоз можна вважати шдикатором дисбалансу в органiзмi про- та антиапоптотичних фак-торiв, що впливають на та чи iншi кштини людського оргашзму [1]. Порушення регуляци програмовано! смерт клгган призводить до виникнення рiзних захво-рювань, пов'язаних iз посиленням або, навпаки, шп-буванням апоптозу (вроджеш чи набул iмунодефiцит-ш стани, автоiмуннi захворювання, онкопатолопя). I, навпаки, багато захворювань, особливо життево не-
безпечних, гострих або хрошчних екзо- та ендогенних iнтоксикацiй i так 3BaHi хвороби цивiлiзацii призводять до активацй' апоптозу. На особливу увагу заслуговують iшемiчна хвороба серця (1ХС), артерiальна гiпертензiя, гiперхолестеринемiя, цукровий дiабет (ЦД), пподина-мiя, ожиршня, тютюнопалiння та обтяжений спадко-вий анамнез, що викликають прискорене прогресуван-ня атеросклерозу через активацiю в органiзмi рiзних механiзмiв апоптозу [2].
Адреса для листування з авторами: Когут М.А
E-mail: mariannakohut@gmail.com
© Кияк Ю.Г., Когут М.А., Андрушевська О.Ю., Когут Л.М.,
Кияк Г.Ю., Барнетт О.Ю., 2016 © «М1жнародний ендокринолопчний журнал», 2016 © Заславський О.Ю., 2016
На сьогодш доведена важливють юшв кальцiю у naToreHe3i серцево-судинних захворювань, а також фонових сташв, що сприяють прогресуванню 1ХС i ri-пертошчно! хвороби, попршуючи ix перебiг та прогноз [8, 13]. Феномен кальцифшаци артерш, що незмш-но супроводжуе прогресування атеросклерозу та ви-являеться рiзними вiзуaлiзуючими i морфологiчними методами [10], е шдтвердженням вaжливостi розлaдiв метaболiзму кальцш в людському оргaнiзмi [7]. По-ряд i3 тим юнують переконливi дaнi про безпосеред-шй вплив iонiв кaльцiю на рiзнi ланки апоптозу кль тин серцево-судинно! системи. Зокрема, доведено, що на штенсивнють процесiв апоптозу клiтин впливае безлiч ендогених фiзiологiчниx фaкторiв, а саме: оксид азоту, активш форми кисню, концентрaцiя iонiв (Ca2+ та Mg2+) i aденiновиx нуклеотидiв (АДФ, АТФ), а також лшщи, певнi бiлковi фракци, змiни в склaдi Bcl-2-комплексу [17].
Пдвищення концентраций iонiв кaльцiю в цитозолi клiтин може бути нaслiдком як посилення його про-никнення з мiжклiтинного простору через плазматичну мембрану, так i порушення його внутршньоклгтинного гомеостазу, що залежить вiд функци мiтоxондрiй та ен-доплазматичного ретикулуму. Збтьшення внутрш-ньоклiтинного вмiсту Са2+ призводить до формування комплексу «циклофшн D — ANT», що шдукуе вщ-криття пор i запуск процешв апоптозу. Тiсний зв'язок мiж iонaми кaльцiю та процесами апоптозу клгтин дае пiдстaви вважати його важливим маркером та шщато-ром цього процесу [1].
Хрошчний метaболiчний стрес внaслiдок гшергль кеми [15], спричинено! дефiцитом iнсулiну (ЦД 1-го типу) або зниженням толерантносп тканин до шсуль ну (ЦД 2-го типу), теж негативно впливае на клгтин-ний гомеостаз практично вшх титв клiтин [4]. Вну-тршньоклгтинш органели, тaкi як ендоплазматичний ретикулум та мгтохондри, разом iз цитоплазматичною мембраною вiдiгрaють ключову роль у забезпеченш кальщево! сигнaлiзaцii. Надлишкова акумулящя Са2+ мiтоxондрiями при ЦД суттево порушуе синтез АТФ i здатна ютотно змiнювaти спiввiдношення АТФ/АДФ. Вiдомi дaнi, що при ЦД збтьшуеться проникнiсть мь тоxондрiaльниx пор iз подальшим швидким i масивним викидом Са2+ у цитозоль. Це призводить до порушення багатьох клгтинних функцш i сприяе апоптозу [1, 18]. Зниження продукци АТФ, що виникае при цьому, ще бтьше порушуе меxaнiзми кaльцiевого гомеостазу через ослаблення Са2+-помпи i пiдвищення проник-ностi плазматично! мембрани [16].
Дослщження клiтин периферично! кровi щодо ви-явлення ознак ix апоптозу [11, 12] у хворих iз рiзними факторами ризику 1ХС становить особливий науковий i практичний iнтерес, осктьки вони повною мiрою можуть вщображати iнтенсивнiсть запрограмовано! смертi клiтин у людському оргaнiзмi й е доступними щодо забору матер1алу для дослщження та дозволяють провести комплексний порiвняльний aнaлiз iз засто-суванням iмунологiчниx, морфологiчниx i бiоxiмiчниx методик.
Мета дослщження — з'ясувати вплив рiзниx фак-торiв ризику 1ХС на ультраструктурш змiни й апоп-тоз лейкоцитав i стан клiтинного iмунiтету у пaцiентiв iз гострим коронарним синдромом (ГКС), а також ви-явити асощацш мiж збiльшенням внутршньоклгтин-ного к^ьцiю в еритроцитах i кaльцифiкaцiею вiнцевиx aртерiй для полшшення дiaгностики та корекц11 бiоxi-мiчниx змiн у кровi, що спричинюють розвиток 1ХС.
Матерiали та методи
Обстежеш 20 пaцiентiв iз ГКС, яю перебув^и на стaцiонaрному л^ванш в кaрдiологiчному вiддi-леннi лшарш швидко'1 медично'1 допомоги м. Львова (база кафедри шмейно! медицини ФПДО ЛНМУ iменi Данила Галицького), серед яких було 8 ошб iз ЦД 2-го типу рiзного ступеня тяжкосп, 12 — з ожиршням I— III ст. i два пащенти — з професiйними шыдливостями. Контрольну групу становили 10 практично здорових ошб. Середнш вiк пащенпв — 65,0 ± 5,6 року. Обидвi групи порiвняннi за вшовими та гендерними характеристиками.
Пaцiентaм з IXC проводили мультиспiр^ь-ну комп'ютерну томографш (МСКТ) на томогрaфi Somatom Volum Zoom (Siemens, Нiмеччинa) за методом A. Agatston iз використанням програми Calciumscoring. Кiлькiсний aнaлiз кальцш здiйснювaли за алгоритмом, запропонованим A. Agatston та ствавт. Кшьысть кaльцiю розраховували для окремих сегментав вiнцевиx aртерiй з пiдрaxунком загального кaльцiевого iндексу
[3, 9].
Цитолопчне визначення солей кaльцiю в еритроцитах проводили в нативних мазках периферично! кровi за допомогою спиртового розчину ал1зарину червоно-го S за методом Мак-П-Рассела [6]. Також визначали рiвень заг^ьного та юшзованого к^ьцiю в плaзмi, рН кровi за апаратним методом (Electrolytes Analyzer E-lyte 5, ELT-1000).
Iмунологiчне дослщження апоптозу лейкоцитiв (нейтрофiльниx грaнулоцитiв, моноципв, лiмфоцитiв) проводилося за допомогою набору ApoLect для ви-явлення апоптотичних i некротично змiнениx клiтин у зразках цтьно! кровi (лaборaторiя кафедри iмунологii ЛНМУ iменi Данила Галицького). Нaбiр ApoLect мiс-тить мaнозоспецифiчний лектин iз нарциса Narcissus poeticus, що розпiзнaе олiгомaнозильнi глiкaни ендо-плазматичного ретикулуму, як1 експонуються на по-верxнi клiтин при aпоптозi i дають можливiсть вияв-ляти апоптотичш клiтини, а також барвник пропщй йодид (PI), що накопичуеться у клгтинах iз порушеною цшсшстю плазматично! мембрани (тобто некротич-них) i, зв'язуючись з ДНК, продукуе сильний флуо-ресцентний сигн^. Принцип роботи набору ApoLect базуеться на виявленш специфiчниx глiкaнiв, тому вш придатний для визначення ядровмiсниx вщмираючих клiтин у цiльнiй кровi (тсля проведення лiзису еритро-цитiв), що значно посилюе чутливiсть детекцГ! та тд-вищуе точнiсть aн^iзу результапв. Виявлення апоптотичних i некротичних клгтин базуеться на детекци флуоресценци та може здiйснювaтись за допомогою
флуоресцентного мшроскопа чи проточного цитоме-тра, що дозволяе дискримшувати стандартнi флуорес-центнi мГтки FITC та PI.
Ультраструктурш ознаки апоптозу лейкоцитiв ви-вчали також за допомогою електронно! мшроско-пи у зразках кровГ цих же пaцiентiв. Для цього натще з лштьово! вени брали 9 мл кровi у силшогешзовану пробГрку. Кров змiшувaли у пробiрцi з 1% розчином цитрату натрш у спiввiдношеннi 9 : 1 i центрифугува-ли при 150 G протягом 10 хвилин до утворення осаду еритроцилв. Надосадову частину кровi переносили у чисту пробiрку i центрифугували ще 10 хвилин. Отри-маний осад бГлих клгтин кровГ у формГ плГвки промива-ли какодилатним буфером i переносили !! у 2% розчи-ш осмiю на 120 хв для фшсаци в холодильники. Шсля фiксaцii клiтини промивали в какодилатному буферi, а потiм зневоднювали у спиртових розчинах зростаючо! концентраци (30, 50, 70, 90 %), а також у 100% ацетош по 10 хв. Дaлi щ зразки кровi в формГ плГвки занурю-вали в сумiш епону та аральдиту, полiмеризувaли в же-латинових капсулах за температури 60 °С. Ультратоню зрiзи готували на ультрaмiкротомi УМТП-3 за допомогою скляних нож^в. Перед дослiдженням зрiзи клгтин кровГ контрастували в цитрaтi свинцю за методом E. Reynolds. Отримаш контрастоваш зрiзи дослщжували за допомогою електронного мiкроскопa УЕМВ-100-К i фотографували при збiльшеннi вГд 3000 до 12 000 рaзiв.
Для аналГзу та порГвняння отриманих результапв користувалися методами медично! статистики та про-грамним забезпеченням Statistica 6.0.
Результати
При проведеннi Гмунолопчних дослГджень було ви-явлено вiрогiдне збГльшення юлькоси апоптотично змiнениx ядерних клгтин кровГ, переважно моноципв, лГмфоцитав i появу некротично змiнениx клгтин кровГ у пaцiентiв Гз ГКС i супутшм ЦД, а також за наявнос-т професшно-зумовлених шюдливостей i шкГдливих звичок (тютюнопалшня).
Класичш ультраструктурш ознаки апоптозу лейко-цитав проявлялися !х надмГрною осмюфшею, конден-сащею ядерного гетерохроматину, ткнозом i карюрек-сисом ядер, появою мшромГхурщв у цитоплазмГ клГтин кровГ, вакуолГзащею ендоплазматично! сГтки та комплексу Гольдш, а також наявшстю дрГбних, округло! форми мгтохондрш. Апоптоз лейкоципв позитивно корелював Гз тяжыстю вказаних факторГв ризику IXC, а також з вшэм пащенпв (рис. 1, 2).
При свГтловш мГкроскопй мазыв периферично! кровГ у пащента з дуже високим шдексом кальцифша-цГ! вшцевих артерш (рис. 3) цитолопчно спостерГгаеть-ся поява в еритроцитах гранул кальцш рГзно! величини i форми, фюлетово-синього забарвлення, а також змша !х форми i величини. В окремих полях зору при цитоло-пчному дослГдженнГ препаратГв кровГ пащентав з ГКС i тяжким або середньо! тяжкостГ ЦД спостерГгалося понад 90 % еритроцилв з депозитами солей кальцш (рис. 4), а в ошб Гз легким перебГгом — до 50 % (рис. 5).
Наявшсть ЦД 2-го типу середнього або тяжкого ступеня, професшних шкГдливостей, ожирГння i тютюнопалшня значно збГльшували ступГнь кальцифшаци як вшцевих судин, так i еритроцилв, а також лейкоци-тГв. У здорових ошб без факторГв ризику IXC депозитГв кальцш в еритроцитах не спостерГгалося.
При бюммГчному дослГдженнГ кровГ (електролГти плазми) спостерГгалося зменшення рГвня юшзовано-го кальцГю в сироватщ кровГ при змГщення рН у кислу сторону.
Обговорення
На сьогодш доведена важлива роль мГтохондрГй для багатьох, якщо не для вшх видГв апоптозу [10]. У першу чергу це пов'язано з раптовою змшою проникностГ зо-вшшньо! мембрани мГтохондрГй, яка запускае мехашз-ми загибелГ клГтини. ЗгГдно з шею гГпотезою, першо-причинну роль у кштиннш загибелГ шляхом апоптозу i некрозу вГдГграе змГна мГтохондрГально! проникностГ (mitochondrial permeability transition — МРТ), тобто раптове Са2+-залежне зростання проникностГ внутрш-ньо! мГтохондрГально! мембрани для розчишв Гз моле-кулярною масою менше 1,5 кДа [18]. Це явище вперше було вГдкрито Д. Хантером зГ спГвавт. (1976) [8]. Йому притаманна ключова роль в штеграци та поширеннГ сигнал Гв загибелГ, що виникають в середиш клГтини (унаслГдок руйнування ДНК, оксидативного стресу, голодування чи п!д впливом хГмютерапевтичних лГкГв) або надходять вГд рецепторГв загибелГ. ОскГльки змГна мГтохондрГально! проникностГ вГдбуваеться як при апоптозГ, так i при некрозГ, юнують фактори, що ви-значають шлях загибелГ клГтини. Одним Гз цих чин-ниыв е рГвень АТФ у клГтиш, причому виршальним може бути навГть не абсолютний вмют АТФ, а вну-трГшньоклГтинне вГдношення АТФ/АДФ. Апоптоз вГдбуваеться за наявност певно! юлькосп АТФ, а за и вГд-сутностГ виникае некротична загибель клГтини. У мГру прогресування апоптозу АТФ може вичерпатися, тодГ виникають ознаки вторинного некрозу апоптотично змшених клГтин. Отже, ГдентифГкашя апоптозу i некрозу в таких випадках стае утрудненою [18].
Останне десятирГччя ознаменувалося кардинальною трансформащею уявлень про нейтрофГльнГ грану-лоцити [19]. Якщо спочатку нейтрофГли розглядались винятково як клГтини-мГкрофаги, а також «авангард лейкоципв», що першими вступають у боротьбу Гз збудником у вогнищГ запалення (короткоживучГ, не-специфГчнГ, здатнГ тГльки до фагоцитозу або екзоци-тозу клГтини; ri, що можуть бути кГлерами сво!х ушко-джених тканин), то сучасш данГ характеризують !х як специфГчну зброю, що швидко мобшзуеться та без-посередньо заучена до процешв активаци ендотелГю, моноцитГв, макрофапв, тромбоцитГв, дендритних клГтин i Т-лГмфоцитГв. Iншими словами, нейтроф1ли — це головш менеджери Гмунного захисту, яю реагують на будь-якГ метаболГчно-обмшш та альтеративнГ про-цеси, що вГдбуваються в органГзмГ [7]. На думку деяких авторГв, оцГнка функцюнально! активностГ системи нейтрофГльних гранулоцитГв шляхом проведення ци-
Рисунок 1. Електронна м'крофотограф'ю. Сегментоядерний (нейтрофльний) лейкоцит (Лц) i моноцит (Мц) ¡з добре структурованою цитоплазмою в оточенн1 еритроцилв (Ер), л'мфоцита (Лф) i плазматично/ клтини (ПК). Патент Б., 67 р. Прогресуюча стенокардiя. Цукровий ^¡абет 2-го типу,
легка форма. Збльш. х 8000
Рисунок 2. Електронна м'крофотограф'ю. Сегментоядерний (нейтрофшьний) лейкоцит (Лц) i моноцит (Мц) з ознаками апоптозу: конденса^я гетерохроматину у ядрах (О), вакуол'зац'я цитоплазми (В), мкроклазматоз ворсинок цитоплазми i кальцифка^я ^iтин — осмiофiлiя цитоплазми (електронно-темна). Адгезя осмюфтьних i вакуолзованих тромбоцитв (Тр) до моноцита i лейкоцита. Патент Д., 72 р. Гострий повторний iнфаркт мокарда. Набряк легень. Цукровий дiабет 2-го типу, середньо/ тяжкост1. Дабетична нефропаля. Хронiчна ниркова недостатнiсть. Збльш. х 7000
Рисунок 3. Кальциф1кац1я вНцевих артер1й при 1ХС у поеднанн з ЦД 2-го типу. МСКТпатента Д., 72 р. (попередн1й випадок). Кальцевий ндекс 1599 од. Стеноз передньоI м1жшлуночково/ глки л1во/ коронарноI артери (ЛКА) на 90 %, стеноз огинаючоI глки ЛКА на 60 %, стеноз правоI коронарноI
артери на 90 %
томорфометричних дослщжень iз застосуванням авто-матизованих апаратних методiв, дозволяе прогнозува-ти перебй низки тяжких захворювань та штоксикацш [5]. Метод заснований на змЩ оптично! прозоростi клiтин в активованому сташ, в станi функцюнально-го спокою, а також при розвитку необоротних про-цесiв некробiозу чи апоптозу через дш на них рiзних ушкоджуючих факторiв. Вiдкладання депозитiв вну-трiшньоклiтинного кальцiю в лейкоцитах, що передуе запуску процесiв апоптозу цих кштин та виявляеться при свпловш мiкроскопii з використанням специфiч-них для даного юна способiв забарвлення або ж при електроннш мкроскопи, також впливае на оптичну прозорють дослiджуваних клiтин, а тому поеднання цих двох методiв, на нашу думку, матиме перспектив-не значення.
Загибель еритроцитш характеризуется деякими осо-бливостями, що не притаманш процесу апоптозу ядер-них клiтин [14]. Деяю автори для характеристики процесу апоптозу в еритроцитах пропонують вживати термш «егур1о818» (Ланг К.С. i сшвавт., 2005). Добре вщомо, що форма й еластичшсгь еритроцитiв значно залежать вщ iонiв кальцiю: збтьшення вм^у внутрiшньоклiтинного Са2+ призводить до змш !х форми та об'ему, пщвищення клиинно! жорсгкосгi й схильностi до гемолiзу. Ериптозис може бути викликаний енергодефiцитом, осмотичним шоком або окислювальним стресом [13]. Енергодефiцит (зниження активносп помпи Са2+-АТФази) призводить до входу кальцш у клiтини, що, в свою чергу, прискорюе трансмембранний рух калiю та хлориду з подальшою де-
гщратащею кл1тини. Енергодеф1цит разом 3i зниженням запас1в глугатiону також послаблюе антиоксидантний за-хист еритроцитав, що аналогiчним чином активуе транс-мембраннi катiоннi канали, посилюючи потак кальцiю в середину клiтини. Атерогенш та бiохiмiчнi змiни в кровi при 1ХС, а саме порушення лшдного обмiну з подальшою активащею перекисного окиснення лiпiдiв, гшер-пероксидаця й оксидативний стрес з утворенням вiльних радикалiв [9] призводять до переходу оксигемоглобiну в метгемоглобш, пщвищення активностi протеаз, каспаз, екстерналiзацi! фосфатидилсерину, збiльшення вмiсту внутрiшньоклiтинного кальцш, а в подальшому — до rni-цшцц процесiв апоптозу та порушення структури i функцй еритроципв [17].
Отже, наведенi данi свщчать про складнiсть та уш-версальнють механiзмiв апоптозу рiзних клiтин оргашз-му, що виникають пiд впливом рiзноманiтних патофiзiо-логiчних процесiв, до яких належать i фактори ризику 1ХС. З огляду на роль лейкоцитав як ключових реалiза-торiв клiтинного та гуморального iмунiтету в органiзмi людини, а також еритроцитав як найбтьшо! популяци формених елементав кровi та основних переносник1в газiв кровi особливого значення набувае дослщження саме цих клiтин для оцшки впливу рiзних факторiв ризику на виникнення та прогресування 1ХС. Визначення рiвня iонiзованого кальцiю плазми кровi та виявлення депозитiв кальцш в еритроцитах шляхом оптично! мь кроскопи е недорогим i надшним iндикатором активаци процесiв апоптозу клггин пщ впливом рiзних факторiв ризику 1ХС.
Рисунок 4. Множинн депозити кальцю в переважнй бЛьшост еритроцитв периферичноi кров1 (97 % клтин iз включеннями кальцю, 3-й ступнь за S.F. Nagueh, 1999, [19]). Патент Д., 72 р. (попереднiй випадок).
Забарвлення за Мак-П-Расселом.
Збльш. х 1000
Висновки
1. Наявшсть у пащенпв з 1ХС старшого i похи-лого вшу таких факторiв ризику, як цукровий дiа-бет 2-го типу, артерiальна гiпертензiя, атерогенна дислiпiдемiя, а також ожиршня, тютюнопалшня та професшш шыдливосп, призводить до активаци процесiв апоптозу лейкоцитiв, зокрема нейтрофшь-них гранyлоцитiв i моноципв/макрофапв. 1х можна виявити за допомогою сучасних специфiчних iмyно-логiчних теспв, а також електронно-мiкроскопiчних дослiджень.
2. Високий (400—999 од.) i дуже високий (понад 1000 од.) шдекс кальцифкаци коронарних артерiй асо-цшеться з кальцифiкацiею переважно! бiльшостi ери-троцитiв, апоптозом i кальцифiкацiею значного вщсотка лейкоцитiв периферично! кровi, що корелюе з наявнiстю та тяжистю 1ХС.
3. Виявлена асоцiацiя мiж кальцифiкацiею еритроци-тiв i лейкоцитав та iндексом кальцифiкацi! коронарних артерш е маркером прогресування 1ХС та може полегши-ти пошук профтактичних i лiкyвальних засобiв для опти-мiзацi! лiкyвання цього контингенту пащентав.
Конфлiкг iHTepeciB. Автори гарантують вщсутнють конфлiктy iнтересiв i власно! фшансово! зацiкавленостi при виконаннi роботи та написанш статтi.
Список лiтератури
1. Бiохiмiчнi механЗми апоптозу: Навчальний поабник/ Л.1. Остапченко, Т.Б. Синельник, Т.В. Рибальченко, В.К. Ри-бальченко. — К.: Видавничо-полiграфiчний центр «Кшвськийунi-верситет», 2010. — С. 8-9.
2. Гандзюк В.А. Аналiз захворюваностi на шемiчну хворобу серця в Украгт / В.А. Гандзюк // Украгнський кардiологiчний журнал. — 2014. — № 3. — С. 45-52.
3. Дiагностика ураження коронарних артерш у хво-рих на шемiчну хворобу серця за допомогою мультизршовог комп 'ютерног томографп / О. С. Никоненко, А. О. Никоненко,
Рисунок 5. Поодинок депозити кальцю
в окремих еритроцитах периферичноí кровi (30 % кл'¡тин ¡з включеннями кальцю, 2-й cryníHb за S.F. Nagueh, 1999). Патент Б., 67 р.
Прогресуюча стенокардя. Цукровий дiабет 2-го типу, легка форма. Забарвлення за Мак-П-Расселом. Збльш. х 1000
Б. С. Гаврменко, А.1. Лозовий // Запор1зький медичний журнал. — 2015. — № 1(88). — С. 4-8.
4. Колсник Н.В. Бюлогы нейтрофшв, сучасний погляд. Огляд/Н.В. Колсник, Ж..С. Качанова//Вкник Запорзького на-цюнального утверситету. — 2009. — № 1.
5. Стан системи нейтрофльних гранулоцит1в як чинник ризику тсляоперацтних ускладнень при аневризмах черевног аорти/ 1.В. Гомоляко, П.1. Шкультков, О.В. Лскунов [та 1н.]// Серце i судини. — 2015. — № 3. — С. 80-85.
6. Целуйко С.С. Предполагаемые механизмы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме: Метод. рекомендации / С. С. Целуйко, С.В. Зиновьев. — ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия, г. Благовещенск, 2013. — С. 17.
7. Associations between C-reactive protein, coronary arterycal-cium, and cardiovascular events: Implications for the JUPITER population from MESA, a population-based cohort study / M.J. Blaha, M.J. Budoff, A.P. DeFilippis[etal.]//Lancet. — 2011. — Vol. 378. — P. 684-692.
8. Coronary artery calcification is an independent stroke predictor in the general population /D.M. Hermann, J. Gronewold, N. Lehmann [et al.]// Stroke. — 2013. — Vol. 44. — P. 1008-1013.
9. Coronary artery calcium score and risk classification for coronary heart diseaseprediction / T.S. Polonsky, R..L. McClelland, N.W. Jorgensen [et al.] // JAMA. — 2010. — Vol. 303. — Р. 16101016.
10. Coronary calcium score improves classification of coronary heart disease risk in the elderly: The Rotterdam study / S.E. Elias-Smale, R.V. Proenca, M.T. Koller [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. — 2010. — Vol. 56. — Р. 1407-1414.
11. Effect of high glucose concentrations on human erythrocytes in vitro/ Jana Viskupicova, Dusan Blaskovic, Sabina Galiniak[et al.]// Redox Biology. — 2015. — Vol. 5. — P. 381-387.
12. Erythrocyte: Programmed Cell Death, Anemia. Donald Sil-verberg, Daniela Vittori, Daiana Vota, Alcira Nesse (Ed.). — 2012. — Available from: http://www.intechopen.com/books/anemia/erythro-cyte-programmed-cell-death
13. Family history of coronary heart disease and the incidence and progression of coronary artery calcification: Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) /A.K. Pandey, M.J. Blaha, K.. Sharma [et al.] // Atherosclerosis. - 2014. - Vol. 232. - P. 369-376.
14. Increased cation conductance in human erythrocytes artificially aged by glycation / Y.V. Kucherenko, S.K Bhavsar, V.I. Grischenko [et al.]//J. Membr. Biol. - 2010. - Vol. 235. - P. 177-189.
15. Kumar R Biochemical changes in erythrocyte membrane in type 2 diabetes mellitus / R Kumar // Indian J. Med. Sci. — 2012. — Vol. 66. - P. 131-135.
16. Manno S. ATP-dependent mechanism protects spectrin against glycation in human erythrocytes/S. Manno, N. Mohandas, Y. Takaku-wa//J. Biol. Chem. - 2010. - Vol. 285. - P. 33923-33929.
17. Oxidative damage increases intracellular free calcium [Ca2+] concentration in human erythrocytes incubated with lead/M.A.. Quin-tanar-Escorza, M.T. Gonzalez-Martinez, M.P. Intriago-Ortega, J.V. Calderon-Salinas // Toxicol. in Vitro. — 2010. — Vol. 24. — P. 1338-1346.
18. Prediction of coronary artery calcium progression in individuals with low Framingham Risk Score: The Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis / T.M. Okwuosa, P. Greenland, G.L. Burke [et al.]// JACC Cardiovasc. Imaging. — 2012. — Vol. 5. — P. 144-153.
19. Relation of the contractile reserve of hibernating myocardial structure in humans/S.F. Nagyeh, I. Mikati, D. Weilbaecher [et al.]// Circulation. - 1999. - Vol. 98, Suppl. - P. 490-496.
Отримано 06.05.16 ■
Кияк Ю.Г., КогутМ.А ., Андрушевская О.Ю., КогутЛ.М., Кияк Г.Ю., Барнетт О.Ю.
Львовский национальный медицинский университет имени Данила Галицкого, г. Львов, Украина
КАЛЬЦИФИКАЦИЯ И АПОПТОЗ КЛЕТОК КРОВИ КАК МАРКЕР НАЛИЧИЯ, ТЯЖЕСТИ И ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА В СОЧЕТАНИИ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-го ТИПА: УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Резюме. Актуальность. Увеличение внутриклеточного содержания Са2+ приводит к запуску процессов апоптоза и кальци-фикации клеток крови и сердечно-сосудистой системы. Тесная связь между апоптозом клеток крови и их кальцификацией дает основание считать кальций важным маркером и инициатором этого процесса. Цель роботы — исследовать ультраструктурные изменения и состояние клеточного иммунитета у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и сахарным диабетом (СД) 2-го типа, выявить ассоциацию между увеличением внутриклеточного кальция в эритроцитах и кальцификацией коро-нарних артерий. Материалы и методы. Обследованы 20 пациентов с ОКС в сочетании с СД 2-го типа. Контрольная группа представлена 10 пациентами. Средний возраст пациентов составил 65,0 ± 5,6 года. Проведена мультиспиральная компьютерная томография; цитологическое определение солей кальция в эритроцитах по методу Мак-Ги-Рассела; иммунологические исследования апоптоза лейкоцитов с помощью набора ApoLect; электронная микроскопия для выявления ультраструктурних признаков
апоптоза клеток крови. Результаты. У пациентов с высоким и очень високим индексом кальцификации коронарних артерий цитологически наблюдается наличие в эритроцитах гранул кальция различной величины и формы, фиолетово-синей окраски, анизо- и пойкилоцитоз эритроцитов; иммунологически — увеличение количества апоптотически измененных и появление некротически измененных клеток крови; характерными также являються классические ультраструктурные признаки апоптоза лейкоцитов. Выводы. Наличие ОКС у пациентов с СД 2-го типа сопровождается активацией процессов апоптоза лейкоцитов, накоплением ионов кальция в эритроцитах, что ассоциируется с высоким и очень високим индексом кальцификации коронарних артерий. Выявление данных изменений при исследовании периферической крови пациентов дает возможность своевременно заподозрить угрозу возникновения ишемической болезни сердца и предупредить развитие тяжелых ее осложнений.
Ключевые слова: апоптоз, кальцификация, острый коронарный синдром, сахарный диабет 2-го типа, клетки крови.
Kyiiak Yu.H., Kohut M.A., Andrushevska O. Yu., Kohut L.M., Kyiiak H. Yu., Barnett O. Yu. Lviv National Medical University named after Danylo Halytskyi, Lviv, Ukraine
CALCIFICATION AND APOPTOSIS OF BLOOD CELLS AS A MARKER OF THE PRESENCE, SEVERITY AND PROGRESSION OF CORONARY HEART DISEASE ASSOCIATED WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUS: ULTRASTRUCTURAL AND CYTOLOGICAL STUDIES
Summary. Background. The increase of intercellular content of Ca2+ leads to the initiation of apoptosis processes and calcification of the cells of the blood and cardiovascular system. The close relationship between the apoptosis of blood cells and their calcification gives reason to believe that calcium is an important marker and initiator of this process. Objective of the study — to follow-up ultrastructural changes and the state of cellular immunity in patients with acute coronary syndrome (ACS) and type 2 diabetes mellitus (DM), and to identify the association between increased intracellular calcium in red blood cells and calcification of coronary arteries. Materials and methods. The study involved 20 patients with ACS associated with type 2 DM. The control group included 10 persons. The average age of patients was 65.0 ± 5.6 years. The following examinations were performed: multispiral computed tomography; cytological determination of calcium salts in red blood cells using McGee-Russell method; immunological study of leukocyte apoptosis by means of ApoLect set; electron mi-
croscopy for detection of ultrastructural signs of blood cell apoptosis. Results. In patients with high and very high index of calcification of the coronary arteries, the presence of calcium granules of various sizes and shapes in red blood cells can be detected cytologically, as well as aniso-and poikilocytosis; immunologically — an increase in the number of apoptotically altered blood cells and the appearance of necrotically modified ones; also, classic ultrastructural signs of leukocyte apoptosis are typical. Conclusions. The presence of ACS in patients with type 2 DM is associated with activation of leukocyte apoptosis processes, accumulation of calcium ions in red blood cells, which is accompanied by a high and very high index of calcification of the coronary arteries. Detection of such changes in the study of peripheral blood of patients enables to suspect timely the threat of coronary heart disease and to prevent its serious complications.
Key words: apoptosis, calcification, acute coronary syndrome, type 2 diabetes mellitus, blood cells.
