CC BY
63
УДК 612.014.3:612.1:616-006:616.831-006.484
Дослщження процес1в апоптозу у мононуклеарних л1мфоцитах перифершно? кров1 та кл1тинах пухлин у хворих з глшмами головного мозку Лаяний M.I., Любич Л.Д., Главацький О.Я., Лаяний О.М. 1нститут нейрохирурги 1м. акад. А.П. Ромоданова АМН Украши, м.Ки'1в
Одним з основних напрямюв сучасно! онкоГму-нологп е вивчення мeханiзмiв вислизання пухлини з-шд iмyнoлoгiчнoгo контролю, причин Гмуности-муляцп росту пухлин i !х супресивного впливу на клiтини системи iмyнiтeтy [2, 3]. Прогресування росту пухлини — складний багатостадшний процес, спри-чинений дисбалансом мiж процесами пролГферацп, диференцшвання i загибeлi клiтин, насамперед, апоптозу, яю регулюються клiтинними онкогенами (c-myc, c-fos, c-jun, bcl-2 та ш.) i генами-супресорами росту пухлин (p53, bax, Rb, p21, mdm2 та ш.) [8]. Характерною ознакою пухлини е те, що 'i'i клгтини уникають апоптозу [24].
Апоптоз е загальнобюлопчним мeханiзмoм, що вiдпoвiдае за шдтримку пoстiйнo'i кiлькoстi популя-цш клiтин, а також формоутворення i вГдбракування дефектних клiтин [1]. Апоптоз, або програмована загибель клгтин, е переважним типом !х смeртi пiд час нормального розвитку, регенерацп, пролГфера-цН та патолопчно1 дегенерацп в ЦНС [16]. Процес апоптозу розподГляють на два типи залежно вГд залучення миохондрш або бioхiмiчних каскадiв клiтин. Перший, або внyтрiшнiй шлях апоптозу, шщшють числeннi цитoтoксичнi стимули, вш опо-середковуеться викиданням цитохрому С i подаль-шою активацiею низхГдних каспаз. Зoвнiшнiй шлях апоптозу включаеться при зв'язyваннi рeцeптoрiв смeртi, зокрема, Fas, лГгандГв родини TNF TRAIL-R1, TRAIL-R2 (TNF-related apoptosis inducing ligand -R), TNFRp55, i опосередковуеться прямою активацiею висхiдних каспаз. Система Fas-FasL е iндyктoрoм швидко! смeртi клггин, що забезпечуе рeалiзацiю клiтиннo-oпoсeрeдкoванol цитотоксичносп, пери-фершно1 Гмунно1 регуляцп, Гмунно1 привiлeйoванoстi та «контратаки» клгтин злояюсно1 пухлини проти Гмунно1 системи хазяша [16].
У багатьох пухлинах штенсившсть апоптозу прямо пов'язана з прогреыею, зменшенням ступеня зрГлосл клгтин, типом пухлини. Апоптоз контролю-ють т самi цитоюни, протоонкогени i гени-супресори росту пухлин, яю контролюють процеси пролГфера-цп i дифeрeнцiювання клгтин. Вы ц процеси псно взаемопов'язаш шд час прогресування росту пухлини, коли часто виявляють гшерекспресш клгтинних онкогешв з мутащею гешв-супресорГв [8].
Методи виявлення апоптозу рГзномаштш. Спо-чатку найбГльш поширеним способом визначення апоптозу був електрофорез екстраговано1 фракцп ДНК, який дозволяв виявити дискретшсть низько-молекулярно1 ДНК за молекулярною масою (як на-слГдок мГжнуклеосомно1 деградацп ДНК). За даними морфолопчних дослГджень для визначення розриву ДНК використовують TUNEL-метод, оснований на формуванш вставок мГчених олГгонуклеотидГв в дь лянках розриву ДНК, утворення яких каталГзуеться ферментом TdT [9]. У нишшшй час для реестрацп
апоптозу лГмфоцилв все ширше застосовують методи, основан! на проточнш цитофлуориметрп. До öiei групи належить метод, що передбачае виявлення втрати клГтинами частини ДНК (пподипло1дних клГтин) за допомогою флуоресцентного барвника — пропвдума йодиду (Р1). Апоптоз лГмфоцилв можна виявити вже на раншх його етапах за допомогою барвника Hoechst, а також мГченого флуорохромом аннексину V, який зв'язуеться з фосфатидилсерином, що експонуеться на мембранах клггин, що зазнали апоптозу [7, 10]. ОрГентовне уявлення про «схиль-шсть» лГмфоцилв до апоптозу можна отримати при визначенш на !х поверхш Fas-рецептора (CD-95) та в мгтохондрГях — протоонкогена bcl-2.
Метою роботи було дослГдження процеыв апоптозу у мононуклеарних лГмфоцитах перифершно! кровГ (ПК) та зразках пухлин хворих з внутрГшнь-омозковими пухлинами.
Матер1али i методи дослщження. МатерГалом для дослГдження були свГжовидшеш мононуклеари перифершно! кровГ (МНЛПК) та клгтини пухлин 116 хворих, видалеш шд час операцп з приводу пухлин мозку рГзно! структури i ступеня анаплазп, в тому числГ глюми II ступеня анаплазп (n=20), III ступеня (n=34), IV ступеня (n=23); медулобластоми (n=39), а також здорових оыб (n=20, контрольна група).
МНЛПК видГляли шляхом центрифугування у градГент щшьноси 1,077 (трюмбраст) за швидкосл 1500 об./хв протягом 30 хв, двГчГ вГдмивали забуфе-реним фГзрозчином (ЗФР) з рН 7,2-7,4.
Клгтини пухлини отримували з бюптапв шляхом ретельного суспендування за допомогою шприця з товстою голкою, двГчГ вГдмивали ЗФР з рН 7,2-7,4. Життездатшсть клгтин визначали за включенням 0,2% розчину трипанового синього («Merch», Шмеч-чина). В уых отриманих зразках визначали клгтини у сташ апоптозу.
Визначення клimuH, що перебувають у стат апоптозу за допомогою барвника Hoechst. Для фарбування Hoechst 33342 (Sigma, США) клгтини вГдмивали в ЗФР шляхом центрифугування за швидкост 1500 об./хв протягом 5 хв, шкубували в розчиш Hoechst 33342 (0,1 мкг/мл) протягом 30 хв при температур! (37±0,1)°С. ВГдмит в ЗФР клгтини суспендували в 50% розчиш глщерину i наносили на предметш скельця. Препарати вкривали покривними скельцями i запаювали. АналГз клгтин, що перебу-вали у сташ апоатозу, здшснювали за допомогою Гмерсшно! системи мшроскопа ЛЮМАМ (Роыя) при збшьшенш х900.
Визначення клтин, що перебувають у стан апоптозу, цитофлуориметричним методом з ви-користанням Р1. ДослГдження проводили за загаль-ноприйнятими рекомендащями [9]. Для пермеабШза-цп клГтинно! мембрани МНЛПК фшсували у 400 мкл 70% етилового спирту протягом 1 год при температур!
4°С, центрифугували, в!дмивали ЗФР. Додавали 200 мкл розчину Р1 (5мкг/мл) у фосфатно-сольовому буфер! (ФСБ) з додаванням 0,1% розчину тритону Х=100 та 0,1% розчину натр!ю цитрату. 1нкубували протягом 1 год в темнот! та анал!зували за допомогою проточного цитофлуориметра FACSCalibur («Becton Dickinson», США) з аргоновим лазером за довжини хвил! 488 нм. Оц!нювали к!льк!сть кл!тин у фракц!!, розташован!й в зон! г!стограми, що в!дпов!дае суб-дипло!дному вм!сту ДНК.
Експресгю антигену CD95 (FAS-рецептор) на кл!тинах визначали за допомогою !мунофенотипу-вання непрямим !мунофлуоресцентним методом [9]. Анал!з кл!тин проводили за допомогою проточного цитофлуориметра.
Результати та ¿х обговорення. Визначення ргвня апоптозу у МНЛПК хворих з внутршньомозковими пухлинами р{зного генезу i ступеня злоятсностг. П!д час обстеження хворих з пухлинами головного мозку д!апазон !ндив!дуальних коливань к!лькост! МНЛПК, що перебували у стан! апоптозу (б!льш!сть фракц!! МНЛПК), становив в!д 0 до 50%. Життез-датн!сть МНЛПК у тест! з трипановим син!м була високою —84,5-100%, достов!рно! р!зниц! показника у контрольн!й та досл!дних групах не було.
К!льк!сть CD95+ кл!тин, що експресували рецептор готовност! до апоптозу, зменшувалася у м!ру зб!льшення ступеня анаплаз!! гл!оми в!д II до IV (табл. 1). При цьому у хворих з гл!омами II ступеня анаплаз!! к!льк!сть CD95+ кл!тин достов!рно перевищувала таку в контрольно: групи та у хво-рих з гл!омами IV ступеня анаплаз!!. За наявност! медулобластоми к!льк!сть CD95+ кл!тин достов!рно перевищувала таку у контрольн!й груп! та у хворих з гл!омами III ! IV ступеня анаплаз!!.
Hoechst 33342 е ДНК-тропним барвником, який з'еднуеться з ДНК у м!сцях A-G пар ! виявляе кл!тини у стан! апоптозу вже через 6-8 год п!сля того, як вони отримали в!дпов!дний стимул, тобто, на ранн!х стад!ях каскаду апоптозу. П!д час анал!зу
середньо! к!лькост! Hoechst33342+ кл!тин у стан! апоптозу серед л!мфоцит!в ПК у хворих з гл!омами цей показник зменшувався у м!ру зб!льшення сту-пеня анаплаз!! гл!оми в!д II до IV. Р!вень апоптозу МНЛПК у хворих з гл!омами II ! III ступеня анаплаз!! перевищував такий у контрольн!й груп!, у хворих з гл!омами IV ступеня анаплаз!! в!н був меншим в!д контрольного.
Середня к!льк!сть Hoechst33342+ кл!тин у стан! апоптозу серед МНЛПК у хворих з медулоблас-томами достов!рно перевищувала цей показник у контрольн!й груп!.
К!льк!сть PI+ кл!тин серед МНЛПК у хворих з гл!омами II ступеня анаплаз!! була достов!рно менша, н!ж у контрольн!й груп!, у хворих з гл!омами III ! IV ступеня анаплаз!!, а також з медулобластомою середня к!льк!сть PI+ кл!тин перевищувала таку у контрольн!й груп!.
Таким чином, к!льк!сть Hoechst33342+ та CD95+ кл!тин серед МНЛПК хворих з гл!омами св!дчила про однотипну тенденц!ю до зменшення у м!ру зб!льшен-ня ступеня анаплаз!! гл!оми. Тако! кореляц!! не спос-тер!гали при досл!дженн! PI+ кл!тин у стан! апоптозу. Навпаки, к!льк!сть PI+ кл!тин мала тенденц!ю до зб!льшення у м!ру зб!льшення ступеня злояк!сност! гл!ом. Найменша к!льк!сть Hoechst33342+ та CD95+ кл!тин в!дзначена у хворих з гл!областомою, найб!ль-ша — з медулобластомою. Найб!льшу к!льк!сть PI+ кл!тин виявляли у хворих з медулобластомою.
Визначення ргвня апоптозу клтин пухлини у хворих з внутршньомозковими пухлинами ргзного генезу i ступеня анаплазИ. П!д час досл!дження зразк!в кл!тин пухлин встановлено, що з св!жовид!-лених кл!тин пухлини к!льк!сть CD95+ кл!тин, що експресували рецептор готовност! до апоптозу, була достов!рно меншою у зразках гл!областоми, н!ж гл!о-ми III ступеня анаплаз!! (табл. 2), у зразках гл!ом III ступеня анаплаз!! !х к!льк!сть достов!рно переви-щувала таку у зразках гл!оми II ступеня анаплаз!! та гл!областоми.
Таблиця 1. Р1вень апоптозу МНЛПК у хворих з внутршньомозковими пухлинами р1зного ступеня анаплаз!!
Вид, стушнь анаплази пухлини К1льк1сть кл1тин у сташ апоптозу К1льк1сть життездатних кл1тин, %
Hoechst+ % PI+ CD95+
Глюма II (n=20) M±m 21,60±4,68"* 13,45±0,43* 16,84±4,44*" 97,18±1,43
Розмах вар1ацп 13,60-31,00 12,80-14,10 9,00-25,90 92,90-99,20
Глюма III (n=34) M±m 15,80±7,02 #&* 16,24±6,46 11,18±4,27# 93,79±4,06
Розмах вар1ацп 1,80-33,60 3,30-22,90 6,00-19,40 85,80-100,00
Глюма IV (n=23) M±m 5,09±2,74"#@* 18,53±6,54 9,41±4,15"& 97,69±2,04
Розмах вар1ацп 1,00-10,30 7,70-35,30 5,70-21,60 90,30-100,00
Медулобластома (n=39) M±m 23,63±9,08*&@ 23,36±11,63 17,63±6,80*#& 95,33±5,56
Розмах вар1ацп 8,00-50,70 5,92-40,80 8,60-33,50 84,50-100,00
Контроль (n=20) M±m 10,55±5,68 18,69±6,36 6,42±2,21 98,57±1,37
Розмах вар1ацп 0,00-20,00 7,30-27,43 3,40-18,80 94,10-100,00
Прим1тка. Р!зниця показник!в достов!рна у пор!внянн! з такими: * — в контрольн!й груп!; #, &, @ — в !нших групах. Те ж у табл. 2.
Таблиця 2. Р1вень апоптозу кл1тин у хворих з пухлинами головного мозку р1зного ступеня анаплази
Вид, стушнь анаплази пухлини К1льк1сть кл1тин у сташ апоптозу Шльшсть життездатних кл1тин, %
Hoechst+ % PI+ CD95+
Глюма II (n=20) M±m 34,43±14,62 67,42±2,89"#& 8,70±0,43" 54,05±17,04
Розмах вар1ацп 4,20-56,10 21,58-61,65 8,05-9,35 50,00-92,30
Глюма III (n=34) M±m 22,45±12,17 37,45±17,25" 16,07±2,03"# 51,45±13,73
Розмах вар1ацп 4,20-40,70 3,30-60,65 12,00-19,50 50,30-88,90
Глюма IV (n=23) M±m 29,15±12,70 27,00±10,90# 6,78±0,74# 65,13±10,30
Розмах вар1ацп 10,10-48,20 14,60-48,80 3,70-8,15 50,00-87,70
Медулобластома (n=39) M±m 28,87±22,27 43,80±14,46& 10,8±0,52 66,60±11,71
Розмах вар1ацп 6,40-74,40 15,50-71,72 8,15-11,30 50,00-96,80
З cвiжoвидiлeних клггин пухлини Hoechst33342+ бyлo y cepeдньoмy вГд 22% (3a нaявнocтi acтpoцитoми III стутеня анаплазп) дo 35% (глюми II cтyпeня aRan-лазп). З клггин глioм кiлькicть Hoechst33342+ клггин y CTaffl aпoптoзy бyлa нaйнижчoю y зpaзкaх глioми III стутеня aнaплaзiï, дeщo бiльшoю — y 3pa3Mx глюб-лacтoм, нaйбiльшoю — y 3pa3^x глioм II cтyпeня aнaплaзiï. B мeдyлoблacтoмaх виявлeнo y cepeдньoмy 30% Hoechst33342+ клгтин y стаж aпoптoзy.
Кiлькicть PI+ клгтин змeншyвaлacя y Mipy збшь-швння cтyпeня злoякicнocтi глioми, y cepeдньoмy з 67% — y 3pa3Mx глioм II cтyпeня aнaплaзiï дo 27%
— y зpaзкaх глioблacтoм. У мeдyлoблacтoмaх м^ти-лocя в cepeдньoмy 44% PI+ клгтин.
Таким чинэм, y зpaзкaх глioм IV стутеня анап-лaзiï, пopiвнянo з глioмaми II i III cтyпeня aнaплaзiï, мicтилacя нaймeншa кiлькicть клгтин y тepмiнaльнiй cтaдiï aпoптoзy (PI+), нaймeншa кiлькicть CD95+ клгтин (шр нecyть peцeптop гoтoвнocтi дo aпoптoзy) i cepeдня кiлькicть клгтин нa paннiх, a6o oбopoтних, cтaдiях aпoптoзy (Hoechst33342+).
СлГд зaзнaчити, шo життeздaтнicть cвiжoвидiлe-них клгтин пухлин y тecтi з тpипaнoвим cинiм вiдpiз-нялacь y зpaзкaх piзнoгo виду пухлини тa cтyпeня aнaплaзiï. НайбГльш життeздaтними були зpaзки глioблacтoм тa мeдyлoблacтoм, мeнш життeздaтними
— 3pa3№ глioм II i III стутеня aнaплaзiï.
Тaким чинoм, кiлькicть лiмфoцитiв, шo ^pe6y-вaють y сташ aпoптoзy, y хвopих з внyтpiшньoмoзкo-вими пyхлинaми пepeвишye тaкy в пулГ лiмфoцитiв в нopмi.
Poль iмyннoï cиcтeми y кoнтpoлi poCTy i ïïomH-peння пухлини зaлишaeтьcя пpeдмeтoм диcкyciï пpo-тягoм ocтaннiх дecятилiть. B дeяких cитyaцiях Гмунш клгтини мoжyть внocити вклaд y зaхиcт opгaнiзмy вГд пухлини, Т-лiмфoцити вiдiгpaють кpитичнy poль y пpoтипyхлиннiй вiдпoвiдi. Бaгaтo acпeктiв взaeмoдiï Miœ клiтинaми пухлини i Т-лiмфoцитaми ^ визнaчeнi. Oчeвиднa нeздaтнicть лiмфoцитiв, ш^ iнфiльтpyють пухлину, iндyкyвaти знaчнy зaгибeль клгтин пухлини вcтaнoвлeнa пpи piзних злoякicних нoвoyтвopeннях. Bвaжaють, шo мiкpooтoчeння пухлини cпpaвляe cyпpecивний вплив нa клгтини Гмун-нoï OTCTeM^ пepeшкoджaючи peaлiзaцiï eфeктивнoï пpoтипyхлиннoï в^тов^ [2].
Oцiнюючи oтpимaнi дaнi визнaчeння aпoптoзy y МНЛПК y здopoвих oci6, cлiд пaм'ятaти, шo aпoптoз вiдiгpae вaжливy poль y тканинтому гoмeocтaзi, вш e ключoвим кoмпoнeнтoм пpoцeciв фopмoyтвopeння, пiдтpимки пocтiйнoï юлькат клгтин в opгaнaх i ць лoмy opгaнiзмi, peгyляцiï cклaдy топуля^й клгтин, видaлeння cтapих клгтин тoщo [13]. Апoптoз вiдiгpae piзнoмaнiтнy poль тaкoж в Гмунних пpoцecaх: зa дo-пoмoгoю цьoгo мeхaнiзмy вибpaкoвyютьcя лiмфoцити з нeвдaлo cфopмoвaними aнтигeнpoзпiзнaвaльними peцeптopaми, вiдбиpaютьcя клoни лiмфoцитiв (вида-ляютьcя ayтocпeцифiчнi клoни i клгтини, нe здaтнi poзпiзнaвaти aнтигeни y cклaдi мoлeкyл гoлoвнoгo кoмплeкcy гicтocyмicнocтi), peaлiзyeтьcя клiтиннo-oпocepeдкoвaний цитoлiз, видaляютьcя лiмфoцити, Шo peaлiзyвaли cвoï Гмунш функцп. Тoбтo, aпoптoз e cклaдoвoю нopмaльних фiзioлoгiчних пpoцeciв y opгaнiзмi.
Зa нЕшими дaними, y кoнтpoльнiй гpyпi cepeд МНЛПК мicтилocя y cepeдньoмy 6,5% клгтин, шo
eкcпpecyвaли Fas-R (CD95+), 10,5% (вщ 0 дo 20%)
— Hoechst33342+ клгтин y cтaнi aпoптoзy, 16,6% PI+ клгтин. Oтpимaнi даш шoдo кiлькocтi Hoechst33342+ клгтин yзгoджyютьcя з даними шших дocлiдникiв [7], яю встаждаили, шo oдpaзy пicля видiлeння юльюсть Hoechst33342+ МНЛПК y cтaнi aпoптoзy y здopoвих oci6 cтaнoвилa y cepeдньoмy 22%, змeнmyючиcь шд 4ac культивування y пoвнoмy псжиБиэму cepeдoви-шГ чepeз 24 гoд y cepeдньoмy дo 18%. Цeй пoкaзник хapaктepизye cпoнтaнний aпoптoз, за я^го клгтини гинуть бeз yчacтi зoвнiшнiх чинниюв пo зaкiнчeннi дл «внyтpiшньoгo годинника». Нopмaтивнa кiлькicть гiпoдиплoïдних клгтин (PI+), тoбтo клгтин з чacткoвo втpaчeнoю ДНК y здopoвих дoнopiв cтaнoвить в ce-peдньoмy (7,62+1,06)% [9]. Нами oтpимaнi дeшo бшьшГ знaчeння — (16,57±5,42)%, шo, ймoвipнo, зyмoвлeнe тим, шo дo кoнтpoльнoï гpyпи включeнi yмoвнo здo-poвi ocoби, y яких нe бyлo пpoцeciв нeoтpaнcфopмaцiï, пpoтe, нe виключeнa нaявнicть пpихoвaних запаль-них a6o iнфeкцiйних пpoцeciв.
У хвopих з глюмами кiлькicть CD95+ клгтин, шр нecyть peцeптop гoтoвнocтi дo aпoптoзy, та Hoechst33342+ клгтин y стаи aпoптoзy cepeд МНЛПК змeншyвaлacя y мipy збiльшeння cтyпeня анаплазп глioми вГд II дo IV. Юльюсть лiмфoцитiв y cтaнi aпoптoзy y хвopих з глioмaми II i III cтyпeня анаплазп пepeвищyвaлa таку y пaцieнтiв кoнтpoльнoï ^упи, a y хвopих з глюмами IV cтyпeня анаплазп змeншyвaлacя мaйжe дo кoнтpoльнoгo piвня.
Сигнал атоптозу мoжe бути oтpимaний клiтинoю piзними шляхами. Bидiляють два типи пpoвiдних cигнaльних шляхГв:
- пoшкoджeння ДНК, paдiaцiя, дГя тoкcичних aгeнтiв, глюкoкopтикoïдiв, пpипинeння цитoкiнoвoï peгyляцiï, вкopoчeння дo кpитичнoгo piвня тeлoмep (пpи цьoмy aктивiзyeтьcя кacпaзa 9);
- пpoaпoптoтичнi cигнaли, шo виникають шд 4ac активацп peцeптopiв «peгioнy клiтиннoï cмepтi» (Fas-R, TNF-R) i залучають активацш кacпaзи 8 [1].
Пepeдaчa пpoaпoптoтичнoгo cигнaлy пpи зв'язуванш лГганду з peцeптopaми peгioнy cмepтi клгтин вiдбyвaeтьcя за дoпoмoгoю aдaптopних бшюв FADD/MORT1, N-тepмiнaльний peгioн (DED) яких, в cвoю чepгy, зв'язyeтьcя з aнaлoгiчним peгioнoм пpoкacпaзи 8, ш^ cпpичиняe ïï ayтoкaтaлiтичнy активацш. Шд 4ac активацп дeяких члeнiв ciм'ï TNF-peцeптopiв (y тому чиадГ TNF-R1) викopиcтoвyeтьcя дoдaткoвий aдaптopний бiлoк TRADD.
Oдин з peцeптopiв «peгioнy клiтиннoï cмepтi»
— антиген Fas/APO-1 (CD95+) eкcпpecoвaний y людини на кopтикaльних тимoцитaх, aктивoвaних Т- i B-лiмфoцитaх. Piвeнь eкcпpeciï щю^э aнтигeнy пiдвишyeтьcя з вiкoм. Екcпpeciя Fas/APO-1-aнтигeнy з'являeтьcя на нeoнaтaльних Т- i B-лiмфoцитaх пicля '¡х активацп фiтoгeмaглютинiнoм a6o iнтepлeйкiнoм (IЛ)-2. Як в нopмaльних клгтинах, так i в клгтинах злoякicних пухлин eкcпpeciя Fas/APO-1 пiдвишyeть-cя пicля культивування з Ш-2 та iнтepфepoнoм-Y (№Н-у) [13].
Змeншeння кiлькocтi Hoechst33342+ клгтин y cтaнi aпoптoзy cepeд лiмфoцитiв ПК y хвopих з глюмами y мipy збiльшeння cтyпeня aнaплaзiï глioми, на пepший пoгляд, нe yзгoджyeтьcя з oтpимaними нами parnrne даними пpo вплив cyпepнaтaнтiв 48-гoдинних кyльтyp глioм на piвeнь aпoптoзy лiмфoцитiв здo-
рових flOHopiB in vitro, зпдно яких злояюсна глюма справляе бiльш виражений проапоптогенний вплив, шж дoбpoякiснa [5]. Очевидно, in vivo циpкyлюючi в ПК МНЛПК y хворих з глюмами зазнають впливу значно бiльшoï юлькосл чинникiв, нiж у змодельо-ванш in vitro клiтиннiй системi, що включае пряму дiю гуморальних чинниюв глioми на МНЛПК здо-рових оыб.
Кiлькiсть Hoechst33342+ та CD95+ клггин серед МНЛПК у хворих з глюмами мала однотипну тен-денцш до зменшення у мipy збiльшення ступеня злoякiснoстi глioми, не корелюючи з вмiстoм Р1+ клггин. Очевидно, це пояснюеться тим, що барвник Hoechst33342 виявляе клгтини у стадп раннього i оборотного апоптозу, експреыя CD95+ свГдчить лише про готовшсть до апоптозу, а барвник Р1 виявляе п-пoдиплoïднi клиини у термшальних стадГях апоптозу й некрозу, коли вони вже втратили частину ДНК [10]. Найменша юльюсть Hoechst33342+ та CD95+ клгтин вГдзначена у МНЛПК у хворих з глюбластомами.
Юльюсть Р1+ клгтин у хворих з глюмами збшь-шувалася у мГру збГльшення ступеня злояюсноси глгом. Таким чином, у мГру збшьшення ступеня анаплазп глюм у пулГ МНЛПК зменшувалась юльюсть клгтин на раншх, оборотних стадГях апоптозу, i, нав-паки, збшьшувалася юльюсть клгтин у необоротних, термшальних його стадГях, що може свГдчити про збГльшення проапоптотичного супресивного впливу пухлин глГального Генезу у мГру збГльшення ступеня злояюсно'' трансформацп.
НеобхГдно вГдзначити чималу юльюсть свГд-чень Гмуносупресивного впливу глюм. ЙмовГрно, багато мехашзмГв створюють стан Гмуносупресп в мшрооточенш глгоми, включаючи секрецш рГзних цитоюшв (трансформуючий фактор росту-ß, 1Л-10) або взаемодш за типом клггана-клггана (експреыя Fas-лГганду клгтинами глюми) [14, 19].
Вважають, що апоптоз Т-лГмфоцилв, регульо-ваний через продукцш 1ФН-у або TNF-a, ввдграе важливу роль у патогенез! глюбластом [11]. Так, у хворих з глюбластомами характерне Гснування, як мМмум, двох Гмунних фенотишв: I — з ознаками вираженого Гмунодефщиту i II — без такого. У хворих з фенотипом I юльюсть CD95+ лГмфоцилв у 2-3 рази перевищувала норму, з фенотипом II — цей показник не перевищував 30-60%. Таю розбГжносл пов'язують з високою апоптотичною актившстю Т-лГмфоцилв у хворих за наявносл I фенотипу, у яких мехашзми Fas-опосередкованого апоптозу можуть ввдгравати Гстотну роль у патогенез! пухлини. В груш I також була достовГрно зменшена продукщя TNF-a, №Н-у та 1ФН-а, що корелювало з концентращею CD95+ лГмфоциив [12].
До шдтримання статусу Гмуносупресп у ЦНС залучаеться Fas-FasL система. Клгтини глГальних пухлин експресують Fas (APO-1/CD95) рецептор, тодГ як в нормГ клгтини ЦНС його не експресують [14]. За шшими даними, Fas i FasL експресуються в ЦНС у нормГ, ''х експреыя шдвищуеться при запа-ленш i дегенерацп мозку [16]. Таким чином, Fas-FasL систему можна трактувати як «меч з двома лезами» в ЦНС: з одного боку, вона шдтримуе Гмуносупресив-ний статус у неураженому мозку, з шшого, шдукуе смерть нейрональних клгтин i запалення при рГзних невролопчних захворюваннях [16].
Шд час дослГдження 42 зразюв астроцитоми у дГтей встановлено, що 50-100% клгтин цих пухлин експресують CD95. Також доведено, що пухлини мозку продукують аутокринний FasL (лГганд) i навГть можуть переключати CD95-тpaнсдyкцiйний сигнал з програми загибелГ клгтин (апоптозу) на програму ''х пролГферацп [14]. Таким чином, потужна експреыя Fas-рецептора на клГтинах астроцитом е способом, яким Т-лГмфоцити можуть реалГзувати свш про-типухлинний ефект, проте, одночасно може бути способом уникнення Гмунно'' вщповвд.
За нашими даними, юльюсть CD95+ клгтин, що експресували рецептор готовност до апоптозу, у рГзних зразках глюм становила вГд 3 до 20% i була достовГрно нижчою у зразках глюбластоми, порГвняно з глюмами III ступеня анаплазп. У зразках глюм IV ступеня анаплазп, порГвняно з глюмами II i III ступеня анаплазп, юльюсть клиин, що перебували у термшальнш стадп апоптозу (PI+), була найменшою, юльюсть CD95+ клгтин, що несуть рецептор готов-ност до апоптозу — також найменшою, клгтин на раншх, оборотних стадГях апоптозу (Hoechst33342+) — середньою. Юльюсть PI+ клгтин зменшувалася у мГру збГльшення ступеня анаплазп глюми. НашГ даш узгоджуються з даними, отриманими шшими дослГд-никами [6]. Таким чином, у мГру збшьшення ступеня злояюсносл глюми юльюсть клгтин пухлини, що спонтанно гинуть шляхом апоптозу, зменшуеться.
З використанням ГмунопстохГмГчних методГв [18] було показано, що Т-лГмфоцити у сташ апоптозу, що експресують Fas, локалГзувались у безпосереднш близькост або перебували у прямому контакт! з FasL-експресуючими клГтинами пухлин. Клгтини злояюсно'' глюми людини експресують CD95-лiгaнд i вбивають Т-лГмфоцити людини шляхом взаемодп CD95/CD95-лiгaнд. Апоптоз Т-лГмфоцилв блокуеть-ся, якщо взаемодГя CD95-лiгaндy, експресованого на клгтинах глюми, з CD95, експресованим на Т-лГмфоцитах, ГнгГбуеться конкурентно розчинним CD95-пpoтеïнoм. Автори роблять висновок, що спри-йнятливГсть до CD95-oпoсеpедкoвaнoгo апоптозу за-лучае регуляторнГ мехашзми, що рГзняться вГд рГвнГв експресп CD95 i CD95-лiгaндy; численнГ мехашзми, яю включають розчиннГ фактори (TGF-ß) i клГтиннГ сигнали (CD95-лiгaнд-iндyкoвaний сигнал), визна-чають «вислизання» злоякГсних пухлин головного мозку вГд Гмунно'' вщповвд [15].
Ще одним чинником, який дозволяе глюмам уникати Гмунно'' вщповвд, е CD70-oпoсеpедкoвaний апоптоз Гмунних ефекторних клгган [26]. CD70 — кль тинний лГганд, що належить до родини фактора некрозу пухлин, а його рецептор — CD27. Зв'язування CD27 може шдукувати апоптоз. За даними скриншгу панелГ лГнГй клГтин глГом людини 11 з 12 лшш експресують CD70; за даними ГмуногГстохГмГчних дослщ-жень CD70 виявлений у 5 з 12 глгобластом i у 3 з 4 анапластичних астроцитом, тодГ як експреыя CD27 не виявлена в жодному спостереженш. CD70-пoзитивнi клГтини глГоми Гндукували апоптоз МНЛПК через CD70-зaлежний шлях.
У нашому дослщженш у мГру збшьшення ступеня анаплазГ'' пухлини юльюсть CD95+/FAS-Apo-1 та Hoechst 33342+ лГмфоцитГв у станГ апоптозу зменшувалася, це свГдчило, що рГвень апоптозу перифершних лГмфоцитГв, зумовлений як FAS/
FASL-сигнальним шляхом апоптозу, так i рецеп-торно-незалежними сигнальними мехашзмами, яю контролюються генами p53 i родиною генiв bcl-2, зменшуеться у мiру збiльшення ступеня анаплазп глюми. Можливо, це зумовлене прогресуванням ге-нетичних змiн при утвореннi глюм головного мозку, що потребуе подальшого вивчення.
За нашими даними, найбГльша кiлькiсть Hoechst33342+ та CD95+ клггин вiдзначена у МНЛПК у хворих з медулобластомами, вона достовiрно переви-щувала показник у контрольнiй груш. У зразках меду-лобластом виявлено у середньому 30% Hoechst33342+ клггин у станi апоптозу та 44% Р1+ клiтин.
Клiтини медулобластоми мГстять численнi юль-юсш i структурш хромосомш аберацii. У 21% медуло-бластом вiдзначенi мутацii TP53, метильований P14ARF або делецiю INK4A/ARF [17, 21], тобто змши у пухлин-но-супресорному шляху. Мутацii Shh (Sonic hedgehog signaling) рецептора PATCHED (PTCH), асоцшоваш з медулобластомами, порушують диференщацш гра-нулярних клгтин мозочка i беруть участь в утвореннi пухлини шляхом активацп пролiферацii i/або зни-ження рГвня апоптозу [23]. В клГтинах медулобластом людини, пухлинах мишей Ptc+/- (гетерозиготних за patched) виявляють зниження рГвня апоптозу in vivo [20, 23]. Втрата функцп р53 може бути наслiдком не тшьки мутацii ТР53, а й амплiфiкацii або надекспресii гена MDM2, що спричиняе зниження апоптотично: вГдповвд пухлини на радютерапш i зменшення три-валостi виживання [22].
Клгтини медулобластоми коекспресують CD95 i CD95L [25]. При оброблянш лшш клгтин медулобластоми людини ШФ-у або TNF-a спостерiгали посилення експресii CD95 i чутливост до CD95-опосередкованого апоптозу, тодГ як шпбгтори каспази блокували CD95L-iндуковану цитотоксичшсть [25]. Вважають, що CD95 може бути перспективною мiшенню для iмунохiмiотерапii медулобластоми людини. Показано, що в основ! стшкоси клГтин медулобластоми до лiганд-iндукованого TNF апоптозу лежить втрата експресп мРНК каспази-8 за-вдяки аберантному метилюванню гена, асоцшована з несприятливим клШчним перебГгом [24].
Таким чином, юльюсть лГмфоципв у станi апоптозу у хворих з внутрГшньомозковими пухлинами перевищуе таку у здорових оыб. Це може свГдчити про проапоптотичний вплив пухлин мозку на Гмуно-компетентш клгтини хворого за наявностi пухлини. У мГру збiльшення ступеня анаплазп глюм у пулГ МНЛПК зменшувалась юльюсть клгтин у раннiх, оборотних стадiях апоптозу, i, навпаки, збшьшува-лася юльюсть клгтин у необоротних, термшальних його стадiях, що може свГдчити про наростання проапоптотичного супресивного впливу пухлин глiального Генезу у мГру збiльшення ступеня злоя-юсно: трансформацii.
Проведене дослiдження шдтверджуе, що процеси апоптозу у хворих з глюмами та шшими пухлинами мозку реалiзуються не тшьки за участю CD95/CD95L-системи, а й з залученням шших сигнальних шляхГв апоптозу: рецепторно-незалежних (сигнальнi шляхи активацп каспази 9) i рецепторно-залежних (при активацп шших рецепторiв «регюна смерл клгтин» TNFR1, CAR1, DR3, DR4, DR5, p75-NGF). Причому, вплив цих сигнальних шляхГв апоптозу пов'язаний з
порушенням експресп гешв p53 i родини генiв bcl-2 та ¿х продукив, що контролюють рецепторно-неза-лежш сигнальнi шляхи апоптозу, або порушенням експресп рецепторiв «регюну смертi клгтин». На наш погляд, це питання потребуе подальшого вивчення з використанням сучасних методГв молекулярно: i генетично: дГагностики.
РГзна юльюсть клГтин у сташ апоптозу у зразках пухлин, на нашу думку, е вГдображенням штенсив-ност молекулярно-генетичних змш трансформацп пухлин головного мозку рГзного пстогенезу i рГзного ступеня злояюсностГ Досить значна юльюсть клгтин у сташ апоптозу у зразках пухлин пояснюеться ще й тим, що матерГал бюпсш аналГзували шсля мехашчного суспендування in vitro, тому отримаш даш можуть рГзнитися вГд даних, отриманих шд час аналГзу пстолопчних зрГзГв. Зокрема, найбшьша життездатшсть глюбластом та медулобластом, порГв-няно з глюмами II i III ступеня анаплазп свГдчить, що у пухлинах IV ступеня анаплазп клгтини мають бшьший пролГферативний потенцГал, що узгоджуеть-ся з юльюсними показниками експресп ядерного антигену Ю-67 [6].
Таким чином, на основГ отриманих даних та даних лГтератури можна припустити, що основними мехашзмами реалГзацп супресивного впливу пухлин мозку, особливо злояюсних, на клгтини Гмунно: сис-теми хворих е продукцГя розчинних проапоптогенних чинниюв та сигнали клгтин (CD95-лiганд-iндукова-ний сигнал), що справляють проапоптотичний вплив на клгтини-мГшеш (лГмфоцити).
Висновки 1. У хворих з глГальними пухлинами мозку юльюсть лГмфоципв, що перебувають у сташ апоптозу, бшьша, шж у здорових оыб.
2. Юльюсть Hoechst33342+ та CD95+ клгтин серед МНЛПК у хворих з глюмами мае однотипну тенденцш до зменшення у мГру збГльшення ступеня анаплазп глюми, тодГ як юльюсть PI+ клгтин, що визначае необоротний апоптоз, збГльшувалася у мГру збГльшення ступеня анаплазп глюми, що може свГдчити про вплив на лГмфоцити рГзних супре-сорних чинниюв залежно вГд ступеня злояюсносл пухлини.
3. Глюми IV ступеня анаплазп, порГвняно з глюмами II i III ступеня анаплазп, мГстили найменшу юльюсть клГтин у термшальнш стадп апоптозу (PI+), найменшу юльюсть CD95+ клгтин, що несуть рецептор готовност до апоптозу, i середню юльюсть клГтин у раншх, оборотних стадГях апоптозу (Hoechst33342+). КГлькГсть PI+ клгтин зменшувалася у мГру збГльшення ступеня злояюсносп глГоми.
4. У МНЛПК у хворих з медулобластомою вГдзначено шдвищений рГвень готовностГ до апоптозу та ступеня оборотних i необоротних змш, що визначаеться молекулярно-генетичними особливостями цих пухлин.
Список лггератури
1. Белушкина Н.Н., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза // Арх. патологии. — 2001. — Т.63, №1. — С.51-60.
2. Бережная Н.М. Роль клеток системы иммунитета в микроокружении опухоли. Клетки и цитокины — участники воспаления // Онкология. — 2009. — Т.11, №1. — С.6-16.
3. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Система иммунитета и рак: достижения и неудачи // Онкология. — 2003. — Т.5, №2.
— С.84-89.
4. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Иммунология злокачественного роста. — К.: Наук. думка, 2005. — 791 с.
5. Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Скитяк С.А., Гнедкова И.А. Исследование интенсивности апоптоза лимфоцитов периферической крови больных с глиомами и его корреляции с системой ИЛ-2 и ИФН-у // 1мунолопя та алерголопя. — 2003. — №4. — С.25-30.
6. Малишева Т.А., Черненко О.Г., Шамаев М.1. Прол1фе-ративна активтсть i апоптоз в нейроектодермальних пухлинах // Матерiали IV з'!зду нейрохiрургiв Укра!ни
— Дншропетровськ, 2008. — С.209-210.
7. Мамонтова Т.В., Кайдашев 1.П. Спонтанний апоптоз та експреия бiлкiв bcl-2 та Р53 мононуклеарних клiтин периферично! кровi у хворих на атотчну бронхiальну астму // Iмунологiя та алерголопя. — 2005. — №3.
— С.43-46.
8. Пальцев М.А., Демура С.А., Коган Е.А. и др. Мелкоклеточный рак и карциномы легких: морфология апоптоза и экспрессия биомолекулярных маркеров опухолевого роста // Арх. патологии. — 2000. —Т.62, №5. — С.11-17.
9. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека : Пособие для врачей-лаборантов / Сост.: Б.В. Пинегин и др. — М., 2001. — С.48-53.
10. Циклаури М.В., Гогебашвили Н.В. Нарушение функции иммунной системы и апоптоз лимфоцитов при травме, осложненной стафилококком // 1мунолопя та алерголопя. — 2003. — №4. — С.37-38.
11. Чумаков В.А., Качков И.А., Захаров А.В. и др. Имму-нодефицитные состояния при глиальных опухолях головного мозга // Аллергология и иммунология. — 2005.
— Т.6, №2. — С.278.
12. Чумаков В.А., Михайлов Р.В., Качков И.А. и др. Иммунодефицит, ассоциированный с глиобластомой // Аллергология и иммунология. — 2005. — Т.6, №2. — С.184.
13. Ярилин А.А., Никонова М.Ф., Ярилина А.А. и др. Апоп-тоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных // Мед. иммунология. — 2000. — Т.2, №1. — С.7-16.
14. Bodey B., Bodey B.Jr., Siegel S.E., Kaiser H.E. Immunocytochemical detection of leukocyte-assotiated and apoptosis-related antigen expression in childhood brain tumors // Crit. Review Oncol. Hematol. — 2001.
— V.39, N1-2. — P.3-16.
15. CD95-dependent T-cell killing by glioma cells expressing CD95 ligand: more on tumor immune escape, the CD95 counterattack, and the immune privilege of the brain // Intern. J. Experim. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol.
— 2007. — V.7, N5. — P.282-288.
16. Choi C., Benveniste E.N. Fas ligand/Fas system in the brain: regulator of immune and apoptotic responses // Brain Res.Reviews. — 2004. — V.44, N1. — P.65-81.
17. Cohen N., Betts D.R., Tavori U. et al. Karyotypic evolution pathways in medulloblastoma/primitive neuroectodermal tumor determined with a combination of spectral karyotyp-ing, G-banding, and fluorescence in situ hybridization // Cancer Gen. Cytogen. — 2004. — V.149, N1. — P.44-52.
18. Didenko V.V., Ngo H.N., Minchew C., Baskin D.S. Apopto-sis of T-lymphocytes invading glioblastomas multiforme: a possible tumor defense mechanism // J. Neurosurg.
— 2002. — V.96, N3. — P.580-584.
19. Dix A.R., Brooks W.H., Roszman T.L., Morford L.A. Immune defects observed in patients with primary malignant brain tumors // J. Neuroimmunol. — 1999. — V.100, N1-2. — P.216-232.
20. Eberhart C.G., Kaufman W.E., Tihan T., Burger P.C. Apop-tosis, neuronal maturation, and neurotrophin expression within medulloblastoma nodules // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 2001. — V.60, N5. — P.462-469.
21. Frank A.J., Hernan R., Hollander A. et al. The TP53-ARF tumor suppressor pathway is frequently disrupted in large/cell anaplastic medulloblastoma // Molec. Brain Res. — 2004. — V.121, N1-2. — P.137-140.
22. Giordana M.T., Duo D., Gasverde S. et al. MDM2 overexpression is assotiated with short survival in adults with medulloblastoma // Neurooncology. — 2002. — V.4, N2.
— P.115-122.
23. Kim J.Y.H., Nelson A.L., Algon S.A. et al. Medulloblastoma tumorigenesis diverges from cerebellar granule cell differentiation in patched heterozygous mice // Development. Biol. — 2003. — V.263, N1. — P.50-66.
24. Pingoud-Meier C., Lang D., Janss A.J. et al. Loss of caspase-8 protein expression correlates with unfavorable survival outcome in childhood medulloblastoma // Clin. Cancer Res. — 2003. — V.9, N17. — P.6401-6409.
25. Weller M., Schuster M., Pietsch T., Schabet M. CD95 ligand-induced apoptosis of human medulloblastoma cells // Cancer Lett. — 1998. — V.128, N2. — P.121-126.
26. Wischhusen J., Jung G., Radovanovic I. et al. Identification of CD70-mediated apoptosis of immune effector cells as a novel immune escape pathway of human glioblastoma // Cancer Res. — 2002. — V.62, N9. — P.2592-2599.
Досл1дження процеив апоптозу у мононуклеарних л1мфоцитах перифершно! кров1 та кл1тинах пухлин у хворих з глюмами головного мозку
Лкяний M.I., Любич Л.Д., Главацький О.Я., Лкяний О.М.
!нститут нейрохГрургп Гм. акад. А.П. Ромоданова АМН Украши, м. Кшв
Метою дослГдження було вивчення процеыв апоптозу у мононуклеарних лГмфоцитах (МНЛ) перифершно: кровГ (ПК) та зразках пухлин хворих з внутрГшньомозковими пухлинами. У хворих з глГальними пухлинами мозку, порГвняно з здоровими особами, виявлене збшьшення юлькосл лГмфоциив у сташ апоптозу. Кшьюсть Hoechst33342+ та CD95+ клгтин серед МНЛПК у хворих з глюмами зменшувалася у мГру збшьшення ступеня анаплазп глюми, юльюсть PI+ клгтин, що визначае необоротне виникнення апоптозу, збшьшувалася у мГру збшьшення ступеня анаплазп глюми, що може свГдчити про вплив на лГмфоцити рГзних супресорних чинниюв залежно вГд ступеня анаплазп пухлини. У глюмах IV ступеня анаплазп, порГвняно з глюмами II i III ступеня анаплазп, мГстилася найменша юльюсть клгтин у термшальнш стадп апоптозу (PI+), найменша юльюсть CD95+ клгтин, що несуть рецептор готовност до апоптозу, i середня юльюсть клгтин у раншх, оборотних стадГях апоптозу (Hoechst33342+). Кшьюсть PI+ клгтин зменшувалася у мГру збшьшення ступеня анаплазп глюми. У МНЛПК у хворих з медулобластомою вГдзначений шдвищений рГвень готовност до апоптозу та ступеня оборотних i необоротних змш, що визначаеться молекулярно-генетичними особливостями цих пухлин.
Ключов1 слова: апоптоз, мононуклеарт лгмфоцити перифершног Kpoei, глюми, медулобластоми.
Исследование процессов апоптоза в мононуклеарных лимфоцитах периферической крови и клетках опухолей у больных с глиомами головного мозга
Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Главацкий А.Я., Лисяный А.Н.
Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев
Целью исследования было изучение процессов апоптоза в мононуклеарных лимфоцитах (МНЛ) периферической крови (ПК) и образцах опухолей у больных с внутримозговыми опухолями. У больных с глиальными опухолями мозга, по сравнению с здоровыми лицами, выявлено увеличение количества лимфоцитов в состоянии апоптоза. Количество Hoechst33342+ и CD95+ клеток среди МНЛПК у больных с глиомами уменьшалась по мере увеличения степени злокачественности глиомы, тогда как содержание PI+ клеток, определяющее необратимый апоптоз, увеличивалось по мере увеличения степени анаплазии глиомы, что может свидетельствовать о влиянии на лимфоциты различных супрессорных агентов в зависимости от степени злокачественности опухоли. В глиомах IV степени анаплазии по сравнению с глиомами II и III степени анаплазии располагалось минимальное количество клеток в терминальной стадии апоптоза (PI+), минимальное количество CD95+ клеток, несущих рецептор готовности к апоптозу, среднее количество клеток, находящихся в ранних, обратимых стадиях апоптоза (Hoechst33342+). Количество PI+ клеток уменьшалось по мере увеличения степени злокачественности глиомы. В МНЛПК у больных с медуллобластомами отмечено повышение уровня готовности к апоптозу и степени обратимых и необратимых изменений, что определяется молекулярно-генетическими особенностями этих опухолей.
Ключевые слова: апоптоз, мононуклеарные лимфоциты периферической крови, глиомы, медуллобластомы.
The research of apoptosis in mononuclear lymphocytes of peripheral blood and tumor cells at patients with glial brain tumors Lisyany N.I., Lyubych L.D., Glavatsky A.Ya., Lisyany A.N.
Institute of neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov of Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv
The purpose of our research was apoptosis study in mononuclear lymphocytes of peripheral blood (MNLPB) and tumor samples from patients with intracranial brain tumors. Patients with glial tumors comparing with healthy persons demonstrated increased quantity of lymphocytes in state of apoptotic. Hoechst33342+ and CD95+ cell amount in MNLPB of patients with gliomas decreased as the anaplasia degree of glioma grew, so as PI+ cell level that determine irreversible apoptosis, increased as anaplasia degree of glioma grew, that may reflect different suppressors influence on lymphocytes in dependence of the tumor anaplasia degree. In gliomas of the IV anaplasia degree comparing to gliomas of II and III anaplasia degrees, the cells quantity in terminal stage of apoptosis (PI+) was minimal, quantity of CD95+ cells, carrying receptor for apoptosis readiness was also minimal, the level of cells at early, reversible stages of apoptosis was meddle (Hoechst33342+). The PI+ cells quantity decreased as anaplasia degree of glioma grew. In MNLPB of patients with medulloblastomas the level of readiness for apoptosis, convertible and irreversible lesions increased, that was conditioned by molecular-genetic features of these tumors.
Key words: apoptosis, mononuclear lymphocytes of peripheral blood, gliomas, medulloblastomas.
Комментарий
к статье Лисяного Н.И. и соавторов «Дослдження процес/'в апоптозу у мононуклеарних л/'мфоцитах перифершноТ кровi та кл'тинах пухлин у хворих з гл'юмами головного мозку»
Представленная работа посвящена чрезвычайно актуальному вопросу — исследованию активности апоптоза у больных с глиальными опухолями головного мозга.
Апоптоз — запрограммированная гибель клеток — является универсальным селективным методом самоуничтожения клеток в физиологических и патологических условиях и обеспечивает гомеостаз при обновлении тканей. Основное биологическое значение апоптоза заключается в регуляции количественного и качественного состава популяций клеток в организме. Благодаря апоптозу из тканей удаляются поврежденные и атипичные клетки, а также клетки, завершившие жизненный цикл. В настоящее время фундаментальная для биологии и медицины концепция апоптоза получила интенсивное развитие и отражает новые возможности в раскрытии сущности молекулярных механизмов канцерогенеза, а также лечении и контроле за динамикой течения опухолевого процесса.
Установлено, что нарушение процессов гибели клеток является важным звеном в патогенезе многих заболеваний человека, в том числе онкологических. В современной онкологии изучению процессов апоптоза уделяется исключительно большое внимание, поскольку при опухолях происходит нарушение равновесия между размножением и гибелью клеток. В настоящее время интенсивно разрабатываются различные способы индукции апоптоза в опухолях с использованием биологически активных соединений и химиопрепаратов, в том числе путем создания условий для преодоления блокирующих апоптоз влияний, что может способствовать повышению чувствительности клеток к терапевтическому воздействию, направленному на индукцию апоптоза.
Исследование апоптоза в опухолях мозга также является предметом пристального внимания, поскольку апоптоз играет важную регуляторную роль в кинетике этих опухолей.
Во вступительной части статьи приведены основные сведения о молекулярных и биохимических механизмах апоптоза и современных методах его выявления, а также обоснована актуальность изучения апоптоза при различных опухолях, включая опухоли головного мозга. По нашему мнению, необходимо было бы хотя бы коротко привести опубликованные в литературе результаты изучения апоптоза при опухолях головного мозга, в частности, глиальных, и отметить новизну предпринятых авторами исследований.
Материал работы достаточно обширный, включает исследование активности апоптоза лимфоцитов крови, полученных у 116 нейроонкологических больных, и образцов свежевыделенных клеток из опухолей мозга различной гистоструктуры и степени анаплазии тех же больных. Для определения уровня апоптоза в лимфоцитах и клетках опухолей авторы использовали современные иммуномолекулярные методы, характеризующие разные стороны нарушения апоптоза у больных с опухолями головного мозга различной гистоструктуры и степени злокачественности: определение клеток в состоянии апоптоза с помощью красителя Hoechst, цитофлуориметрический метод с помощью пропидиума йодида (Р1), выявление экспрессии антигена CD95 (FAS-рецептора).
В результате проведенных исследований получен целый ряд количественных показателей, которые тщательно проанализированы (с проведением статистической обработки) в группах: 20 больных с глиомами II степени анаплазии, 34 — III степени анаплазии, 23 — с глиобластомами (IV степень анаплазии), 39 больных с медуллобластомами.
По данным многофакторного сравнительного анализа результатов, полученных в каждой группе больных, авторам удалось выявить ряд важных закономерностей. Прежде всего, обнаружена отчетливая направленность к постепенному снижению активности апоптоза гибели как в лимфоцитах, так и в клетках опухолей по мере увеличения степени анаплазии исходных опухолей. Этот основополагающий вывод позволяет уточнить механизмы и различия степени иммуносупрессивного влияния опухоли на состояние клеточного иммунитета у нейроонкологических больных в зависимости от гистобиологических особенностей исходных опухолей. Кроме того, эти наблюдения в определенной степени раскрывают причины высокой скорости роста злокачественных глиом III—IV степени анаплазии по сравнению с более доброкачественными вариантами. Подтверждением этому является установление прямой корреляции с результатами иммуногистохимического определения индекса апоптоза в ткани глиом различной степени анаплазии, исследованных в лаборатории нейропатоморфологии Института. Аналогичная корреляция прослеживается также при сопоставлении полученных данных с уровнем пролиферативной активности в опухолях мозга однотипной структуры по показателю экспрессии ядерного антигена Ki-67.
В отличие от этого, по данным авторов, количество PI+ клеток, отражающих необратимую стадию апоптоза, прогрессивно увеличивается по мере увеличения степени анаплазии глиальных опухолей. Этот феномен авторы объясняют возможными различиями воздействия на лимфоциты супрессорных факторов при наличии опухолей различной степени злокачественности.
Большой интерес представляют результаты определения активности апоптоза в медуллобластомах, свидетельствующие о повышении уровня как готовности к апоптозу клеток опухолей, так и частоты необратимых изменений, в отличие от глиом II—IV степени анаплазии. По мнению авторов, это отражает особенности молекулярно-генетических и гистобиологических характеристик этих новообразований и может быть предметом специального обсуждения.
Таким образом, представленная для публикации статья имеет несомненную научную новизну, а также теоретическую и практическую ценность. Работа основана на исследовании достаточно большого фактического материала (лимфоциты периферической крови, опухоли мозга 116 больных) и имеет весомые перспективы для дальнейшей углубленной разработки данного научного направления. Показатели активности апоптоза нейроонкологических больных в последующем могут быть использованы для проведения мониторинга эффективности антибластической терапии и оценки тяжести клинического течения опухолевого процесса в динамике наблюдения. В связи с этим рекомендовано полученные разработки внедрить в практическую работу онкологических клиник Института.
В.М. Семенова, доктор мед. наук зав. лабораторией культивирования тканей Института нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины
