CC BY
22
Dali, K Blok B-07, Teknikokullar-Ankara, Turkey // Int. J. Agri. Biol. - 2006.-V. 8, №5. - Р. 626-229.
7.Kanchanapoom K. et al. in vitro Flowering from Cultured Nodal Explants of Rose (Rosa hybrida L.) // Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj. - 2009.-V. 37, №2. - P. 261-263.
8.Murashige T., Skoog F. A revized medium for rapid growth and bioassays whith tobacco tissue culture // Phisiologia plantarum. - 1962. - V. 15. - P. 437-497.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой О.В.
БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
К ВОПРОСУ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОБОПОДГОТОВКИ И МЕТОДА АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ
СТОЛОВОГО ВИНОГРАДА
Н.АППАЗОВА;
В.БОЙКО;
Е.А.СЛАСТЬЯ, кандидат биологических наук;
А.Э.МОДОНКАЕВА, кандидат сельскохозяйственных наук НИВиВ «Магарач», г. Ялта
Введение
Для оценки качества столового винограда определение содержания и состава фенольных соединений является одним из основных параметров. Фенольные соединения винограда определяют его вкусовые качества и внешний вид, однако основной особенностью этих веществ является их биологическая активность. Относительно биологической активности фенольных соединений винограда на протяжении последних трех десятилетий ведется активная полемика, начало которой положено явлением так называемого французского парадокса. Весомые аргументы в пользу ключевой роли фенольных соединений в проявлении биологической активности были получены лишь недавно благодаря исследованиям с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Важным компонентом химического состава столового винограда являются флавоноиды. Они играют доминирующую роль как в обмене веществ, так и в формировании диетических свойств, окраски и вкусовых достоинств винограда. Практически все флавоноиды обладают Р-витаминной и антиокислительной активностью, являясь важнейшим регулятором протекающих внутриклеточных свободнорадикальных процессов [1 -4]. Антоцианы, процианидины, катехины и флавонолы, характеризуясь небольшой молекулярной массой, являются наиболее важными флавоноидными соединениями виноградной ягоды и проявляют выраженную биологическую активность. Анализ этих групп соединений играет ключевую роль в определении качества столового винограда.
Многие годы основными методами выделения, очистки и концентрирования определяемых веществ были экстракция, осаждение, центрифугирование, бумажная, колоночная и тонкослойная хроматографии. Такая подготовка образцов является длительным и многоступенчатым процессом, требующим расхода большого количества особо чистых растворителей и реактивов, дополнительного оборудования и трудозатрат. С появлением оборудования для ВЭЖХ анализ фенольных соединений
винограда стал более доступным и занимает значительно меньше времени [5,6]. В нашей работе мы усовершенствовали методы подготовки проб и анализа фенольных соединений винограда с использованием ВЭЖХ и добились существенного прогресса в идентификации состава антоцианового комплекса ягод окрашенных сортов винограда.
Объекты и методы исследования
Для работы использовали столовый виноград технической зрелости сорта Молдова, собранный на коллекционном участке НИВиВ «Магарач» в с. Вилино в сентябре 2010 г.
Разделение производили на хроматографическом оборудовании фирмы «Shimadzu» (Япония), включающем спектрофотометрический детектор с диодной матрицей ультрафиолетового и видимого диапазонов, микроплунжерный насос с модулем градиента низкого давления, автосемплер и термостат колонок.
Наилучшие результаты разделения комплекса фенольных веществ были получены на колонке фирмы Macherey-Nagel (Германия) Nucleosil C18AB размером 250х3,0 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом с размером частиц 3 мкм и пористостью 100 Ä.
Для анализа антоцианового комплекса пробы готовили следующим образом. Кожицу виноградных ягод отделяли вручную и подсушивали ее фильтровальной бумагой, затем гомогенизировали при помощи мелющих шаров в планетарной микромельнице «Pulverisette 7» фирмы «Fritsch» (Германия). Далее гомогенизат экстрагировали смесью 50% метанола с 0,5% соляной кислоты. Экстракт центрифугировали Eppendorf 5702 R (Германия) при 15 тыс. об. мин, супернатант использовали для хроматографического анализа. Для количественной оценки содержания анализируемых фенольных соединений в виноградной ягоде определяли массовую долю кожицы в ягоде, ее сухой вес и рассчитывали коэффициент разбавления при подготовке пробы.
В процессе оптимизации процесса разделения антоциановых соединений была подобрана система растворителей, базирующаяся на растворе А - трифторуксусной кислоты в воде с массовой концентрацией 0,3% и растворе Б - трифторуксусной кислоты с массовой концентрацией 0,3% в смеси равных пропорций метанола с ацетонитрилом.
Для аналитического разделения использовали линейный градиент от 5% раствора Б на 5-й минуте до 35% раствора Б к 70-й минуте. Детектирование антоцианов проводили по поглощению при длине волны 525 нм.
Результаты и обсуждение
Результаты анализа экстракта кожицы винограда сорта Молдова, проведенного по оптимизированной методике, показаны на хроматограмме, изображенной на рисунке. Основные пики на хроматограмме соответствуют моногликозидам дельфи-нидина (Rt 42,0), цианидина (Rt 43,5), петунидина (Rt 45,5), пеонидина (Rt 49,3) и мальвинидина (Rt 50,5). С большей задержкой во времени выходят пики ацилиро-ванных производных антоцианов, основные из которых мальвидин-3-О-(6'-О-ацетил-гликозид) Rt 62,0 и мальвидин-3-О-(6'-О-п-кумароил-гликозид) Rt 65,7. Дигликозиды антоцианов имеют меньшие времена удерживания и выходят в промежутке Rt 36,0 -46,5 мин. Ранее при анализе антоцианового комплекса винограда исследователями были получены лишь усредненные характеристики содержания антоциановых пигментов по группам - моногликозиды, дигликозиды и ацилированные производные. Оптимизированная методика открывает возможности определения массовой концентрации отдельных антоцианов, что является особенно актуальным в связи с
проблемой оценки сортовой чистоты виноградников. Мальвидин-3,5-дигликозид (Rt 46,5) является веществом маркирующим виноград гибридного происхождения, использование которого в виноделии ограничивается европейскими директивами.
mAU_
2751520nm,4nm (1.00)
32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 45.0 47.5 50.0 52.5 55.0 57.5 60.0 62.5 65.0 67.5 min
Рис. Хроматограмма комплекса антоцианов сорта винограда Молдова
Выводы
1. Подобраны оптимальные условия для проведения анализа состава антоцианового комплекса кожицы виноградной ягоды методом ВЭЖХ. Достигнута высокая селективность пиков и эффективность разделения, достаточная для определения массовой концентрации отдельных веществ по градуировочной характеристике.
2. Предложенная методика анализа пигментного комплекса темноокрашенных ягод винограда позволяет достоверно определять сортовую чистоту виноградника по пику мальвидин-3,5 -дигликозида.
3. Достигнут прогресс в определении качественных показателей пищевой и биологической ценности столового винограда.
Список литературы
1. Кретович В.Л. Основы биохимии растений. - М.: Высшая школа, 1971. - 464 с.
2. Скалецька Л.Ф., Подпрятов r.I. Бiохiмiя nroAiB та овочiв: Навч. поабн. - К., 1999. - 159 с.
3. Кишковский З.Н., Скурихин И.М. Химия вина. - М.: Пищевая промышленность, 1976. - 310 с.
4. Дженеев С.Ю., Смирнов К.В. Производство винограда, кишмиша и изюма. - М.: Колос, 1992. - 173 с.
5. Snyder L.R., Principles of Adsorption Chromatography. - M. Dekker N-Y., 1968.
6. Экспресс-метод полуколичественного определения содержания мальвидин-3,5-дигликозида в кожице винограда, сусле и молодых красных винах / Сластья Е.А.,
175-
150-
125-
100-
75
50
25
Жилякова Т.А., Аристова Н.И., Ткачев И.Ф., Пилипенко Д.С. // Виноделие и виноградарство. - 2005. - № 2.- С. 26-27.
Рекомендовано к печати к.б.н. Палий А.Е.
ПРОДУКЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КВАЗИНЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРЫ PORPHYRIDIUMPURPUREUM (BORY) ROSS ПРИ ЧАСТИЧНОМ ВОЗВРАТЕ СРЕДЫ
И.Н.ГУДВИЛОВИЧ, кандидат биологических наук;
С.Ю.ГОРБУНОВА, кандидат биологических наук; А.С.ЛЕЛЕКОВ, кандидат биологических наук; А.Б.БОРОВКОВ Институт биологии южных морей НАН Украины, г. Севастополь
Введение
Красная микроводоросль Porphyridium purpureum вызывает большой интерес у исследователей, так как является источником разнообразных биологически ценных веществ (фикобилипротеинов, внеклеточных сульфополисахаридов, ненасыщенных жирных кислот и др.) [9, 10, 12]. Так, пигмент В-фикоэритрин, относящийся к классу фикобилипротеинов, имеет широкие перспективы использования в пищевой, косметической и медицинской промышленности. Это обусловлено белковой природой, нетоксичностью данного пигмента, а также редко встречающимся оттенком красного цвета и ярко выраженной оранжевой флуоресценцией [3, 8, 11].
Культивирование P. purpureum в квазинепрерывном режиме способствует накоплению данного пигмента [1, 12], однако предполагает ежесуточный отбор и слив значительных количеств культуральной среды.
В связи с этим поставлена задача оценить возможность повторного использования культуральной среды при выращивании микроводоросли P. purpureum в квазинепрерывном режиме для снижения расходования химических реактивов, объемов сливаемой среды при сохранении или незначительном снижении продуктивности культуры.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования являлась красная микроводоросль Porphyridium purpureum (Bory) Ross (синоним Porphyridium cruentum Näg.) (штамм IBSS-70) из коллекции культур ИнБЮМ НАН Украины. Установка для культивирования состояла из пяти стеклянных фотобиореакторов плоскопараллельного типа объемом 6 л, осветителя - лампы ДРЛ-700, термостабилизирующей и газораспределительной систем. В процессе выращивания культура непрерывно снабжалась газовоздушной смесью с концентрацией углекислоты 2-3%, рН культуральной среды - 6-7 единиц. Освещенность рабочей поверхности культиваторов в среднем составляла 80 Вт/м2, температура - 26-28°С. Водоросли выращивали на питательной среде Тренкеншу [6].
Культивирование осуществляли в квазинепрерывном режиме с удельной скоростью протока среды 0,2 сут-1. Культиватор № 1 являлся контрольным, обмен в нем производили средой Тренкеншу с удвоенной концентрацией минерального азота и фосфора. На первом этапе эксперимента при обмене в культиваторах № 2-5 часть среды Тренкеншу заменяли супернатантом, полученным при центрифугировании соответствующего опытного варианта: № 2 - 20%, № 3 - 40%, № 4 - 60%, № 5 - 80%. На втором этапе (с 14 по 19 сут) режим культивирования был сохранен, но после осуществления обмена проводились допол-
