CC BY
28
Жилякова Т.А., Аристова Н.И., Ткачев И.Ф., Пилипенко Д.С. // Виноделие и виноградарство. - 2005. - № 2.- С. 26-27.
Рекомендовано к печати к.б.н. Палий А.Е.
ПРОДУКЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КВАЗИНЕПРЕРЫВНОЙ КУЛЬТУРЫ PORPHYRIDIUMPURPUREUM (BORY) ROSS ПРИ ЧАСТИЧНОМ ВОЗВРАТЕ СРЕДЫ
И.Н.ГУДВИЛОВИЧ, кандидат биологических наук;
С.Ю.ГОРБУНОВА, кандидат биологических наук; А.С.ЛЕЛЕКОВ, кандидат биологических наук; А.Б.БОРОВКОВ Институт биологии южных морей НАН Украины, г. Севастополь
Введение
Красная микроводоросль Porphyridium purpureum вызывает большой интерес у исследователей, так как является источником разнообразных биологически ценных веществ (фикобилипротеинов, внеклеточных сульфополисахаридов, ненасыщенных жирных кислот и др.) [9, 10, 12]. Так, пигмент В-фикоэритрин, относящийся к классу фикобилипротеинов, имеет широкие перспективы использования в пищевой, косметической и медицинской промышленности. Это обусловлено белковой природой, нетоксичностью данного пигмента, а также редко встречающимся оттенком красного цвета и ярко выраженной оранжевой флуоресценцией [3, 8, 11].
Культивирование P. purpureum в квазинепрерывном режиме способствует накоплению данного пигмента [1, 12], однако предполагает ежесуточный отбор и слив значительных количеств культуральной среды.
В связи с этим поставлена задача оценить возможность повторного использования культуральной среды при выращивании микроводоросли P. purpureum в квазинепрерывном режиме для снижения расходования химических реактивов, объемов сливаемой среды при сохранении или незначительном снижении продуктивности культуры.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования являлась красная микроводоросль Porphyridium purpureum (Bory) Ross (синоним Porphyridium cruentum Näg.) (штамм IBSS-70) из коллекции культур ИнБЮМ НАН Украины. Установка для культивирования состояла из пяти стеклянных фотобиореакторов плоскопараллельного типа объемом 6 л, осветителя - лампы ДРЛ-700, термостабилизирующей и газораспределительной систем. В процессе выращивания культура непрерывно снабжалась газовоздушной смесью с концентрацией углекислоты 2-3%, рН культуральной среды - 6-7 единиц. Освещенность рабочей поверхности культиваторов в среднем составляла 80 Вт/м2, температура - 26-28°С. Водоросли выращивали на питательной среде Тренкеншу [6].
Культивирование осуществляли в квазинепрерывном режиме с удельной скоростью протока среды 0,2 сут-1. Культиватор № 1 являлся контрольным, обмен в нем производили средой Тренкеншу с удвоенной концентрацией минерального азота и фосфора. На первом этапе эксперимента при обмене в культиваторах № 2-5 часть среды Тренкеншу заменяли супернатантом, полученным при центрифугировании соответствующего опытного варианта: № 2 - 20%, № 3 - 40%, № 4 - 60%, № 5 - 80%. На втором этапе (с 14 по 19 сут) режим культивирования был сохранен, но после осуществления обмена проводились допол-
нительные измерения концентрации минерального азота и фосфора. После этого содержание данных биогенных элементов в культиваторах № 2-5 корректировалось до уровня контрольного.
Рост культур регистрировали фотометрическим методом по оптической плотности культуры на длине волны 750 нм в кюветах с толщиной 0,5 см на КФК-2. Переход от единиц оптической плотности (D750) к величине абсолютно сухой массы (АСМ), осуществляли посредством эмпирического коэффициента: к = 0,68 гл-1-ед.опт.пл-1, ACB = к х D750 [2]. Содержание нитратного азота в среде определяли потенциометрическим методом с помощью иономера И-160М, минерального фосфора - по методу Морфи-Райли [4, 7]. Концентрацию В-фикоэритрина в водном экстракте определяли по [5].
Результаты и обсуждение
На протяжении двух этапов эксперимента динамика плотности культуры в первых трех вариантах (контроль, возврат культуральной среды 20 и 40%) статистически значимо не отличалась, причем плотность культуры в среднем составляла для первого этапа 2,3-2,5 г АСМ • л-1, для второго - 1,2-1,4 г АСМ- л-1 (рис. 1).
и <
-о
а
^
н -о
[у
.0
н
о я н о
ч -
4 -|
3 -
2-
1 -
0
I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 1 I 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Время культивирования, сутки
Рис. 1. Динамика плотности квазинепрерывной культуры P. purpureum: пунктирная линия отделяет первый и второй этапы эксперимента; • - контроль, о - возврат среды 20%, ▲— возврат среды 40%, ■ - возврат среды 60%, ♦ -
возврат среды 80%
Такую разницу по плотности культуры при неизменных внешних условиях выращивания можно объяснить понижением по техническим причинам концентрации углекислого газа в подаваемой газовоздушной смеси.
Для вариантов № 4-5 (возврат культуральной среды 60 и 80%) на первом этапе эксперимента наблюдалось лимитирование роста культуры P. purpureum (рис. 1) биогенными элементами (рис. 2). Для этих вариантов установлено статистически значимое снижение значений плотности культуры в два раза. На втором этапе отсутствовало лимитирование роста исследуемой микроводоросли минеральным
азотом и фосфором (рис. 2), поэтому плотность культуры в пяти вариантах отличалась незначительно.
300 -1
250-
«
о 200
го <Я
Я 150 а <я а
100 -
50-
0
«
а
о &
и
о &
Я S
я <я а н s
я х о
И
70 60 50 40 30 20 10 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Время культивирования, сутки
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Время культивирования, сутки
Рис. 2. Динамика минерального азота (А) и фосфора (В) в культуральной среде: пунктирная линия отделяет первый и второй этапы культивирования; • -контроль, о - возврат среды 20%, ▲— возврат среды 40%, ■ - возврат среды 60%,
♦ - возврат среды 80%
Таким образом, экспериментально показано отсутствие выраженного влияния увеличения доли возвращаемой культуральной среды на плотность квазинепрерывной культуры P. purpureum при отсутствии лимитирования по минеральным элементам питания.
Для оценки влияния количества возвращаемой культуральной среды на накопление В-фикоэритрина было определено его среднее содержание в клетках за последние трое суток культивирования на обоих этапах эксперимента (рис. 3). С увеличением доли культуральной среды (от 0 до 80%), возвращаемой в культиватор при обмене, и пропорциональном снижении количеств вносимых биогенных элементов относительное содержание В-фикоэритрина в клетках P. purpureum на первом этапе снижается в 7,3 раза (от 9,6 до 1,3% АСМ). На втором этапе, при ежесуточной корректировке концентрации биогенных элементов до уровня контрольного варианта, относительное содержание В-фикоэритрина с увеличением доли среды, возвращаемой в культиваторы, снижалось в 1,7 раза (от 9,6 до 5,7% АСМ).
Рассчитана продуктивность культуры P. purpureum по биомассе и В-фикоэритрину на 1-м и 2-м этапах эксперимента (рис. 4). При увеличении доли возвращаемой культуральной среды (пропорциональном уменьшении количеств вносимых биогенных элементов) продуктивность культуры снижается, причем для В-фикоэритрина - в 8,4 раза (от 25 до 3 мг-л-1-сут-1), а для биомассы - в 2 раза (от 0,5 до 0,24 г-л-1-сут-1). Следовательно, режим, заданный на первом этапе эксперимента, не может быть рекомендован для получения биомассы P. purpureum с повышенным содержанием В-фикоэритрина.
5 12
и
10
о4
гл 8
е
со 6
а
s 4
S
<я
И
а v 2
ч
о
и 0
ЕЮ 1 этап □ 2 этап
i
Л
pfe
&
0
80
20 40 60 Доля возвращаемой среды, %
Рис. 3. Относительное содержание В-фикоэритрина в клетках P. purpureum на первом и втором этапах культивирования
ч « 1,2
0,8 -
0,4 -
Ш1 этап □ 2 этап
й А
üfc
0 20 40 60 80
Доля возвращаемой среды, %
Ч 1 2
щ 1,2 ='
Н о
Л 0,8
н
и
о =
ва
Н 0,4
а ^
ч
о &
К 0
В ОН 1 этап
□ 2 этап
Л
тЬ
rb
1
||
0 20 40 60 80
Доля возвращаемой среды, %
0
Рис. 4. Продуктивность квазинепрерывной культуры P. purpureum по биомассе (А) и В-фикоэритрину (В) на первом и втором этапах эксперимента (нормированная
по контрольному варианту)
На втором этапе эксперимента продуктивность культуры P. purpureum по В-фикоэритрину уменьшается в среднем в 2 раза, причем при увеличении доли среды от 20 до 60% снижение продуктивности по сравнению с контрольным вариантом составляет 25%. При этих же условиях продуктивность P. purpureum по биомассе статистически значимо не изменяется.
Выводы
Экспериментальные исследования динамики плотности культуры P. purpureum и содержания В-фикоэритрина показали принципиальную возможность повторного использования культуральной среды, изымаемой в процессе квазинепрерывного культивирования.
Экспериментально показано отсутствие выраженного влияния увеличения количества возвращаемой среды на плотность и продуктивность квазинепрерывной культуры P. purpureum при отсутствии лимитирования по минеральным элементам питания. В этих же условиях продуктивность культуры P. purpureum по В-фико-эритрину с увеличением доли возвращаемой среды от 0 до 60% снижается на 25%.
Список литературы
1. Гудвилович И.Н., Лелеков А.С. Влияние различных концентраций минерального азота в среде на содержание В-фикоэритрина в клетках Porphyridium cruentum Nag. // Экология моря. - 2008. - Вып. 76. - С. 45-48.
2. Лелеков А.С. Моделирование роста и биосинтеза морских микроводорослей в квазинепрерывной культуре: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук / ИнБЮМ НАНУ. -Севастополь, 2009. - 26 с.
3. Лось С.И. Биохимические основы получения фикоэритрина из морских водорослей // Альгология. - 2008. - Т. 18, № 4. - С. 375-385.
4. Методы гидрохимических исследований основных биогенных элементов - М.: Изд-во ВНИРО, 1988. - 25 с.
5. Стадничук И.Н. Фикобилипротеины. Биологическая химия. - М.: Мир, 1990. -196 c.
6. Тренкеншу Р.П. Ростовые и фотоэнергетические характеристики морских микроводорослей в плотной культуре: Автореф. дис. ... канд. биол. наук / Ин-т физ. АН СССР. -Красноярск, 1984. - 28 с.
7. Уильямс У.Дж. Определение анионов. - М.: Химия, 1982. - С.134-136.
8. Arad S., Yaron A. Natural pigments from red microalgae for use in foods and cosmetics // Trends Food Sci. Technol. - 1992. - Vol. 3. - Р. 92-97.
9. Biomass nutrient profiles of the microalga Porphyridium cruentum / M.R.Fuentes, G.A.Fernandez, J.S.Perez et al. // Food Chem. - 2000. - Vol. 70, №. 3. - P. 345-353.
10. Culture media optimization for growth and phycoerythrin production from Porphyridium purpureum / S.Kathiresan, R.Sarada, S.Bhattacharya et al. // Biotech. and Bioengin. - 2006. -Vol. 96. - P. 456-463.
11. SQDGs from Porphyridium cruentum inhibit the proliferation of human cancer cell-lines / Dumay J., Berge J.P., Debiton E. et al. // Marine biotechnology: an overview of leading fields. 9th ESMB meeting: European Society for Marine Biotechnology meeting, Nantes, 12 - 14 May 2002. - Actes Colloq. IFREMER. - 2003. - № 36. - P. 17-23.
12. Renewal rate of semicontinuous cultures of the microalga Porphyridium cruentum modifies phycoerythrin, exopolysaccharide and fatty acid productivity / J. Fabregas, D. Garcia, E. Morales et al. // J. Ferment. Bioeng. - 1998. - Vol. 86, № 5. - P. 477 -481.
Рекомендовано к печати д.б.н. Рябушко Л.И.
