CC BY
15
М. Г. Киченко, Л. Е. Корш и Н. Г. Киченкс
К вопросу об исследовании воды на присутствие кишечной палочки
Из Института общей и коммунальной гигиены АМН СССР
Существующие методы бактериологического исследования питьевой воды, принятые ГОСТ 5216-50, несмотря на простоту выполнения, все же громоздки из-за необходимости идентификации большого числа выделяющихся культур и длительны.
Некоторые исследователи при определении коли-титра воды период накопления продолжают до 48 часов, считая, что такой >срок гарантирует более точное обнаружение в воде кишечной палочки.
Наши наблюдения за фазами роста кишечной палочки в среде накопления показали, что при раннем размножении кишечной палочки происходит и раннее угнетение ее, а иногда и отмирание. В одних случаях причиной раннего отмирания или угнетения роста кишечной палочки-является сама кишечная палочка, вызывающая значительное снижение рН среды.
В других случаях кишечная палочка отмирает под влиянием антагонистического действия сапрофитов, развивающихся в посеве позже кишечной палочки. В обоих случаях оценка качества исследуемой воды будет завышенной.
Для ускорения определения коли-титра питьевой воды срок накопления мы укорачиваем до предельно допустимого (не ранее 7 часов). Пересев на твердую питательную среду делаем из всего титрационного ряда независимо от наличия признаков роста. Второй и третий этап-стандартного анализа заменяем одним пересевом на элективную среду с лактозой и глюкозой.
При таком ходе анализа среда', применяемая во втором этапе, должна обладать высокой элективностью, чувствительностью и демонстративностью роста ^а ней кишечной палочки. Кроме того, с экономической точки зрения среда не должна быть сложнее среды, рекомендуемой стандартом (среда Эндо).
Для изготовления предложенной нами диференциальной среды (РДА) берется мясо-пептонный агар неплотной консистенции с рН= 7,4—7,6. К нему добавляется 1% лактозы и 0,1% глюкозы. Для повышения избирательности к среде добавляется 5% желчи. В качестве ингибитора и индикатора к 1 л агара добавляют 2 мл свежеприготовленного (не свыше одного месяца хранения) 5% спиртового раствора розо-ловой кислоты и 2 мл 1—2% спиртового раствора бромтимолблау. Бром-тимолблау, а также желчь не являются обязательными компонентами этой среды, которая и без добавления их работает достаточно четко.
Среда РДА, правильно изготовленная по полной прописи, имеет коричнево-красный цвет. Без добавления бромтимолблау эта среда имеет розовую окраску. Обе среды под влиянием кислоты меняют окраску в желтый цвет, а под влиянием щелочи окраска их становится более красной.
Готовую среду разливают в узкие пробирки, лучше серологические, высоким столбиком и стерилизуют дробно или при 0,5 атм. в течение 10—15 минут. После стерилизации среду можно хранить свыше года. Перед употреблением среду РДА расплавляют, а затем скашивают так, чтобы получился высокий столбик и скошенная верхушка. Материал для пересева берут с поверхности среды накопления петлей с крупным ушком и переносят в пробирку со средой РДА. При этом делают укол петлей в столбик с проведением штриха по скошенной верхушке при вынимании петли.
Культуры типичных кишечных палочек, расщепляющие глюкозу я лактозу с образованием кислоты, дают желтые колонии или желтый рост по штриху ¡и среду в столбике и верхушке изменяют в желтый цвет. Образование газа этими культурам« отмечается по разрывам среды в столбике in по образованию пены в конденсационной жидкости.
Культуры лактозодефективных представителей бактерий кишечной группы, расщепляющие глюкозу до кислоты, дают серые или бесцветные с темносерым центром колонии и изменяют цвет среды только в столбике. Цвет среды в скошенной верхушке не меняется или слегка краснеет, что указывает на повышение pH среды. Рост этих культур по штриху на среде с бромиимолблау серый, а на среде без добавления бромтимолблау бесцветный или слегка розовый. Газообразование отмечается также по разрывам среды в столбике и по образованию пены в конденсационной жидкости.
Влияние отдельных компонентов среды РДА на рост микробов кишечной группы определялось одновременно с выяснением влияния компонентов среды Эндо, рекомендуемой стандартом.
С этой целью из мясо-пептонного агара готовили ряд сред, содержащих по одному из компонентов сравниваемых сред, и среды, приготовленные по полной пропиаи. На мясо-пептонный агар и на все образцы .испытуемых сред делали одновременно при помощи мембранных фильтров посев кишечной палочки, паракишечной и грамположительной палочки и стафилококка, выделенных из воды. При сопоставлении роста этих культур на испытуемых образцах сред с ростом на мясо-пептонном агаре оказалось, что некоторые компоненты, добавленные к мясо-пептон-ному агару отдельно, тормозят рост не только грамположительной микрофлоры, но и кишечной палочки. Особенно сильно тормозит рост кишечной палочки основной фуксин. Однако рост кишечной и паракишечной палочки, полученный на обеих средах, приготовленных по полной пропиои, при сравнении оказался более обильным, чем на средах только с одним из компонентов, и мало различался между собой.
Этим опытом было установлено, что розоловый агар не обладает большей токсичностью в отношении кишечной палочки, чем среда Эндо.
Дальнейшее испытание чувствительности обеих сред производилось по следующей методике.
Глюкозо-пептонная накопительная среда заражалась суточной бульонной культурой (1 петля на 10 мл среды) различных бактерий, выделенных из воды и воздуха Накопление производилось в одной серии опытов при температуре 37°, а в другой — при 42°. Через 7, 10 и 24 часа накопления делали пересев параллельно на обе испытуемые твердые среды. Для контроля на наличие в среде накопления жизнеспособных бактерий одновременно делали пересев на мясо-пептонный агар.
Среду Эндо готовили непосредственно перед пересевом. К ней добавляли, помимо основных компонентов, 0,1% глюкозы и разливали в пробирки высоким столбиком, после чего скашивали так же, как среду РДА, приготовленную заранее.
Было установлено, что РДА не меняется от пребывания в термостате при 37° и 42°, тогда как в среде Эндо только под влиянием хранения в термостате при 37° и особенно при 42° (без посева) происходит вооста-новление фуксина, на что указывает изменение цвета среды в красный.
Чувствительность среды РДА и среды Эндо в отношении роста на них микробов группы кишечной палочки была испытана на 30 штаммах, свежевыделенных из воды водохранилища.
По биохимическим свойствам культуры были разбиты на 4 группы.
Первая группа состояла из 12 штаммов типичной кишечной палочки. В нее вошло 10 штаммов В. coli commune и 2 штамма В. coli com-munior.
Вторая группа состояла из 8 штаммов цитратусваивающих вариантов кишечной палочки: 5 штаммов В. coli citrovorum и 3 штамма В. coli aerogenes.
Третья группа состояла из 6 штаммов атипичных для паракишеч-ных палочек, не расщепляющих лактозы.
Четвертая группа состояла из 4 штаммов, не давших газа при проверке на коротком пестром ряде. Штаммы этой группы были охарактеризованы как В. coli anaerogenes. В дальнейшем мы будем именовать их безгазовые.
Чувствительность испытуемых сред РДА и Эндо определялась по характеру изменения цвета и по наличию газа.
Среда РДА под влиянием роста на ней различных представителей микробов группы кишечной палочки давала характерные изменения цвета; растущие на ней культуры расщепляли до кислоты глюкозу и лактозу (вся среда желтая) или только глюкозу (пожелтение среды только в столбике).
Среда Эндо независимо от свойств бактериальной культуры, которая на нее была засеяна, в столбике оставалась неизмененной по окраске, тогда как ее скошенная верхушка почти во всех случаях окрашивалась в красный цвет. „..
Минкевич и друпие авторы придают большое значение способности кишечной палочки, выделенной из воды, расщеплять глюкозу до образования газа. Этот тест вошел и в ГОСТ 5216-50 как «вторичная бродильная проба». В нем свойство выделенной культуры давать «вторичное брожение» является основным признаком. Поэтому нами было обращено особое внимание на способность микробов группы кишечной палочюи расщеплять глюкозу на сравниваемых средах до образования газа.
Проверка этого теста на вышеописанных выделенных из воды 30 штаммах микробов группы кишечной палочки показала, что свойство расщеплять глюкозу до образования газа не является постоянным, присущим данному штамму при различных условиях его существования. Даже в группе типичной кишечной палочши из 12 штаммов только 3 штамма постоянно были способны вторично расщеплять глюкозу до газа после накопления при 37° и 42°, что обнаруживалось в пересевах, сделанных на обе среды через 7, 10 и 24 часа инкубации.
Также и в группе цитратуоваивающих кишечных палочек из 8 штаммов только 3 штамма были способны давать вторичное газообразование на обеих средах в течение суточного накопления при 37" и при 42°.
Из 6 штаммов группы паракишечных палочек только 2 штамма обладали спо собностью давать вторичное газообразование на обеих средах через 24 часа при 42". Из них один штамм обладал этим свойством и после накопления при 37°, а второй не был испытан при этой температуре. Остальные штаммы основных трех групп в отношении вторичного газообразования отличались индивидуальной вариа-бильностью с широким диапазоном. Так, например, после накопления в течение 7 часов при 37° вторичное газообразование было обнаружено у всех штаммов первой группы и у большинства штаммов второй и третьей группы. Но в пересевах, сделанных через 10 часов накопления при той же температуре, некоторые штаммы, ранее дававшие газ, не обнаруживали его «а одной или на обеих испытуемых средах, в то же время штаммы, не дававшие газа после 7 часов накопления, гталн обнаруживать его в пересевах, сделанных через 10 часов накопления.
После 24 часов накопления при 37° также наблюдалась у одних штаммов потеря способности к вторичному газообразованию, а у других было обнаружено приобретение или восстановление этого свойства.
Накопление, проведенное при 42°, выявило ту же вариабильность в отношения способности к вторичному газообразованию у штаммов типичных, цитратусваиваю-щих и лактозодефективных кишечных палочек, что и после накопления при 37°. Однако после накопления при 42° большее число штаммов обладало способностью к вторичному газообразованию, и к тому же газообразование было более интенсивным.
Повидимому, на вариабильность в отношении газообразования у отдельных штаммов микробов группы кишечной палочки оказывает влияние температура накопления, продолжительность накопления, а также среда выделения. При этом оказывает влияние не каждый фактор сам по себе, а общая совокупность всех внешних факторов и свойства самой культуры. На это указывает то обстоятельство, что только небольшое число штаммов было стабильным и при всех условиях они
проявили себя одинаково. Большинство же штаммов всех трех групп были неустойчивы и при повторении опыта с ними получались другие результаты.
Группа слабо активных кишечных палочек, расщепляющих при проверке глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу и мальтозу до кислоты без газообразования, состояла из четырех штаммов. Все штаммы этой группы, так же как и штаммы первых трех групп, отличались индивидуальными особенностями биохимических свойств и оказались способными доводить расщепление глюкозы до газообразования на одной или на обеих испытуемых средах в разные сроки накопления.
Таким образом, выяснилось, что типичные кишечные палочки, обладая способностью к вторичному газообразованию после 7 часов накопления, проводимого при 37° или 42°, в более поздние сроки теряли эту способность при выделении на одной или на обеих сравниваемых твердых средах. Некоторые же штаммы цитратусваиваюших кишечных палочек, не дававшие вторичного газообразования после 7 и 10 часов накопления, обнаружили эту способность в пересевах через 24 часа накопления.
Микробы, отнесенные по биохимическим свойствам к группе лактозодефективных и безгазовых кишечных палочек, также отличались неустойчивостью этого свойства в пересевах на одной или на обеих сравниваемых средах.
Суммирование полученных данных по числу обнаруженных положительных случаев вторичного газообразования без учета индивидуального поведения каждого штамма позволило сделать следующее обобщение.
В опыте, проведенном с накоплением при 37°, отмечается, что после 7 часов накопления вторичное брожение дают все 12 штаммов типичной кишечной палочки, тогда как у цитратусваиваюших и у лактозодефек-тивных штаммов способность к вторичному газообразованию отсутствует у 2—3 штаммов.
Безгазовые штаммы оказались неспособными к вторичному газообразованию после 7 часов накопления при 37°. Но дальнейшее накопление в жидкой среде оказало стимулирующее влияние на их биохимическую 'активность.
После накопления кишечной палочки, проведенного при 37° в течение 10 часов, потеряли способность к вторичному газообразованию 2 штамма из группы типичной кишечной палочки и 2 штамма из группы цитратусваивающих кишечных палочек, из группы лактозодефективных у 3 штаммов не было обнаружено вторичного газообразования только на среде РДА, в группе безгазовых кишечных палочек не дали вторичного газообразования на среде РДА 3 штамма, а на среде Эндо все 4 штамма.
После 24 часов накопления вторичное газообразование не обнаруживалось на обеих избирательных средах у 2 штаммов типичной кишечной палочки, у одного штамма из группы цитратусваивающих и у 3 штаммов из группы безгазовых кишечных палочек. Из группы лактозодефективных кишечных палочек вторичное газообразование не дали 2 штамма на среде РДА и 3 штамма на среде Эндо.
Накопление кишечной палочки, проведенное при 42°, повышает способность к вторичному газообразованию как у типичных штаммов кишечной палочки, так и у безгазовых штаммов. При этом было обнаружено вторичное газообразование после 7 часов накопления на среде Эндо у одного безгазового штамма, а на среде РДА — у 4 штаммов. При продолжении накопления до 10 и 24 часов при 42° наблюдалась потеря способности к вторичному газообразованию у безгазовых штаммов и у некоторых типичных кишечных палочек, лактозодефективных а цитратусваивающих кишечных палочек. При этом, хотя и в небольшом числе 'случаев, более частое газообразование обнаруживалось на среде
РДА, а не на среде Эндо. Однако отдать предпочтение одной из этих сред только по признаку вторичного газообразования было бы неверно, так как в воде 'имеется значительное количество сапрофитов, могущих при некоторых условиях дать рост на избирательных средах и расщепить глюкозу до газа. Поэтому дополнительно были поставлены опыты по выяснению ингибирующих свойств среды РДА и среды Эндо.
С этой целью на глюкозо-пептонную среду накопления делали посев по одной петле суточной бульонной культуры сапрофитов, выделенных из воздуха. В одной серии опытов наблюдение было проведено при 37°. Для работы было взято 48 штаммов банальных сапрофитов, встречающихся как в воздухе, так и в воде. Все они были грамположительные, из них 29 культур принадлежали к группе спороносных палочек и 19 кокковых форм. Пересевы из среды накопления делали на мясо-пеп-тонный агар и на обе испытуемые среды через 7, 10 и 24 часа инкубации.
Оказалось, что глюкозо-пептонная среда для некоторых сапрофитов является неблагоприятной. Так, из 48 штаммов через 7 и 10 часов накопления на мясо-пеп тонном агаре не дали роста 6 штаммов, а через 24 часа накопления —2 штамма.
Из штаммов, растущих на мясо-пептонном агаре, через 7 часов на обеих изби рательных средах дали рост 4 штамма. Но после 24 часов накопления в пересевах, сделанных на среду РДА, из 48 штаммов выросли только 5 штаммов, а на среде Эндо при тех же условиях дали рост 16 штаммов. Характер роста культур на среде РДА (морщинистый), без изменения цвета среды, позволял исключать их без дополнительных исследований, так как они не принадлежали к кишечной групп«. Рост са профитов на среде Эндо во многих случаях был весьма сходен с ростом культур кишечной палочки, что без дальнейшего изучения и идентификации культуры из тэ кой колонии может привести к ошибочным выводам.
Испытание способности сапрофитов давать рост на мясо-пептонном агаре и на испытуемых избирательных средах после выращивания на накопительной среде при 42" было проведено на 22 штаммах. В число этих штаммов вошли все те штаммы, которые обаруживали рост на избирательных средах в опыте с накоплением после роста на накопительной среде при 37°.
И в этой серии опытов обнаруживалось подавление роста сапрофитов в нако пительной среде. Так, из 22 штаммов дали рост после 7 часов накопления 10 штаммов, через 10 часов — 5 штаммов и через 24 часа — 9 штаммов.
Как и в огтыте с накоплением при 37°, преимущество в смысле подавления ро ста сапрофитов избирательной средой осталось за средой РДА. Рост, явно не характерный для культуры микробов кишечной группы, был обнаружен только после 10 часов накопления у одного штамма и через 24 часа накопления у 2 штаммов На среде же Эндо рост обнаруживался после 7 часов накопления у 3 штаммов, после 10 часов — у 5 и после 24 часов у 6 штаммов. В числе штаммов, давших рост на среде Эндо, были и штаммы, растущие на РДА.
Штаммы, давшие рост на обеих избирательных средах, состояли из грампо ложительных спороносных палочек, не разлагающих углеводы короткого пестрого ряда. По морфологии колонии этих штаммов на РДА резко отличались от колоний микробов кишечной группы, тогда как на среде Эндо колонии сапрофитов можно было легко принять по описанию, согласно ГОСТ 5216-50, за атипичные и, следовательно, без дополнительной идентификации их, судя только по морфологии колоний. можно было сделать неправильные выводы.
В-ЫВОДЫ
1. У микробов группы кишечной палочки, выделенных из воды, способность к вторичному газообразованию на твердых избирательных средах непостоянна и вариирует в зависимости от свойств избирательной среды, температуры и продолжительности накопления.
2. Способность к вторичному газообразованию обнаруживается у большего числа штаммов после первых 7 часов накопления. Поэтому пересевы из среды накопления на твердую среду предпочтительно делать в возможно ранние сроки, что, помимо ускорения, обеспечивает более точное определение коли-титра воды.
3. Накопление при 42° обусловливает большую биохимическую активность у микробов группы кишечной палочки, чем накопление при 37е. Поэтому при проведении анализа воды на определение коли-титра накопления кишечной палочки лучше проводить при 42°.
4. Среда РДА обладает по сравнению со средой Эндо большей элективностыо, не уступает ей по чувствительности и демонстративности
роста микробов группы кишечной палочки. Кроме того, возможность заранее заготавливать среду РДА разгружает лабораторию от необходимости готовить среду перед употреблением, что упрощает работу лаборатории. Все это дает право сказать, что среда РДА более, чем среда Эндо, отвечает требованиям, которые мы предъявляем к среде, применяемой при ускоренном и упрощенном определении коли-титра воды.
* -к -к
00
С-х "6<
М. М. Эфенди-Заде, Е. Н. Меликова, К. П. Родионова
Цитратассимилирующие бактерии кишечной группы в организме человека и их санитарно-показательное
значение
Из Азербайджанского медицинского института и Центрального научного контрольного института имени Тарасевмча
Работами Минкевича и его сотрудников установлено, что В. coli aerogenes формируется из В. coli commune вне кишечника человека и животных, в котором он обычно не обитает, не находя для себя подходящих, условий, чем обусловливается редкость находок В. coli aörogenes в кишечнике человека по сравнению с В. coli commune. Однако, по литературным данным, соотношение между количеством В. coli commune и В. coli aörogenes меняется в южных местностях Советского Союза в сторону увеличения частоты находок В. coli aärogenes в кишечнике теплокровных, в частности, человека. Работая над группой кишечных бактерий, мы поставили перед собой задачу выяснить, как часто обнаруживаются в кишечнике цитратассимилирующие палочки, т. е. В. coli citro-varum и В. coli aerogenes у жителей одного из южных городов, а также встречается ли у них среди попавших в мочевой пузырь экзогенным путем В. coli commune эти цитратассимилирующие бактерии.
Для установления присутствия В. coli aörogenes и В. coli commune в содержимом мочевого пузыря нами исследовалась моча, взятая катетером в стерильные флаконы. Исследования проводились в зимнее и весеннее время года. По 1 мл исследуемой мочи засевалось на 50 мл питательной среды с последующим пересевом полученного через сутки роста на агаровые чашки и чашки со средой Эндо. В качестве питательной среды были использованы среда Булира и среда Козера. Последней средой мы пользовались для лучшего выявления цитратассимилирую-щих разновидностей. Выросшие через 24 часа на агаре и на среде Эндо колонии тщательно изучались, и колонии каждого вида отвивались на косой агар. Полученные культуры изучались морфологически, культу-рально и биохимически по расширенному длинному ряду, предложенному Минкевичем, и на основании полученных данных идентифицировались. Результаты этих наблюдений приводятся в табл. 1.
Из табл. 1 следует, что в зимне-весенний период В. coli aörogenes были обнаружены в мочевом пузыре в 5,5% случаев. В. coli commune в тех же условиях обнаружены в 15%, т. е. примерно в 3 раза чаще. При этом только один раз был обнаружен комбинированный рост В. coli commune и В. coli a§rogenes в одной и той же моче. Во всех остальных случаях мы имели чистую культуру только того или другого микроба.
По сравнению с кишечной палочкой В. coli aärogenes встречается в моче реже, однако и выявленный процент указывает на неслучайное
виб/иотека
»иистерста Здра»о«хн». [
СССР \
