CC BY
13
М. Г. КИЧЕНКО (Москва)
К вопросу об ускоренных методах санитарно-бактериологического анализа воды
Из Всесоюзного научно-исследовательского института коммунальной санитарии и гигиены (дир. — проф. А. Н. Сысин!
Современные методы выделения кишечной палочки из воды, основанные на бродильном титре, требуют длительного срока (до 2—3 дней) и сопряжены с довольно значительным количеством ложных бродильных титров, не подтверждающихся дальнейшими этапами анализа. Поэтому как у нас, так и за границей ведутся интенсивные изыскания более совершенных методов бактериологического анализа воды, а также таких элективных сред, которые, наряду о угнетением сопутствующей микрофлоры, стимулировали бы рост В. coli.
Стандартная среда Эйкмана, применяемая в настоящее время, не вполне удовлетворительна, так как слабо угнетает спороносные формы микробов, а среда Эндо при хранении легко изменяется под влиянием света и температуры.
Нами изучалось поведение В. coli в различных средах накопления и на элективных твердых средах, применяемых в лабораторной практике. Работа проводилась на стерильной водопроводной воде, зараженной чистой культурой В. coli, затем В. coli в смеси с посторонними микробами, выделенными из сточной воды. Кроме того, ставились опыты со сточной водой, с водой Клязьминского водохранилища, с той же водой, но хлорированной при помощи клюкановского фильтра, и с водой из колодца деревни Осташхово. В двух случаях был взят для анализа ил.
В этих образцах определялись титр В. coli на жидких средах и параллельно число микробов на твердых средах по методу Мармона или при помощи мембранных фильтров. Наблюдения и запись результатов производились периодически. При проведении анализов мы стремились достигнуть максимальной экономии во времени и средствах.
Инкубация осуществлялась при температурах в 37 и 42°, а часть опытов — только при 37°. Срок наблюдений ограничивался 24 часами и только в некоторых случаях продолжался до 48 часов.
Для проверки метода накопления были взяты среды Эйкмана (стандартная) и молочно-пептонная, рекомендуемая многими авторами. Кроме того, мы пользовались средой Кеселера-Свенертона и двумя модификациями ее: Кесслер-Буллир о маннитом и Кесслер-Буллир с глюкозой. Эти модификации были взяты потому, что, по данным! некоторых авторов, оригинальная среда Кесслера, наряду с угнетением споровых бактерии, тормозит развитие В. coli. Из твердых сред проверялись среды Эндо, Фенол-Эндо, Климмера и Тига.
Так как мы стремились быстро и точно обнаружить В. coli, то пересевы этой культуры с жидких сред на твердые производились нами периодически до появления первых признаков роста В. coli, брожения и коагуляции. Такой ранний пересев иногда рекомендуется на практике для ускорения анализа.
Первые же опыты показали, что ни одна среда не имеет особых преимуществ перед средой Эйкмана и 'что оригинальная среда Кесслера давала наибольший процент отставаний, тогда как -обе модификации ее ускоряли обнаружение первых признаков роста В. coli (табл. 1).
Так как обе среды Кесслера, не имея значительных преимуществ перед средой Эйкмана, в то же время требуют большего количества
3 — Гигиена н санитария, Л5 9
33
Таблица i
Бродильная способность сред накопления
Среды Число анализов Совпадает Превышает Отстает Неясно
Эйкмана .......... 9 9
Кесслера оригинальная .... 8 1 — 7 —
Кесслера-Булира с маннитом . 9 5 2 2 —
Кесслера-Булира с глюкозой . 9 2 4 3 —
Молочно-пептонная..... 9 5 1 1 2
реактивов, что невыгодно, то мы от них отказались и в дальнейшем пользовались лишь средами Эйкмана, Кесслера оригинальной и молочно-пептонной.
При предварительных испытаниях твердых элективных сред обращалось внимание на скорость образования типичных колоний и их демонстративность, а также на угнетение сопутствующей микрофлоры.
Обе среды Эндо давали наиболее демонстративный рост, хорошо угнетали постороннюю микрофлору, но наступление роста запаздывало по сравнению с другими средами.
Среда Тига позволяла обнаружить рост типичных колоний с черным центром ранее, чем среда Эндо; хорошо угнетала сопутствующую микрофлору, но чувствительность ее в значительной мере зависела от сорта пептона, взятого для ее изготовления.
Лучшие результаты по демонстративности и скорости роста получены были на среде Климмера, но главным недостатком ее является слабая угнетающая способность в отношении споровых микробов. Прибавление к среде Климмера фенола в том же количестве, как к среде фенол-Эндо, несколько повысило ее элективность, однако не настолько, чтобы полностью заглушить рост сапрофитов. Более положительные показатели дала среда, к которой добавлялось 50 см3 желчи на 1 л среды, поэтому дальнейшая наша работа проводилась на среде Клим-мера с желчью.
В практике принято считать продолжительность периода накопления В. coli от 24 до 48 часов инкубации, тогда как наиболее интенсивное размножение бактерий происходит за время от второго до восьмого-десятого часа после посева. Поэтому для выяснения минимального срока накопления микробов делался посев воды, загрязненной В. coli, на среды Эйкмана, молочно-пептонную и Кесслера, затем> посевы параллельно выращивались при температурах в 37 и 4z°. Через определенные сроки производился пересев культур петлей на твердые элективные среды: Эндо, фенол-Эндо, Климмера и Тига. В этой серии опытов наблюдения велись за моментом обнаружения первых признаков роста В. coli на жидких средах (муть, газообразования или каогуляции в первом этапе анализа) и за образованием колоний — на твердых средах (во втором этапе анализа).
Опыты показали, что укороченные сроки инкубации посевов на жидких средах (до четырех часов и ниже) заметно отражаются на втором этапе анализа. Проращивание ранних посевов замедляется, и формирование колоний по времени совпадает с формированием колоний более поздних пересевов, причем рост ранних пересевов получался более скудным, чем после 8 часов накопления. Кроме того, на рост В. coli во втором этапе анализа (на твердых элективных средах), повидимюму, влиял состав среды накопления; так, например, в среде Кесслера оригинальной угнетение наблюдалось резче и дольше, чем! в средах Эйкмана и молочно-пептонной. Предположение о влиянии питательных.сред на размножение В. coli было подтверждено следующим опытом, поставлен-
ньш со строгим! учетом! числа бактерий в испытуемой воде, искусственно зараженной данной культурой (100 экземпляров В. coli в 1 см3).
Количество В. coli в этой воде определялось по бактериальному стандарту, число жизнеспособных бактерий проверялось по методу Коха на мясо-пептанном агаре при 37° через 24 часа и параллельно по методу Мармона на средах Эндо, фенол-Эндо, Климмера и Тига также при 37° через 24 часа.
Максимум колоний В. coli оказался в мясо-пептонном агаре, на втором месте по чувствительности оказалась среда Климмера и на последнем — среда Тига. Среда Эндо занимала среднее положение, но фенол-Эндо характеризовалась вдвое меньшим количеством колоний, чем среда Эндо без фенола. Из этого следует, что точность обнаружения В. coli в воде зависит также и от чувствительности твердой элективной среды, применяемой для выделения данной культуры. Поэтому для выяснения фаз роста В. coli на средах накопления производился пересев микропипеткой 0,1 см/1 на четыре твердые среды по Мармону: непосредственно после посева до термостата, через 1, 2 и 3 часа инкубации в термостате при 37 и 42° и по одной петле штрихом через 5 часов и 24 часа.
Оказалось, что В. coli в течение первого часа после посева теряет способность к размножению, а, возможно, часть микробов погибает, так как через 1 час после посева во всех сочетаниях, исключая двух, обнаружено было снижение числа колоний. К концу второго часа накопления число колоний вновь возросло и достигало, а в некоторых случаях превышало первоначальное их количество. К концу третьего часа инкубации число колоний делалось в 8—10 раз больше, чем в момент посева Однако это относится к средам Эйкмана и молочно-пептонной. В среде Кесслера угнетение продолжалось свыше трех часов, после чего коли-титр не снижался при дальнейшем накоплении, до 24 часов.
Влияние температуры на рост В. coli не удалось точно выяснить. Хотя в некоторых сочетаниях и отмечалось преимущественное влияние температуры в 42°, но в других сочетаниях лучшие показатели давала температура в 37°. Например, через 3 часа инкубации сочетание Эйкма-на-Эндо показало лучшие результаты при 37°, чем при 42°, и, наоборот, Эйкман с фенол-Эндо и Эйкман со средой Климмера дали лучшие результаты при 42°. Самое высокое число колоний было получено при сочетании молочно-пептонной среды с фенол-Эндо и температуре 42°, но сочетание молочно-пептонной среды ' с другими при этой температуре повлекло за собой значительно меньшее число колоний, чем* при 37°.
На среде Тига, приготовленной на Ленинградском пептоне, рост В. coli был обнаружен только через 2 часа накопления (вероятно, потому, что питательные свойства среды Тига не позволяют ослабленным микробам! размножаться).
Итак, судя по данным этого опыта, период угнетения в средах Эйкмана и молочно-пептонной продолжается около 2 часов, а затем, наступает размножение В. coli, которое к трем часам дает увеличение числа зародышей в средах Эйкмана и молочно-пептонной в 8—10 раз; при этом сказывается влияние твердых сред, применяемых во втором этапе анализа. Наиболее высокой чувствительностью отличались среды Эндо, фенол-Эндо и Климмера. Среда Тига, приготовленная на обычном пептоне, позволяет обнаружить В. coli только через 2 часа накопления, притом в меньшем количестве, чем другие среды.
Период угнетения В. coli в среде Кесслера продолжается долее трех часов независимо от сред, применяемых во втором этапе анализа.
Однако в опыте, поставленном по такой же схеме со стерильной водопроводной водой, зараженной хозяйственно-фекальной сточной жидкостью, результаты получились несколько иные. Вода содержала 13 000 микробов в 1 см3; по общему счету на плацентарно-пептонном
з*
35
агаре число В. coli по сравнению с обида* их числом: оказалось ничтожным: всего лишь 5 зародышей в 1 см3, определяемых на всех твердых средах по Мармону.
Коли-титр определялся (так же как и в предыдущем опыте) на трех средах накопления с посевом на четыре твердые среды. Первые признаки роста В. coli в жидких средах появились через 12—24 часа. Ранние посевы дали более или менее отчетливые результаты только через 20 часов с начала опыта при 4-часовом накоплении. Более длительный период накопления (до 24 часов) снизил коли-титр, но не в равной степени на различных средах. При 37° через 24 часа накопления в среде Кесслера в сочетании со средой Эндо, а в молочно-пептонной среде в сочетании со оредами фенол-Эндо и Климмера В. coli обнаружена была в 0,01 см3 воды, в сочетании же среды Кесслера с другими твердыми средами — 0,1 см3. В то же время в среде Эйкмана В. coli удалось обнаружить в сочетании с Эндо в 0,1 cmi3, а в других случаях—в 1 см3 воды. Но при 42ч через 24 часа накопления лучшие результаты показали сочетания молочно-пептонной среды с Эндо, фенол-Эндо и Клим-мера. В этих случаях В. coli была обнаружена в 0,01 см3 воды, тогда как в средах Эйкмана и Кесслера — в 1 см3.
Следовательно, при значительном бактериальном загрязнении воды среды с хорошими питательными свойствами для В. coli или с хорошей подавляющей рост сапрофитов способностью позволят определить коли-титр с большей точностью, чем с помощью среды Эйкмана. Точность анализа при непосредственном посеве на твердые среды также зависит от антагонизма сапрофитов, вследствие чего мы мюгли и обнаружить В. coli в одном объеме воды на твердых средах в 20 раз меньше, чем в 6 случаях с помощью оред накопления Кесслера и молочно-пептонной. Среда Эйкмана не дает таких преимуществ.
Ряд опытов с менее загрязненной бактериями водой и не столь резко выраженным соотношением между числом В. coli и общим числом бактерий подтвердил, что количество сопутствующей микрофлоры влияет на точность и скорость обнаружения В. coli в воде по методу непосредственного посева на твердые среды и по методу накопления.
Таблица 2
Анализ воды Клязьминского водохранилища
(Определение В. coli по Мармону от 13.VII)
Через 7 часов Через 12 часов Через 24 часа
Среды типич- нетипич- типич- нетипич- типич- нетипич-
ные ные ные ные ные ные
Фенол-Эндо ..... 1 23 28 170
Тига........ — 25 . 8 79 110 262
Климмер с желчью . . — 146 — 154 65 1
Климмер с фенолом . 6 119 19 1
Однако преимущество для сравнительно чистых вод имеет метод непосредственного посева (по Мармону — для более грязных и при помощи мембранных фильтров — для чистых вод) на твердые среды, как это видно из данных опыта от 13.VII (с водой Клязьминского водохранилища), поставленного при 37°. В этом случае по способу Мармона мы могли приступить к следующему этапу анализа — идентификации выделенных культур через 12 часов. Но подсчет типичных колоний В. coli оказался возможным только через 18—20 часов, так как типич-
1 Подсчет оказался невозможным вследствие сильного роста бактерий.
ные признаки колоний В. coli через 12 часов не были обнаружены (табл. 2).
По методу накопления первые признаки в виде мути наблюдались через 5 часов инкубации в 10 см3 воды. Но пересев из всех пробирок, сделанный в это время, показал наличие В. coli в 0,1 см3 воды после 9 часов инкубации на твердых средах, в средах накопления Эйкмана и мо-лочно-пептонной, а в среде Кесслера — только на среде Климмера. На средах Эндо и Тига из среды Кесслера В. coli была обнаружена в 1 см3.
Таким образом, через 14 часов мы могли перейти к идентификации выделенных культур. Дальнейшее накопление в течение 12 часов позволило обнаружить брожение в 0,1 см3 в среде Эйкмана и в модифицированных средах Кесслера. Оригинальная среда Кесслера дала брожение в 1 см3 и муть в 0,1 см3 пробы воды. В то же время в молочно-пептон-ной среде наблюдалось свертывание и пептонизация в 0,1 cmi3 посева воды. Пересев на твердые среды и выращивание их в течение 12 часов (т. е. через 24 часа от начала опыта) подтвердили коли-титр, обнаруженный через 14 часов. Дальнейшее накопление, продолженное до 24 часов, с последующим пересевом и выращиванием еще в течение 24 часов не отменило данных коли-титра, полученных через 14 часов.
Следовательно, уже через 5 часов накопления можно переходить к выделению В. coli без ущерба для точности анализа при условии посева из всех пробирок, даже не имеющих видимых признаков роста. Однако это усложняет работу, особенно при массовых анализах. Поэтому метод прямого посева заслуживает внимания, так как значительно сокращает и упрощает анализ. Кроме того, он точнее метода накопления. Так, например, из 258 параллельных посевов на среду Эндо по Мармону и по Эйкману в 42% Случаев обнаружено совпадение, в 27% преимущество оказалось на стороне твердых сред и в 16% случаев—на стороне жидких. Неудачных случаев на твердых средах из-за затеков отмечено 9,6%, а на жидких средах в 3,5% случаев кишечная палочка не была обнаружена, тогда как на твердых средах ее удалось выделить.
Из сказанного следует, что усовершенствование санитарно-бактерио-логического анализа должно итти по методу непосредственного посева на твердые среды.
Из твердых сред наиболее эффективной по простоте изготовления, скорости роста, чувствительности и демонстративности является среда Климмера с желчью; отрицательный момент — ее слабая угнетающая способность сопутствующих видов бактерий. Недостаток среды Тига— изменение ее чувствительности в связи с сортом пептона.
Среда Эндо классическая и отчасти среда фенол-Эндо дают достаточно хорошие результаты в отношении демонстративности колоний, времени, необходимого для их развития и угнетения сопутствующей микрофлоры. Основным неудобством в работе с ними является их чувствительность к свету, температуре и способу хранения.
Приводим рецепты применявшихся нами сред:
Среда Кесслер-Булир: мясной воды 1 л, пептона 30 г, ман-нита (или глюкозы) 12,5 г, NaCl 150 г. После кипячения и фильтрации необходимо добавить 12 см3 1% раствора генцианвиолета.
Среда Клима« ера с желчью: мясной воды 1 л, пептона 5 г, лактозы 5 г, желчи 50 см3, агар-агара русского, Архангельского—25 г, 1,5% спиртового раствора бромтимолблау 5 см3; pH от 6,8 до 7. Лактоза и индикатор прибавляются после осветления и фильтрования с агар-агаром. Дробная стерилизация.
Среда Тига: дестиллированной воды 100 см3, пептона 10 г, фос-форно-кислого калия (К2НРО4) 2 г, агар-агара Архангельского от 1,5— до 2 г, рН=7,5. Перед употреблением добавить лактозы 1 г, 2% эозина 2 см3, 0,5% метиленовой синьки 2 см3.
