Научная статья на тему 'К ВОПРОСУ О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ВОДЕ'

К ВОПРОСУ О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ВОДЕ Текст научной статьи по специальности «История и археология»

CC BY
79
11
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Гигиена и санитария
Scopus
ВАК
CAS
RSCI
PubMed
Область наук
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по истории и археологии , автор научной работы — Г.П. Кашкарова, О.Е. Благова, А.Г. Бойцов, О.Н. Ластовка, Е.А. Евельсон

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «К ВОПРОСУ О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ВОДЕ»

колбах соответственно на 1000 и 100 см3. Рабочие растворы устойчивы в течение 1 мес при комнатной температуре.

Далее выполняют анализ образцов для градуировки с вышеизложенной последовательностью выполнения анализа.

Обработку результатов измерений при определении массы ГФС в воздухе проводят по формуле:

г = ("'1 + ль) " 2,443

° К '

где С — концентрация гексафторида селена в воздухе, мг/м3; /и, — масса селена, найденная по калибровочной характеристике в первом поглотительном приборе, мкг; тг — масса селена, найденная по калибровочной характеристике во втором поглотительном приборе, мкг; 2,443 — коэффициент пересчета Бе на 8еР6; У0 — объем воздуха, отобранный для анализа, приведенный к стандартным условиям.

Периодический контроль воспроизводимости проводят по стандартным образцам не реже 1 раза в месяц, а также при возникновении сомнений в правильности измерений, при аттестации и контроле операторов, лабораторий и в других подобных случаях.

Методические указания утверждены 29.06.03 за номером МУК 4.1.1717-03 и включены в сборник МУК "Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны" выпуск № 45.

Л итература

1. ГОСТ 12.1.016-79. Система стандартов безопасности труда. Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентрации вредных веществ. — М., 1989.

2. (19) Яи (11) 2132050 (51) 6в01 № 21/78. Российское Агентство по патентам и товарным знакам (12) Описание изобретения к патенту РФ.

Поступила 04.12.03

Дискуссии

® КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 20134 УДК 614.777-078

Г. П. Кашкарова, О. Е. Благова, А. Г. Бойцов, О. Н. Ластовка, Е. А. Евельсон, Е. Н. Ахапкина, В. Б. Конторович, А. И. Дородников

К ВОПРОСУ О ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИФАГОВ В ВОДЕ

МГП "Мосводоканал"; Санкт-Петербургская государственная .медицинская академия им. И. И. Мечникова; ГУП "Водоканал Санкт-Петербурга"; ЗАО "Роса", Москва

Отечественные нормативные документы по контролю качества природных, питьевых и сточных вод последовательно вводят новый показатель — колифаги, представляемый как индикатор вирусного загрязнения. Развитие фаговой тематики в бывшем СССР связано с работами Л. В. Григорьевой на Украине и Г. А. Багдасарь-ян, Л. Е. Ловцевич, а в дальнейшем, Р. А. Дмитриевой, В. И. Зотовой, А. Ё. Недачина и других в России.

В лабораториях и аналитических центрах, обслуживающих водопроводные сооружения Москвы и Санкт-Петербурга, накоплен достаточный опыт применения колифагов в качестве санитарно-показательных микроорганизмов, а также методов их определения. В настоящей работе представлены анализ и обобщенные результаты текущего контроля качества воды водоисточников и проведенных экспериментальных исследований.

С 1995 г. МГП "Мосводоканал" с привлечением Аналитического центра "Роса" проводит систематические комплексные исследования микробного загрязнения Волжского и Москворецкого водоисточников, питающих водопроводные станции Москвы. Оценка качества воды осуществляется по широкому перечню бактериологических, вирусологических и паразитологических показателей, включая прямое определение патогенных бактерий кишечной группы и энтеровирусов. За период 1995— 2001 гг. исследовано около 1900 проб воды водоисточников и сточных вод, в том числе целенаправленно на эн-теровирусы более 1000 проб.

Следует подчеркнуть, что в настоящее время энтеро-вирусы являются единственной группой вирусов, для которых разработаны надежные методы обнаружения в воде и подтверждения инфекционное™ [12]. Именно этот факт обусловил выбор энтеровирусов для оценки вирусного загрязнения воды в наших исследованиях.

Волжский водоисточник характеризуется низким уровнем бактериального загрязнения и, согласно ГОСТу № 2761—84 на выбор водоисточника, относится к 1-му классу качества [6]. Так, из 559 проб, отобранных у во-

дозаборов Северной и Восточной водопроводных станций, только в 4 (0,8%) пробах количество лактозополо-жительных кишечных палочек (или общих колиформных бактерий) превысило 100 КОЕ на 100 мл и регистрировалось в диапазоне 109—194 КОЕ на 100 мл. В 65% проб общие колиформы определялись на уровне 10 КОЕ на 100 мл и ниже. Тем не менее 21% таких проб содержали колифаги в количестве, превышающем в 3 раза установленный для источников водоснабжения нормативный уровень (10 БОЕ на 100 мл) [3]. В зоне санитаркой охраны Волжского водоисточника количество колифагов выше нормы обнаруживалось в 40% проб с кратностью превышения норматива от 1,5 до 450 раз. Однако ни в одной из 329 проб Волжского водоисточника, исследованной на энтеровирусы, вирусы не выделены.

Из 699 исследованных 80% проб водозаборов Москворецкого водоисточника относилось к 2—3-му классу, а 3,7% проб в паводковый период превышало нормативный уровень водоисточника 3-го класса. Колифаги в количестве выше нормы обнаруживались в 65% проб, максимальные значения исчислялись тысячами БОЕ на 100 мл. Тем не менее 294 пробы, исследованные на энтеровирусы, показали отрицательный результат.

В зоне санитарной охраны Москворецкого водоисточника колифаги в количестве выше нормы обнаружены в 78% проб с максимальным превышением в тысячи раз. В створах рек после сброса сточных вод в 20 (6,8%) пробах из 292 выделены энтеровирусы. Количество колиформных бактерий в этих пробах составило 104—107 КОЕ на 100 мл, колифагов — 103— 10й БОЕ на 100 мл.

Таким образом, несмотря на высокие показатели микробного загрязнения Москворецкого водоисточника по колифагам, из 586 исследованных проб энтеровирусы выделены в 3,4%.

Определение энтеровирусов осуществлялось классическим методом на культуре клеток, признанным Всемирной Организацией Здравоохранения на сегодняшний день золотым стандартом в вирусологии. Исследования прово-

лились на двух линиях перевиваемых культур клеток: BGM (почки африканской зеленой мартышки) и Нер2 (человеческий эпителий). Эффективность использованного метода подтверждена в исследованиях сточных вод. Из 125 проб сточных вод, сбрасываемых в зоне санитарной охраны, вирусы обнаружены в 24% (30 проб) при среднем по России уровне выделения энтеровирусов из сточных вод 8—9% [10]. Повышению выделения энтеровирусов способствовало использование эффективного метода отбора и концентрирования больших объемов воды и не традиционной для России линии клеток BGM, рекомендованной для вирусологического исследования воды стандартами США и Франции: более 70% штаммов энтеровирусов было выделено только на BGM [13, 14, 18).

Из 30 проб сточных вод, содержащих энтеровирусы, 29 характеризовались высоким уровнем фекального загрязнения (термотолерантные колиформы). В этих пробах коли-фаги обнаруживались от 25 до 106 БОЕ на 100 мл. Вместе с тем в одной пробе очищенных сточных вод вирусы были выделены при невысоких количествах колиформных бактерий — 10 КОЕ на ! 00 мл и содержании колифагов 125 БОЕ на 100 мл. Именно такие случаи выдвигаются в пользу индикаторного значения колифагов и их преимуществ по сравнению с бактериальными индикаторами. Однако этот факт не входит в противоречие с особенностями циркуляции патогенов в водных объектах, так как при наличии индикаторов фекального загрязнения всегда существует вероятность обнаружения патогенных микроорганизмов. Подтверждением этой позиции служит обнаружение нами сальмонелл в воде Волжского водоисточника при низких значениях колииндекса, определяемых на уровне сотен и даже десятков КОЕ/л (70-600 КОЕ/л).

Сравнительный анализ количественных значений показателей фекального загрязнения водоисточников и сточных вод (ТКБ) и колифагов не выявил четких закономерностей. Отмечена тенденция к возрастанию количества колифагов с увеличением количества колиформных бактерий без прямой численной зависимости. Вместе с тем при определении термотолерантных колиформ на уровне единичных клеток в "чистых" водах Волжского водоисточника количество колифагов регистрировалось с превышением нормативного уровня без выделения при этом энтеровирусов.

В то же время в пробах с выраженным фекальным загрязнением (ТКБ до 106 КОЕ на 100 мл), т. е. потенциально опасных в отношении содержания возбудителей инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы, количество колифагов регистрировалось ниже нормы.

Выявленные противоречия в оценке качества воды по колифагам, а также анализ литературных данных зарубежных авторов привели к сомнениям в объективности предложенного критерия.

На сегодняшний день однозначно установлено, что ко-лифаги содержатся в фекалиях в незначительных количествах или не содержатся вообще [9, 15]. Следовательно, колифаги не могут выполнять роль санитарно-показатель-ных микроорганизмов вирусного загрязнения, а обнаружение колифагов в больших концентрациях в сточных водах при их отсутствии в фекалиях свидетельствует о разных путях поступления в воду колифагов и вирусов.

В связи с этим было сделано предположение, что появление колифагов в воде прежде всего связано с наличием лизогенных, т. е. содержащих фаг, Е. coli, поступающих в воду с фекалиями. Известно, что бактериофаги, являясь вирусами бактерий, по взаимодействию с клеткой хозяина подразделяются на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги, находясь в свободном состоянии, адсорбируются на бактериальной клетке, проникают внутрь, размножаются внутри клетки и лизируют бактерии с выходом в окружающую среду до 300 свободных фаговых частиц. Умеренные фаги, попав в бактериальную клетку, превращаются в профаг, встраиваются в геном бактериальной клетки и в последующем размножаются синхронно с ней, не вызывая ее гибели. Такие клетки называются

лизогенными, а явление — лизогения. Умеренный бактериофаг может существовать внутри бактерий на протяжении многих поколений, но при определенных обстоятельствах активируется. Это приводит к гибели бактериальной клетки, размножению фага и его выходу в окружающую среду. Вновь образованные фаги могут взаимодействовать с бактериальной клеткой как вирулентные или как умеренные фаги. Активизация профага может происходить спонтанно или под воздействием неблагоприятных факторов (химических, физических).

С целью выявления роли лизогенных бактерий в появлении в воде колифагов Аналитическим центром "Роса" проведен эксперимент на выделенных из природного водоема 176 штаммах Е. coli. Видовая принадлежность к Е. coli идентифицировалась по системе API 20Е. Выделенные культуры Е. coli были пассированы через питательный бульон и сгруппированы по 10—15 штаммов в 12 модельных групп. В каждой модельной группе смесь чистых бульонных культур делилась на две части. Первая проходила обработку хлороформом, вторая служила контролем. По 1 мл каждой смеси бульонных культур было внесено в стерильные чашки Петри и залито питательным агаром, содержащим рекомендованную МУК 4.2.1018—01 детекторную культуру Е. coli Kl2 F^Str* [7]. В результате проведенных исследований в 5 модельных группах из 12 нам удалось выявить колифаги после обработки чистых культур Е. coli хлороформом. Контрольные посевы выявили рост ровного газона Е. coli и отсутствие колифагов. Таким образом, с одной стороны, была подтверждена взаимосвязь появления колифагов в воде с жизнедеятельностью лизогенных Е. coli, с другой — установлена реальная возможность образования колифагов в процессе выполнения анализа при обработке пробы воды, содержащей лизогенные эшерихии.

Явление лизогении чрезвычайно широко распространено среди энтеробактерий, при этом фаги микроорганизмов этого семейства не всегда обладают родовой специфичностью. В связи с этим для оценки специфичности предлагаемого МУК 4.2.1018—01 метода обнаружения колифагов на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова была проведена серия экспериментов на культурах энтеробактерий, выделенных из воды. Принадлежность выделенных микроорганизмов к семейству Enterobacteriaceae оценивали по O/F-тесту и отсутствию оксидазной активности. Дальнейшую идентификацию не проводили. Всего было изучено 30 штаммов этих микроорганизмов.

Индукцию умеренных бактериофагов из выделенных энтеробактерий осуществляли путем воздействия на 5— 6-часовые бульонные культуры ультрафиолетом, излучаемым УФ-лампой низкого давления в дозе, вызывающей гибель 50% бактериальной популяции. Облученные культуры инкубировали в темноте в течение 2 ч, после чего тестировали на свободный фаг, обладающий лити-ческой активностью по отношению к индикаторному штамму Е. coli Kl 2 F+StrR. Параллельно ставили контроль на отсутствие загрязненности культуры Е. coli (отрицательный) и контроль полноты элюции хлороформа (отрицательный). Из 30 протестированных штаммов энтеробактерий у 14 были выявлены фаги, лизирующие детекторную культуру Е. coli KI2 F+StrR. Таким образом, руководствуясь МУК4.2.1018—01, мы определяем не только колифаги, а значительную часть бактериофагов энтеробактерий. При этом лизогенные энтеробактерии в свою очередь могут явиться источником появления в воде фагов, которые при выполнении анализа будут определяться как колифаги.

Следует отметить, что результаты многолетних исследований J1. В. Григорьевой по оценке взаимосвязи кишечных бактериофагов с загрязнением кишечными вирусами природных и сточных вод свидетельствуют, что на долю колифагов приходится 44% кишечных бактериофагов, циркулирующих в водных объектах [4]. Стандарт ИСО 10705-1 по обнаружению F-специфических бакте-

риофагов косвенно также подтверждает отсутствие строгой родовой специфичности: для выполнения анализа рекомендован штамм Salmonella typhimurium WG49, а в качестве клеток-хозяина при культивировании контрольного для детекторной культуры WG49 RNA-фага MS2 используется Е. coli K12Hfr [21].

Для следующего эксперимента, моделирующего натурные условия, смесь культур энтеробактерий с выявленными в предыдущих опытах лизогенными свойствами вносили в стерильную водопроводную воду. Расчетная концентрация энтеробактерий составляла 105 КОЕ/л. Подготовленные таким образом пробы заведомо не содержали свободного фага. В дальнейшем они были исследованы в соответствии с МУК 4.2.1018—01, и в 5 из 6 случаев были выявлены фаги. Следовательно, при исследовании нативной воды такие результаты были бы интерпретированы как свидетельствующие о присутствии колифагов и потенциальной опасности наличия вирусов.

Здесь необходимо обратить внимание, что рекомендованный МУК титрационный метод обнаружения колифагов предусматривает посев исследуемой пробы воды в питательный бульон с Е. coli. Несомненно, что в этом случае будут размножаться микроорганизмы не только внесенного детекторного штамма, но и бактерии, исходно содержащиеся в воде, при этом их количество может доходить до 10s КОЕ/мл. Соответственно возрастает вероятность получения ложноположительного результата.

Таким образом, очевидно, что лизогенные энтеробактерий, в том числе Е. coli, присутствуют в воде поверхностных водоемов, а содержащиеся в них умеренные фаги спонтанно или индуцированно под воздействием различных химических или физических факторов могут создавать высокие концентрации фагов в воде.

По результатам проведенных в 80-х годах экспериментов, Г. А. Багдасарьян и соавт. было высказано мнение, что в воде происходит не только адсорбция фагов бактериями, но и их лизис с выходом новых частиц фагов [2]. Данная позиция, не нашедшая дальнейшего развития в отечественных исследованиях, подтверждена работами зарубежных исследователей [20]. Достоверно показано, что бактериофаги кишечных бактерий интенсивно размножаются в условиях канализационных сооружений [16, 17] и даже биопленок обрастания водопроводных сооружений [19]. Наличие колифагов плохо коррелирует как с другими санитарно-показательными микроорганизмами, так и с присутствием в воде энтеровирусов. Этот факт признают многие зарубежные исследователи [7, 8]. По результатам зарубежных исследований бактериофаги исключены из показателей контроля качества питьевой воды при пересмотре Директивы ЕС [5, 11].

Опубликованные результаты отечественных исследователей неоднозначны и противоречивы. А. Е. Недачин и соавт., активно предлагая колифаги в качестве индикатора вирусного загрязнения очищенной воды, указывает на выделение вирусов в 7,8% проб из питьевой воды при отсутствии колифагов в 1 л питьевой воды [8]. На обнаружение энтеровирусов в воде при отсутствии колифагов указывает в своих работах Т. В. Амвросьева, по мнению которой колифаги не являются индикаторами вирусного загрязнения [1].

Все вышеизложенное позволяет усомниться в целесообразности использования бактериофагов кишечных палочек при санитарно-микробиологическом исследовании воды. Выделение колифагов, а точнее кишечных бактериофагов, в воде как результат отмирания лизогенных Е. coli и энтеробактерий, а также размножения в воде вирулентных фагов, объясняет появление фагов в сточных водах при их отсутствии в фекалиях; низкие концентрации фагов при высоких показателях фекального загрязнения; превышение нормативного уровня по фагам в "чистых" по бактериологическим показателям водах как результат процесса самоочищения и в очищенных сточных водах.

Результаты проведенных экспериментальных исследований имеют два практических аспекта: 1) колифаги (бактериофаги) могут образовываться из лизогенных энтеробактерий в процессе водоподготовки на очистных

сооружениях водопроводных станций и в результате очистки сточных вод; 2) колифаги (бактериофаги) могут образовываться в процессе выполнения анализа воды при обработке хлороформом проб воды, содержащих энтеробактерий и, в частности, Е. coli.

На основании практического опыта контроля качества воды, подтвержденного результатами экспериментальных исследований, сделаны следующие выводы.

1. Обнаружение колифагов в больших концентрациях в сточных водах при их отсутствии в фекалиях свидетельствует о разных путях поступления в воду колифагов и вирусов, вследствие чего колифаги не могут выполнять роль санитарно-показательных микроорганизмов вирусного загрязнения.

2. Лизогенные энтеробактерии, в том числе Е. coli, довольно часто присутствуют в воде поверхностных водоемов и являются основным источником поступления фагов в воду. Содержащиеся в них умеренные фаги спонтанно или индуцированно под воздействием различных химических или физических факторов могут создавать высокие концентрации фагов в воде вне зависимости от наличия кишечных вирусов.

3. Колифаги (бактериофаги) могут образовываться из лизогенных энтеробактерий в процессе водоподготовки на очистных сооружениях водопроводных станций в результате очистки сточных вод, а также в процессе выполнения анализа проб воды, содержащих лизогенные энтеробактерии и, в частности, Е. coli.

4. Использование колифагов в качестве санитарно-показательных микроорганизмов приводит к занижению оценок качества воды, что в свою очередь вызывает применение боле жестких режимов обеззараживания, влечет за собой необоснованные экономические потери и самое важное повышает риск для здоровья населения из-за увеличения вероятности образования хлорорганических соединений в процессе водоподготовки.

Литература

1. Амвросьева Т. В. // Гиг. и сан. - 2002. - № 1. - С. 72-76.

2. Багдасарьян Г. А., Талаева Ю. Г., Захаркина А. Н. и др. // Гиг. и сан. - 1980. - № 7. - С. 59-62.

3. Гигиенические требования к охране поверхностных вод. Санитарные правила и нормы. СаиПиН 2.1.5.980-00. — М., 2001.

4. Григорьева J1. В. Санитарная бактериология и вирусология водоемов. — М., 1975.

5. Директива Совета Европейского Союза 98/83/ЕС от 3 ноября 1998 по качеству воды, предназначенной для потребления человеком. — M., L999.

6. Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения. Гигиенические, технические требования и правила выбора. ГОСТ 2761-84. - М., 1985.

7. Методы санитарно-бактериологического анализа питьевой воды. Методические указания МУК 4.2.1018-01. — М., 2001.

8. Рахманин Ю. А., Недачин А. £., Доскина Т. В. и др. // Гиг. и сан.

- 1990. - № 6. - С. 21-23.

9. Руководство по контролю качества питьевой воды. — Женева. 1994. - Т. 1.

10. Сейбиль В. Б. // Вопр. вирусол. - 2000. - № 5. - С. 45-47. И. Council Directive SO/778 EEC of 15 Juli 1980 on the Quality of Water Intended for Human Consumption. Official Journal of the European Communities. — L229/16. - 30.08.80.

12. Croci L., De Medici D., Scalfaro C. et al. // J. Appl. Microbiol. — 2000. - Vol. 88, N 2. - P. 293-298.

13. EPA/600/R-95/178 (1996). ICR Microbiol Laboratory Manual.

14. Griffin D. W., Gibson C. J. 3rd, Lipp E. K. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - Vol. 65, N 9. - P. 4118-4125.

15. Guidelines for Drinking-Water Quality. — Geneva, 1996. — Vol. 2.

16. HavelaarA. H., Pot-Hogeboom W. M., Furuse K. et al. //Appl. Bacterid. - 1990. - Vol. 69, N 1. - P. 30-37.

17. Ledere H., Edberg S., Pierzo V., Delallre J. M. // J. Appl. Microbiol.

- 2000. - Vol. 88, N 1. - P. 5-21.

18. Normalisation Française XPT 90-451. Essais des Eaux. Recherche des Enterovirus. — 1996.

19. Persistence of Two Model Enteric Viruses (B40-8 and MS-2 Bacteriophages) in Water Distribution Pipe Biofilms // Water Sei. Techno!. - 2001. - Vol. 43, N 12. - P. 133-138.

20. Report on Public Health and Medical Subjects N 71. Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. Rart 1-Drink-ing Water, The Microbiology of Water. — 1994.

21. Water Gulity — Detection and Enumeration of Bacteriophages. — Part 1 : Enumeration of F-specific RNA Bacteriophages. ISO 10705-1:1995 E.

Поступила 16.12.02

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.