CC BY
104
К ВОПРОСУ О РАЗРАБОТКЕ И ИССЛЕДОВАНИИ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ СТОЛБНЯЧНОГО И ДИФТЕРИЙНОГО АНАТОКСИНОВ
Е.А. Хволис
ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России
E-mail: elenahvolis @mail.ru
TO THE QUESTION ON DEVELOPING AND RESEARCH OF LIPOSOMAL FORMS OF TETANIC AND DIPHTHERITIC ANATOXINS
E.A. Khvolis
Perm State Pharmaceutical Academy
В настоящей работе представлены данные по инкапсулированию в липосомы методом выпаривания, в обращенной фазе столбнячного и дифтерийного анатоксинов. Это является перспективным для создания новых лекарственных форм этих анатоксинов. В результате исследований подобраны оптимальные соотношения липид (ле-цитин)/анатоксин для создания стабильных липосомальных форм. Для изучения специфической активности и стабильности при хранении полученных дисперсий использованы реакция коагглютинации и центрифугирование. Установлено сохранение специфической активности анатоксинов при включении в липосомы.
Ключевые слова: липосомы, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, выпаривание в обращенной фазе, реакция коагглютинации.
The following work represents the data on incapsulation in liposomes with the method of evaporation in the inverted phase of tetanus and diphtheria anatoxins. For the creation of the new medical forms of anatoxins this work is perspective.
As a result of the research optimum parities of a lipid (lecithin) / anatoxin were picked up for creation of stable liposomal forms. Reaction of coagglutination and centrifugation
were used for the research of specific activity and stability during storage. Preservation of specific activity of anatoxins was established in inclusion in liposomes.
Key words: liposomes, tetanic anatoxin, diphtheritic anatoxin, evaporation in the reverse phase, reaction of coagglutination.
Введение
Начало XXI века ознаменовано бурным ростом нанотехнологических исследований в различных областях нашей жизни. Фармацевтическая нанотехнология вовлекает в сферу своих интересов такие направления, как:
- исследование и разработка технологии новых нанопродуктов, которые могут найти применение для создания диагностических, лечебных, реабилитационных систем;
- создание твердых тел и поверхностей с измененной молекулярной структурой;
- организация и специфика промышленного производства продуктов фармацевтической нанотехнологии;
- разработка достоверных аналитических методов оценки нанообъектов и наноструктур, а также нормативов их качества и безопасности;
- изучение токсичности, кумулятивных свойств, экологической безопасности, разработка способов утилизации продуктов нанотехнологии;
- разработка самореплицирующихся (саморазмножаю-щихся) систем на базе биоаналогов - бактерий, вирусов, простейших; развитие наноконтейнер-ных технологий векторной доставки лекарств [4 ,8]. Наноносители как средства доставки лекарств привлекают своими возможностями обеспечения контролируемых параметров фармакокинетики и локализации действия. Более 50% фармацевтических компаний-произво-дителей используют нанотехнологии для разработки систем доставки лекарственных веществ к органам и тканям-мишеням. Эти препараты дают сегодня 80% оборота мировой наномедицины [5, 9].
Липосомы - продукт нанотехнологии, представляющие собой специфические образования, диаметром от нескольких десятков до нескольких тысяч нанометров, состоящие из одного или нескольких слоев липида, окружающих водную фазу [9].
Для практического применения липосом исключительно важна их способность удерживать вещества различной природы: от неорганических ионов и низкомолекулярных органических соединений до крупных белков и нуклеиновых кислот [1].
Включенные в липосомы лекарственные вещества становятся более устойчивыми в организме, более эффективными и менее токсичными, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий, в частности, от разрушения в желудочнокишечном тракте [4]. Кроме того, полученные из природных фосфолипидов липосомы, в отличие от полимерных систем доставки лекарств, полностью биодеградируемы и биосовместимы, пригодны для включения в них многих фармакологических агентов, в том числе ферментов, гормонов, витаминов, антибиотиков, иммуномодуляторов, цитостатиков, вакцин.
В настоящее время во многих странах ведутся разработки липосомальных форм вакцин. Некоторые исследователи считают, что иммуногенность вакцин возрастает при заключении их в липосомы. В случае использования липосомальной вакцины иммунный ответ усиливается вследствие того, что антигены, ассоциированые с
липосомами, попадают непосредственно в антиген представляющие клетки. Такое эффективное применение вакцин, возможно, позволит сэкономить значительные денежные средства [4].
Примером виросомальной вакцины является субъе-диничная вакцина для профилактики гриппа Инвивак (Solvay Pharmaceuticals), которая успешно прошла регистрацию в ряде стран Европейского Союза. Эта вакцина представляет собой сферические частицы менее 200 нм с двойным липидным слоем, в котором крепятся гликопротеины на внешней поверхности вируса гриппа, то есть виросомальная частица имитирует частицу натурального вируса. Клинические исследования показали, что полученная вакцина является безопасной и эффективной, особенно для лиц со сниженным уровнем иммунитета. Двойной механизм действия вакцины Инвивак сводится к следующему: виросомы стимулируют р-лимфоциты, что является очень важным для профилактики ассоциированных с гриппом заболеваний. Т-лимфоциты распознают и уничтожают инфицированные клетки. Это позволяет добиваться быстрого восстановления здоровья пациентов после перенесенной вирусной инфекции. Стимуляция гуморального и клеточного иммунитета может быть дополнительным преимуществом новой вакцины.
Липосомы предоставляют возможность конструировать поливалентные вакцины против нескольких штаммов гриппа (сингапурский, пекинский и ямагата), гепатита А и В, дифтерии, столбняка. В Швейцарии одобрено несколько таких вакцин. В этой же стране разработана лицензированная липосомальная вакцина против гепатита А. В США проходит доклиническое изучение вакцина липосомальная менингококковая [7].
Липосомы успешно применяются для иммунизации через слизистые желудочно-кишечного тракта и верхних дыхательных путей (вакцина эшерихиозная, шигеллезная Флекснера). При этом развивается как общий, так и местный секреторный иммунитет [5].
В настоящее время разработаны различные методы получения липосом: ручное встряхивание, выпаривание в обращенной фазе, озвучивание, этанольная инжекция, экструзия, спонтанная везикуляция липидов, микрофлю-идизация, сушка распылением, замораживание-оттаивание, гомогенизация при высоком давлении, диализ [7].
Липосомы, полученные разными методами, гетеро-генны по размеру. Так, в результате использования способа ручного встряхивания образуются наиболее крупные липосомы - от 250 до 1900 нм. Однородные по размеру и достаточно мелкие (от 8 до 15 нм) липосомы, обработанные ультразвуком.
Фирма Biocompatibles (Великобритания) разработала полимеризованные липосомы - липогелосомы, в которых фосфолипиды, образующие липосому, связаны друг с другом ковалентными связями, а не слипаются под действием физических сил. Это повышает стабильность липосом, предотвращает их агрегацию. Для получения липогелосом использовали синтетические липиды, которые будучи диспергированы в водной среде и нагреты выше температуры фазового перехода образуют замкнутые пузырьки, состоящие из серии концентрических сфер, разделенных водной фазой [11]. Кроме того, пред-
Е.А. Хволис
К ВОПРОСУ О РАЗРАБОТКЕ И ИССЛЕДОВАНИИ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ...
ложен способ получения липосом из спиртово-глицериновых смесей, содержащих различные поверхностноактивные вещества. Лекарственные и вакцинные препараты, изготовленные таким методом, обладают высокой лечебной и профилактической активностью [12].
В литературе имеются сведения об использовании комбинации методов замораживания-оттаивания и обращения фаз для формирования липосом диглицеридного производного метотрексата [2]. Инкапсулирование в липидные везикулы доксорубицина проведено путем совмещения воздействия ультразвука и выпаривания в обращенной фазе [3].
При использовании метода выпаривания в обращенной фазе удается инкапсулировать до 80% гидрофильных веществ и обеспечить включение во внутренний объем липосом значительного количества воды, а также максимально избежать загрязнения липидных везикул посторонней микрофлорой. Кроме того, возможна частичная автоматизация процесса выпаривания в обращенной фазе. При удалении органической фазы из реактора контакт ее с персоналом минимальный. В целом, данный способ технологичен и позволяет включать в липосомы как гидрофильные, так и гидрофобные вещества. Везикулы, полученные таким методом, гетерогенные по размеру: 150-950 нм. Выпариванием в обращенной фазе получена новая магнитоуправляемая форма преднизолона [13].
В настоящей работе предпринята попытка инкапсулирования в липосомы столбнячного и дифтерийного анатоксинов, что является перспективным для создания новых лекарственных форм этих анатоксинов.
Цель работы: получение липосомальной формы столбнячного и дифтерийного анатоксинов методом выпаривания в обращенной фазе, исследование стабильности, специфической активности полученных липосомаль-ных дисперсий.
Материал и методы
В качестве липидной основы использовали лецитин-стандарт производства ЗАО “Биолек” (г. Харьков). Для инкапсулирования применяли анатоксины столбнячный и дифтерийный очищенные концентрированные жидкие (ФГУП “НПО “Микроген” МЗ РФ “Пермское НПО “Био-мед”). Липосомы получали методом выпаривания в обращенной фазе. Использовалась пассивная технология инкапсулирования, предусматривающая одновременное диспергирование лекарственного вещества и липида в водном буфере, при этом достигалось одновременное образование липосом с включением в них лекарственного вещества. Изучение стабильности проводили путем центрифугирования липосомальных дисперсий при скорости 1500 об/мин в течение 5 мин. Для определения специфической активности анатоксинов и их липосо-мальных дисперсий использовали реакцию коагглюти-нации (РКОА). Учет результатов РКОА проводили по 4-крестной системе: ++++ - полная коагглютинация; +++
- хорошо выраженная коагглютинация; ++ - неполная коагглютинация; - - отсутствие коагглютинации.
Результаты и обсуждение
При получении липосомальных дисперсий первоначально проводили исследования по подбору оптимального соотношения липид/анатоксин. Интервал соотношений составил от 1:1 до 1:7. Липосомальные дисперсии используемых анатоксинов по внешнему виду представляли собой однородные молочно-белые эмульсии с различной степенью расслоения. В дальнейшем сравнивали степень расслоения полученных образцов липосомаль-ных дисперсий анатоксинов. Исследование стабильности липосом с применением центрифугирования показало, что наименьшая степень расслоения отмечена для липосомальной дисперсии с соотношением лецитин/ столбнячный анатоксин 1:1 и лецитин/дифтерийный анатоксин 4,5:1. Центрифугат сохранял мутность, наблюдалось появление незначительного осадка. В дисперсиях с другими соотношениями компонентов произошло расслоение эмульсий, что свидетельствует о меньшей стабильности этих дисперсий.
С помощью РКОА провели изучение процесса включения столбнячного и дифтерийного анатоксина в ли-посомы, тем самым оценивали специфическую активность липосомальных дисперсий.
В таблице представлены результаты анализа липосо-мальных дисперсий дифтерийного анатоксина с помощью РКОА.
По данным таблицы, дифтерийный анатоксин (положительный контрольный образец) титровался в РКОА до разведения 1:28800 (450x64), а липосомальная дисперсия с соотношением лецитин/дифтерийный анатоксин 4,5:1 - до разведения 1:4. В дисперсиях с соотношениями дифтерийный анатоксин/лецитин от 1:1;5 до 1:5,5 образование коагглютинатов отмечалось до разведения 1:32. Это, возможно, свидетельствует, о наличии поверхностной фиксации дифтерийного анатоксина.
Для определения свободного анатоксина липосомаль-ные дисперсии после центрифугирования фильтровали через фильтры “миллипор” (размер пор 0,8 мкм). Полученные фильтраты липосомальных дисперсий с соотношениями лецитин/дифтерийный анатоксин 1,5:1; 2,5:1, представляющие собой прозрачные бесцветные жидкости, давали слабоположительную реакцию коагглютина-ции, следовательно, можно предположить, что часть анатоксина находится в свободном, не связанном с липосо-мами, состоянии. В дисперсиях с соотношениями лецитин/дифтерийный анатоксин 3,5:1; 4,5:1; 5,5:1 не происходило образования коагглютинатов, что свидетельствует об отсутствии свободного анатоксина. Промытые ре-суспендированные осадки четко выраженной положительной реакции не давали. Это, вероятно, говорит о включении дифтерийного анатоксина во внутреннее пространство липосом.
Изучение процесса включения столбнячного анатоксина в липосомы с помощью РКОА показало, что он полностью связывался с липосомами, поскольку, после центрифугирования полученной липосомальной дисперсии в надосадочной жидкости он не был обнаружен. Вероятно, столбнячный анатоксин находится внутри липосомы и на ее поверхности, так как полученная липосомальная
Таблица
Анализ липосомальных дисперсий дифтерийного анатоксина с помощью РКОА
Исследуемый материал Специфическая активность Примечание
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
ДА (положительный контрольный образец) + + + + ++++ ++++ ++++ +++ ++ + -
исходное разведение 1:450
ЛД с соотношениями
Л/ДА 1,5:1 2,5:1 + + + + + + + + ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ ++ + -- -- Анатоксин на поверхности липосомы
3,5:1 + + + + ++++ +++ ++ ++ - - -
1-Л 5: 5: +++ ++++ ++ ++++ +++ ++ + Менее выраженная поверхностная фиксация Анатоксин на поверхности липосомы
Профильтрованные
ЛД с соотношениями
Л/ДА 1,5:1 ++ + - - - - - - Незначительное количество
2,5:1 ++ + - - - - - - свободного анатоксина
3,5:1 - - - - - - - - Свободный анатоксин отсутствует
4,5:1 - - - - - - - -
5,5:1 - - - - - - - -
"Пустая” липосомальная дисперсия (отрицательный контроль)
дисперсия со столбнячным реагентом образует четко выраженные коагглютинаты.
Наши предположения подтверждаются данными литературы, согласно которым при получении липосомаль-ных форм белковых соединений молекулы белка могут не только заключаться в липосомы, но и находиться на их поверхности. Исследователи также сообщают, что эти два механизма могут происходить одновременно, то есть часть вещества белковой природы может включиться в липидные везикулы, а часть связаться с их поверхнос-тью.[6].
Исследование с помощью детергента Твина-20 по определению локализации анатоксина на примере липосо-мальных дисперсий дифтерийного анатоксина, подтвердило включение анатоксина во внутреннее пространство липосом.
Заключение
Таким образом, в проведенных экспериментах нами показана возможность получения стабильных липосо-мальных дисперсий столбнячного и дифтерийного анатоксинов на основе лецитина с сохранением их специфической активности.
Литература
1. Барсуков Л.И. Липосомы // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 10. - С. 33-36.
2. Водовозова Е.Л., Гаенко Г.П., Бобрикова Е.С. и др. Диглице-ридное производное метотрексата: синтез и цитостатичес-кая активность в составе адресных липосом // Химикофармацевтический журнал. - 2007. - Т. 41, № 6. - С. 10-14.
3. Жукова М.В., Кисель М.А., Кузьмицкий Б.Б. и др. Инкапсулирование доксорубицина в липосомы, содержащие фосфа-тидилэтанол. I. Физико-химическая характеристика и про-
тивоопухолевая активность жидко-кристаллических липосом // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т.40, № 1. - С. 31-33.
4. Одинец А.В., Ефременко В.И., Чеботарев В.Р., Базиков И.А. Конструирование наноструктур (липосом), содержащих антибиотики и их использование для лечения экспериментального сифилиса // Мед. вестник Северного Кавказа. -2007. - № 4. - С.41-44.
5. Швец В.И. Липосомы в фармации. Продукты нанобиотехнологии // Фармакотерапия. - 2008. - № 3.
6. Липосомы в биологических системах / пер с англ. ; под ред. Г. Грегориадиса и А. Аллисона. - М. : Медицина, 1983. -384 с.
7. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ / А.П. Каплун, Шон ле Банг, Ю.М. Карснопольский, В.И. Швец // Вопросы медицинской химии. - 1999. - №4, Т. 45, Вып. 1. - С. 3-12.
8. Наноразмерные формы лекарственных соединений (обзор) / В.А. Степанов, Е.В. Назарова, Г.В. Назаров, Н.Н. Каркищен-ко, С.Е. Галан, М.М. Мурадов // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - Т. 43, № 3. - С. 41-48.
9. Пальцев М.А. Нанотехнологии в медицине и фармации // Ремедиум. - 2008. - № 1. - С. 6-9.
10. Бажутин Н.Б. Перспективы применения липосомальных препаратов в медицинской практике // Terra medica. - 2003.
- № 3. - С. 3-6.
11. Способ получения липосом. Патент 2216315 / Грегориадис Грегори, Зади Брахим, Джайасекера Прмукх Налака; № FR 91/01203; заявл. 11.06.1998; опубл. 17.12.1998; приор.
11.06.1998 (Франция).
12. Способ получения липосомальных препаратов. Патент 2130771 / Автушенко Сергей Сергеевич; № 98110285\14; 01.06.1998; опубл. 25.05.1999; приор. 01.06.1998 (Россия).
13. Исмаилова Г.К. Эффективность наружного применения новой магнитоуправляемой липосомальной формы пред-низолона при экспериментальном аллергическом дерматите // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40, № 4. - С. 3-7.
Поступила 3-05-2011
