CC BY
134
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... 41
УДК 577.352.24:547.922:615.012/.014
О.В. Хугаева1, М.А. Кортава2, М.Т. Зангиева2, Е.В. Игнатьева2, А.Ю. Барышников2,
Н.А. Оборотов^, И.И. Краснюк1
ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
липосомальнои формы митоксантрона
1ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова, Москва 2ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Хугаева Ольга Вазноевна, ассистент кафедры фармацевтической технологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И. М. Сеченова
адрес: 121019, Москва, Никитский б-р, д. 13; тел. +7(925)016-5646 e-mail: khugaeva [email protected]
Статья поступила 30.09.2012, принята к печати 31.10.2012.
Резюме
Получена лиофилизированная липосомальная ЛФ митоксантрона, проведена ее стандартизация. Липосомы получали методом обращения фаз из фосфолипидов, полиэтиленгликоля и холестерина с последующей загрузкой митоксантрона против градиента сульфата аммония. Были проведены химико-фармацевтические исследования липосомального митоксантрона. Включение митоксантрона в липосомах составило 95± 3 %, размер липосом - 141± 6 нм. Была получена лиофилизированная липосомальная форма митоксантрона, устойчивая при хранении.
Ключевые слова: митоксантрон, липосомы, лиофилизация.
O.V Khugaeva1, M.A. Kortava2, M.T. Zangieva2, E.V Ignatieva2, А.Yu. Baryshnikov2, N.A. Oborotova2, I.I. Krasnuk
CHEMICAL AND PHARMACEUTICAL INVESTIGATIONS OF LIPOSOMES LOADED WITH MITOXANTRONE
1I.M.. Sechenov First Moscow State Medical University
2FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
The purpose of present work was preparation of lyophilized liposomal form of mitoxantrone and its standardization. Liposomes were prepared by reverse evaporation method using phospholipids, lipid-grafted polyethylenglycol and cholesterol with their subsequent loading by mitoxantrone based on the formation of ammonium gradient between the internal and external aqueous phase of liposomes. The chemical and pharmaceutical researches were carried out. The efficacy of mitoxantrone encapsulation in liposomes was 95± 3%, the diameter of vesicles was 141±6 nm. The lyophilized liposomal form of mitoxantrone was prepared and it was stable at storage.
Key words: mitoxantrone, liposomes, lyophilization.
Введение
С настоящее время одним из основных методов лечения онкологических заболеваний является химиотерапия, однако часто ее побочные эффекты настолько сильны, что приводят к гибели человека не от основного заболевания, а от воздействия химиопрепарата на ранее здоровые органы и системы организма. Например, применение цитостатиков сопровождается токсическими осложнениями, обусловленными поражением быстро обновляющихся, с высоким темпом пролиферации клеток кроветворных и иммунокомпетентных органов (в первую очередь костного мозга, эпителия желудочнокишечного тракта, сердечной мышцы, почек и др.) [2]. Избирательное поступление препаратов непосредственно в опухоль позволит значительно снизить побочное действие на нормальные клетки и максимально увеличить терапевтический эффект [5]. Одним из подходов в области контролируемого направленного транспорта биологически активных веществ к местам их специфического действия является использование наноконтейнеров, в частности липосом [1; 6].
Данные, накопленные специалистами за последние годы, подтверждают способность липосом
транспортировать лекарственное средство, снижать его общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект.
Разработка нового поколения лекарственных препаратов на основе липосом является стратегически важной, поскольку позволит решить многие задачи, связанные с направленной доставкой лекарственных веществ.
Липосомальные препараты обладают рядом несомненных преимуществ:
■ защищают клетки организма от токсического действия лекарственных средств;
■ пролонгируют действие введенного в организм лекарственного средства;
■ защищают лекарственные вещества от деградации;
■ способствуют проявлению нацеленной специфичности за счет селективного проникновения из крови в ткани;
■ изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их фармакологическую эффективность;
■ позволяют создать водорастворимую форму ряда лекарственных субстанций, увеличивая тем самым их биодоступность [8].
Цель исследования - разработка и химикофармацевтическое обоснование лиофилизирован-ной липосомальной лекарственной формы митоксантрона.
Материалы и методы
Препараты и реактивы
Митоксантрон1 (ООО «Синбиас Фарма», Украина);
Фосфатидилхолин2 (EPC) (Lipoid, Германия); (DSPE - PEG-2000) аммониевая соль (Avanti Polar Lipids, Inc., США);
Холестерин (AvantiPolarLipids, Inc., США); аммоний сернокислый (х. ч.), натрия хлорид (ч.), сахароза (Химмед, Россия);
HEPES3, AppliChem (Германия); глюкоза, раствор для инфузий 10 % (ОАО Биохимик, Россия); гель на основе декстрана - Sephadex G-50 superfine (Amersham Biosciences, Швеция).
Приборы и аппаратура
Испаритель ротационный BUCHI
Rotavapor R-200 (BUCHI Labortechnik AG, Швейцария),
наносайзер Nicomp 380 Sub micron
Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США),
термобаня ELMI TW-2 (ELMI Ltd., Латвия),
мини-экструдер Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США), поликарбонатные фильтры Whatman
(Великобритания),
целлюлозные мембранные фильтры
Millipore (США) диаметром 25 мм с размером пор 0,22 мкм,
хроматографические пластинки «Sorbfil» 10^10 см (Россия) марка - ПТСХ-АФ-А, аналитические (ТУ 26-11-17-89), спектрофотометр СФ-46 (ЛОМО, РФ), спектрофотометр Cary 100 (Varian, Ina, Австралия),
хроматографическая колонка C 10/20, детектор uVis-920,
рекордер REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция),
перистальтический насос Liposomat (Dianorm Gerate, Германия), рН-метр HANNA pH 211 (Hanna Instruments, Германия),
сублимационная сушка Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания), весы Sartorius LA 1200 S (Sartorius AG, Германия),
прибор Униплан (ЗАО Пикон, Россия), система очистки воды Elix 5 (Millipore
S.A.S., Франция),
весы SartoriusLA 1200 S (SartoriusAG, Германия),
весы аналитические АДВ-200 (Россия).
Получение ЛМ
Для приготовления липосом использовали метод обращения фаз. Точные навески яичного
фосфатидилхолина, холестерина, DSPE-PEG2000 растворяли в 7 мл хлороформа. Смесь переносили в круглодонную колбу вместимостью 150 мл и упаривали органический растворитель на роторном испарителе под вакуумом при температуре не выше 32±2 °С до образования липидной пленки. Пленку сушили под вакуумом в течение 40-50 мин. Далее липидную пленку гидратировали 1,5 мл 125 мМ раствора сульфата аммония при постоянном перемешивании до полного исчезновения пленки со стенок колбы и образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Для дальнейшего получения малых однослойных липосом использовали экструзионный метод, который основывается на последовательном продавливании дисперсии липосом через мембранные фильтры «Nuclepore» с диаметром пор 400; 200 и 100 нм с применением ручного мини-экструдера.
Митоксантрон (Мит) загружали в липосомы против градиента сульфата аммония. Весовое соотношение препарат : липиды составило 0,12 : 1. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при пятнадцатикратном разбавлении липосо-мальной дисперсии следующими буферами: 10 мМ HEPES; буфером, содержавшим 10 мМ HEPES и 145 мМ раствор хлорида натрия [7; 9].
Очистку липосомальной дисперсии от невк-люченного в липосомы митоксантрона проводили методом гель-фильтрации с целью количественного определения содержания препарата в везикулах, оценки эффективности его включения. На хроматографическую колонку C10/20, заполненную сефадек-сом G-50 и предварительно уравновешенную 0,15М раствором хлорида натрия в течение 1 ч (при скорости 0,3-0,4 мл/мин), наносили 1 мл липосомальной дисперсии с митоксантроном. В качестве элюента использовали 0,15М раствор хлорида натрия, скорость элюции составляла 0,5 мл/мин и регулировалась перистальтическим насосом Liposomat. Процесс очистки контролировали с помощью детектора uVis-920 с длиной волны 215 нм и рекордера REC 111, фиксировавшего разделение в виде пиков.
Количественное определение
митоксантрона в липосомах
Для определения митоксантрона в липосо-мальной дисперсии применяли стандартную спектрофотометрическую методику количественного определения вещества с использованием РСО митоксантро-на при длине волны 242±2нм.
Исследование влияния вспомогательных веществ на спектральные характеристики митоксантро-на показало, что присутствие фосфатидилхолина, холестерина, PEG2000DSPE и криопротекторов (сахарозы, глюкозы) не изменяет положения характеристического максимума. Измерение оптической плотности спиртовых растворов проводили относительно 95 %-ного этилового спирта в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм.
Содержание митоксантрона (Х, мг) рассчитывали по формуле:
D x ax C
D 0 xC 0
, где
1(1,4 - дигидрокси-5,В-бис[2-(2-гидроксиэтиламино)этиламино] - антрацен-9,10-диона дигидрохлорид)
21,2-дистеароил-Jn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]
3(N-2- гидроксиэтилпипер азин-№2 -этансульфоновая кис лота)
Б - оптическая плотность раствора образца; Б0 - оптическая плотность РСО Мит;
С - величина разбавления образца;
С0 - величина разбавления РСО Мит; а - навеска РСО Мит, мг.
Эффективность включения митоксантрона в липосомы (B, %) рассчитывали по формуле (все растворы использовали свежеприготовленными):
B = AxCi х V х Ю0% , Где
D х C х V
D1 - оптическая плотность р-ра с очищенным ЛМ;
D - оптическая плотность р-ра исходной липосомальной дисперсии;
C1 - величина разбавления фракции с очищенным ЛМ;
C - величина разбавления исходной липосомальной дисперсии;
V1 - объем фракции с очищенным ЛМ, мл;
V - объем исходной липосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл.
Качественное определение митоксантрона
в липосомах методом ТСХ
В качестве неподвижной фазы использовали пластины для ТСХ «Сорбфил» и «Кизельгель УФ -254» размером 100*100 мм; в качестве подвижной фазы: н-бутанол-уксусная кислота-вода в соотношении 12 : 3 : 5. Смесь растворителей помещали в стеклянную камеру для хроматографии, которую насыщали в течение 2 ч. В качестве испытуемых растворов использовали: раствор липосомального митоксантрона, пустых лиофилизированных липо-сом, трех образцов лиофилизированного липосо-мального митоксантрона в смеси растворителей хло-роформ-метанол-вода в соотношении 65 : 25 : 4 (растворитель). Для этого, массу навески представленных образцов помещали в колбу объемом 10 мл, прибавляли 5 мл растворителя, перемешивали до полного растворения образцов (испытуемый раствор). В качестве растворов сравнения использовали растворы митоксантрона, холестерина, яичного фосфатидилхолина, сахарозы и свежеприготовленного липосомального митоксантрона. Для этого по 5 мл вышеперечисленных веществ помещали в колбу объемом 10 мл, прибавляли 5 мл растворителя и перемешивали до растворения (растворы сравнения).
По 5 мкл растворов сравнения и испытуемых растворов наносили на линию старта хроматографической пластины. Пластину хроматографировали восходящим путем. Длина пути продвижения пятна: 100 мм (старт - фронт). Пластину высушивали при комнатной температуре до удаления запаха растворителей и опрыскивали раствором анисового альдегида (0,5 мл анисового альдегида смешивали с 10 мл ледяной уксусной кислоты, В5 мл метанола, 5 мл концентрированной серной кислоты).
После обработки пластину помещали в сушильный шкаф и нагревали в течение 10 минут при температуре 100-105 “С.
Растворы сравнения на хроматограмме представлены следующим образом (рис. 1):
1. Холестерин - 1 зона с Rf -0,98.
2. Яичный фосфатидилхолин -1 зона с Rf -0,48.
3. Сахароза - 1 зона Rf-0,35.
4. Митоксантрон -1 зона сRf -0,10.
5. Свежеприготовленный ЛМ - 3 зоны с
Rf-0,10 (холестерин); -0,48 (яичный фосфатидилхолин); -0,98 (митоксан-
трон).
6. Пустые лиофилизированные липосомы -3 зоны с И-0,98(холестерин); -0,48 (яичный фосфатидилхолин); -0,35 (сахароза).
Испытуемые растворы представлены на хроматограмме следующими зонами (см. рис. 1):
ш Образец № 1: 4 зоны на уровне зон ми-токсантрона, яичного фосфатидилхоли-на, холестерина и сахарозы. ш Образец № 2: 4 зоны на уровне зон ми-токсантрона, яичного фосфатидилхоли-на, холестерина и сахарозы. ш Образец № 3: 4 зоны на уровне зон ми-токсантрона, яичного фосфатидилхоли-на, холестерина и слабовыраженная зона сахарозы.
Лиофилизация ЛМ
Липосомальную дисперсию с митоксантроном дозировали по 2 мл во флаконы вместимостью 20 мл (толщина слоя составляла 8-9 мм), замораживание и сублимационную сушку проводили в установке Minifast DO.2. В случае режима I замораживания (по-стадийного) препарат загружали на полки сублимационной камеры при температуре +20 “C, охлаждали их до -24 “C и выдерживали 1,5 ч (стадия 1). Далее полки охлаждали от -24 “C до -34 “C и выдерживали еще 1,5 ч (стадия 2), затем понижали температуру полок от -34 “C до -50 “C и после достижения препаратом температуры -40.. .-45 “C выдерживали его в течение 3 ч при данной температуре (стадия 3). В случае режима II замораживания липосомальную дисперсию с митоксантроном загружали на полки сублимационной камеры, охлажденные до -50 “C, и после достижения препаратом температуры -40.-45 “C выдерживали его в течение 3 ч при данной температуре. Далее полки выдерживали при -50 “C и минимальном давлении в камере (4,0-6,0)*10-2 мБар в течение 1 ч и нагревали от -50 “C до +20 “C со скоростью 6 “C/ч (сублимационная сушка). После достижения препаратом температуры +20 “C (минимальное давление в камере 4,0*10-2 мБар) его выдерживали при этой температуре в течение 3 ч (досушивание). В целом лиофилизация продолжалась 22 ч. По окончании процесса сушки вакуум в сублимационной камере гасили чистым стерильным воздухом, пропущенным через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Флаконы с готовым препаратом выгружали из камеры, укупоривали резиновыми пробками, обкатывали алюминиевыми колпачками и, предварительно проанализировав, помещали в морозильную камеру при температуре -18 “C [4].
По внешнему виду лиофилизат как в случае режима I, так и в случае режима II замораживания представлял собой сухую пористую массу синего цвета. Остаточная влажность составила 0,86 % в случае режима I и 0,89 % в случае режима II замораживания. Содержание митоксантрона в липосомах и размеры везикул за время хранения препарата в замороженном состоянии практически не изменились (табл. 1). Способ замораживания (быстрое или постадийное) не влиял на размеры липосом и включение в них миток-сантрона. После сублимационной сушки и в случае режима I, и в случае режима II замораживания размеры частиц практически не изменились, однако наблюдалось вытекание препарата из везикул, которое составило около 11 % для обоих режимов.
Таким образом, для получения липосомаль-ной лекарственной формы митоксантрона подходит как режим I, так и режим II замораживания. В дальнейшем при производстве лиофилизированно-го продукта использовали постепенное замораживание полок сублимационной камеры Minifast DO.2 от +20 “C до -50 “C и постепенное замораживание препарата на полках до -40 .-45 “C с выдержкой при этой температуре в течение 3 ч.
44 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...
Ri=0.98
Rf=0,48
І
<^~^> Rt»0,35
І „ „„„
T Ri=0,10
1 2 3 4 5 6 №1 №2 №3
Рис. 1. ТСХ лиофилизированного ЛМ на пластинке «Sorbfil» в системе хлороформ - метанол - вода (65:25:4).
Рис. 2. Спектр выхода фракции:
1-й пик: липосомальная форма митоксантрона;
2-й пик: «свободный» митоксантрон.
REL INT-WT GAUSSIAN DISTRIBUTION
100 • L
80
-
60 L: --
40 20 =
----- ■ . ’ ...1. .„1” r
1 L : • і
1 L , , ■.=
10 20 SO 100 200 500 IK
Diam. (nm' ->
10 20 Diam. (пґп) ->
100 200 500 IK
Intensity Weighting:
Mean Diameter = 163,8 run Stnd Deviation^ 18.8 nm
Cumulative Result:
25 % of distribution < 140.1 nm
50 % of distribution < 152,1 run
75 % of distribution < 166.1 nm
90 % of distribution < 175-6 nm
99 % of distribution < 198-6 nm
Volume Weighting:
Mean Diameter = 166.0 nm Stnd Deviation = 19.1 nm
Cumulative Result:
25 % of distribution <
50 % of distribution <
75 % of distribution <
90 % of distribution <
99 % of distribution <
1-41.6 nm
154*6 nm
167.9 nm
180*1 nm
199.3 nm
Рис. 3. Средний размер частиц с липидным соотношением ФХ:ХОЛ:тРБО2000-Б8РБ (11:9:1) после экструзии через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 100 нм.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ... 45
Таблица 1
Эффективность включения митоксантрона в лиофилизированные липосомы и размеры везикул серий: 251109, 011209,031209__________________________________________________________________________________
Серия препарата Препарат Включение Мит в Л, % 0 Мит-Л, нм
251109 Липосомы с Мит перед лиофилизацией 92,7 148 ± 7
Лиофилизированные липосомы с Мит после регидратации 84,0 157 ± 5
011209 Липосомы с Мит перед лиофилизацией 98,3 150 ± 5
Лиофилизированные липосомы с Мит после регидратации 86,5 162 ± 8
031209 Липосомы с Мит перед лиофилизацией 96,1 142 ± 9
Лиофилизированные липосомы с Мит после регидратации 88,4 154 ± 5
Таблица 2
Влияние липидного состава на эффективность включения митоксанті рона и размер липосом
№ Состав Молярное соотношение Включение, % 0 везикул, нм
1 ФХ :ХОЛ :тРЕ02000-В8РЕ 11: 9: 1 95± 3 141 ± 6
2 ФХ :ХОЛ :тРЕО2000-Б8РЕ 11: 9: 0,5 89±2 142 ± 7
3 ФХ:Х0Л:тРЕ02000-Б8РЕ 11: 6,2: 0,4 73±6 136 ± 10
4 ФХ:ХОЛ:тРЕ02000-Б8РЕ 11: 3: 0,3 65±8 158 ± 5
5 ФХ:ХОЛ:тРЕ02000-Б8РЕ 11: 11: 0,5 58±5 170 ± 9
Таблица 3
Выбор оптимального соотношения препарат : суммарные липиды
№ Весовое соотношение препарат: липиды Концентрация митоксантрона в дисперсии, мг/мл Включение митоксантрона в липосомы, %
1 0,12 : 1 2 95± 3
2 0,2 : 1 1 89±2
3 0,02 : 1 0,38 73±6
4 0,24 : 1 2 65±8
5 0,4 : 1 2,2 58±5
Таблица 4
Оценка воспроизводимости количественного определения митоксантрона в I фракции методом спектрофотометрии
Серия препа- рата Оптическая плотность, I фракция Содержание Мит в Л, мг/мл Метрологические характеристики Эффективность включения % Метрологические характеристики
260209 0,588 0,587 0,587 0,588 0,586 1.9502 1,9567 1,9278 1.9502 1,9404 х =1,9451 =0,0001 Бх=0,0113 8х =0,0050 Л х =0,0190 Є =0,0140 97.51 97,83 96,39 97.51 97,02 х =97,2531 82 =0,3187 Бх=0,5645 8- =0,2525 Л - =0,9484 Є =0,7009
110310 0,553 0,556 0,554 0,554 0,553 1,9506 1,9716 1,9645 1,9439 1,9715 х =1,9604 Б2 =0,0002 Бх=0,0126 8- =0,0056 Л х =0,0212 Є =0,0156 97,53 98,58 98,23 97,19 98,57 х =98,0213 82 =0,3971 Бх=0,6301 8- =0,2818 Л х =1,0586 Є =0,7823
Таблица 5
Количественный анализ липосомальной формы митоксантрона с криопротектором до и после лиофилизации.
Криопротектор Содержание Мит в липосомах, % Содержание лиофили-зированного Мит в липосомах, % Содержание Мит в липосомах, мг/мл Содержание лиофи-лизированного Мит в липосомах,мг/мл
4% глюкозы 72,2 43,6 2,07 1,3
3% сахароза 96,2 45,1 1,92 0,90
4% сахароза 95,7 88,4 1,91 1,77
6% сахароза 90,2 62,5 1,80 1,25
8% сахароза 98,3 54,8 1,97 1,10
Анализ эффективности инкапсулирования ми-токсантрона в липосомы показал, что содержание митоксантрона в везикулах не менялось и оставалось в пределах ~84-88 % на протяжении шести месяцев хранения липосомальных дисперсий в морозильной камере при температуре -18 °С. Еще через шесть месяцев хранения дисперсий при данной температуре включение цитостатика в липосомы снизилось на 2-4 %.
Результаты и обсуждение
Oсновными технологическими задачами в процессе разработки липосомальной формы митоксантро-на были поиск оптимального соотношения липидной композиции и отработка метода максимального включения препарата в липосомы. В качестве основного компонента липосом выбрали яичный фосфатидилхо-лин. Oднaко, известно, что липосомы, состоящие только из фосфатидилхолина, отличаются низкой стабильностью и высокой степенью утечки препарата [3]. Для придания необходимой «жесткости» добавили холестерин, который стабилизирует липидный бислой, снижает его проницаемость и, следовательно, предотвращает утечку препарата. Для стерической стабилизации липосом использовали ПЭГ, конъюгированный с фосфатидилэтаноламином, так как он является универсальным стабилизатором, действующим независимо от липидного состава липосом, и обладает рядом полезных свойств, таких как гибкость, устойчивость к опсо-низации, отсутствие токсичности, иммуногенности. Было наработано 5 моделей липосом, отличающихся по липидному составу (табл. 2). Как видно из табл. 2, липосомальная дисперсия, состоящая из ФХ : ХOЛ : mPEG2000-DSPE в соотношении (11 : 9 : 1) показала наиболее высокую эффективность включения Мит, и имела более однородный состав липосом, что может быть связано с более высоким содержанием в составе липосом полиэтиленгликоля. Включение Мит в липосомах составило 95і3 %; размер липосом - 141і6 нм. В табл. 3 представлены данные подбора оптимального соотношения препарата и липидов. Увеличение количества включаемого препарата вызывало снижение процента включения митоксантрона, это может быть связано со свойственной изучаемому препарату агрегацией при высоких его концентрациях (Модель № 4). Наиболее высокий процент включения наблюдали при использовании весового соотношения (препарат: липиды) 0,12 : 1. Липосомальная дисперсия под № 1 была выбрана для изучения терапевтического эффекта в сравнении с субстанцией митоксантрона. Следующим этапом после получения липосомальной дисперсии Мит, являлась очистка липосомальной дисперсии от невключенного в липосомы Мит методом гель-фильтрации. Контроль разделения фракций осуществляли с помощью проточного спектрофотометра UVis-920. На выходе получали две фракции (рис. 2).
Измельчение проводили методом экструзии путем многократного продавливания липосомаль-ной дисперсии через мембранные фильтры при помощи высокого давления. Средний диаметр липо-сом составил 141і6 нм (рис. 3).
Oценку эффективности включения Мит в ли-посомы проводили путем определения общего содержания Мит в исходной липосомальной дисперсии, внесенной в колонку, а так же в I и II фракциях, полученных на выходе из колонки. Была проведена проверка соблюдения закона Бугера-Лам-берта-Бера для спиртового раствора субстанции Мит при v 242 нм, а так же исследовано влияния вспомогательных веществ на спектральные характеристики Мит. Установили, что присутствие фосфатидилхолина, холестерина, PEG2000DSPE, и криопротектора практически не влияло на поглощение Мит, и не мешало его спектрофотометрическому определению.
В табл. 4 представлены некоторые результаты количественного определения Мит во фракциях, собранных после гель-фильтрации. Методика спектрофотометрического определения достаточно чувствительна, обладает высокой точностью и воспроизводимостью, при этом ошибка определения среднего результата не превышает 1,0і0,05%. Были изучены влияние процесса замораживания и сублимации на структуру липосомальной формы Мит при добавлении криопротектора. В качестве криопротектора применяли сахарозу, глюкозу и лактозу.
После лиофилизации липосомальной формы Мит с 4 %-ной глюкозой из везикул вытекло 28,6% препарата. При добавлении спирта к лиофилизиро-ванной липосомальной дисперсии с 4% лактозой, выпадал белый мутный осадок, что затрудняло дальнейшее количественное определение митоксантрона. Наиболее подходящим для замораживания и лиофи-лизации липосомальной формы Мит был выбран криопротектор - 4 %-ная сахароза, т. к. при данной концентрации сахарозы, после лиофилизации потеря препарата составляла всего 7 % (табл. 5).
Выводы
1. В результате химико-фармацевтических исследований был получен и обоснован состав для липосомальной формы ми-токсантрона.
2. Oптимизировaнa технология получения липосомальной формы митоксантрона.
3. Разработаны методики для качественного и количественного определения ми-токсантрона в липосомах.
4. Получена лиофилизированная форма ли-посомального митоксантрона, устойчивая при хранении.
Литература
1. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов // Вестник РАМН. - 2012. - №3. - С. 23-32.
2. Барышников А.Ю., Оборотова Н.А. Липосомальные лекарственные формы в клинической онкологии // Успех современной биологии.
- 2001. - Т. 121, № 5. - С. 464-75.
3. Дудниченко А.С. Липосомальные препараты и другие модификаторы химиотерапии при раке желудочно-кишечного тракта. Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. - Киев, 1996. -33 с.
4. Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л. Химико-фармацевтическая стандартизация лиофилизированной термозависимой липо-сомальной лекарственной формы доксорубицина (ТЛЛФД-лио) // РБЖ. - 2006. - Т. 5, № 1, С. 14.
5. Оборотова Н.А. Липосомальные лекарственные формы противоопухолевых препаратов (обзор) // Химико-фармацевтический журнал.
- 2001. - Т. 35, № 4. - С. 32-8.
6. Оборотова НА., Багирова В.Л., Рышкова Н.Е. Липосомальные лекарственные формы цитостатиков.. .//Ведомости Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств Минздрава России. - 2000. - № 1(4). - С. 86-90.
7. Тазина Е.В., Костин К.В., Оборотова Н.А. Особенности инкапсулирования лекарственных препаратов в липосомы. Химикофармацевтический журнал. - 2011. - Т. 45, № 8. - С. 30-40.
8. Швец В.И., Краснопольский Ю. М. Липосомы в фармации. Продукты нанобиотехнологии // Провизор. - 2008. - № 3. - С. 18-24.
9. Barenholz Y., GiladH. Method of amphiphatic drug loading in liposomes by ammonium ion gradient. United States Patent № 5.316.771; May 31, 1994.
