CC BY
60
УДК 547.9:612.397:678.012
липоСомлльнля форма столбнячного анатоксина. методы получения и оценки
Е. А. Хволис, В. Н. Сперанская
Пермская государственная фармацевтическая академия, г. Пермь
В настоящей работе представлены данные по инкапсулированию в липосомы методом выпаривания в обращенной фазе столбнячного анатоксина, что является перспективным для создания его пер-оральной лекарственной формы. В результате исследований подобрано оптимальное соотношение липид (лецитин)/анатоксин для получения стабильной липосомальной формы, установлено сохранение специфической активности анатоксина при включении в липосомы. для изучения специфической активности и стабильности при хранении полученных липосомальных дисперсий использована реакция коагглютинации.
Ключевые слова: липосомы, липидные везикулы, столбнячный анатоксин, выпаривание в обращенной фазе, реакция коагглютинации.
вВЕДЕНИЕ
В настоящее время более 50% фармацевтических компаний-производителей используют нанотехнологии для разработки систем доставки лекарственных веществ к органам и тканям-мишеням. Эти препараты дают сегодня 80% оборота мировой наномедицины. Одной из перспективных лекарственных форм, относящихся к средствам доставки лекарственных препаратов 3—4-го поколения, являются липосомы, мембрана которых состоит из природных фосфолипидов, что определяет их многие привлекательные качества [9].
Применение липосом для активной иммунизации, по мнению большинства исследователей, способно усилить действие вакцин. В этом случае антигены, ассоциированные с липосомами, попадают непосредственно в антигенпредставляющие клетки [11].
Разработанная вакцина «Инвивак» для профилактики гриппа представляет собой сферические частицы с двойным липидным слоем, при этом гликопротеины внешней поверхности вируса гриппа — гемагглютинин и нейраминидаза — крепятся в этой липидной оболочке, т. е. виросомальная частица имитирует натуральный вирус. Такая виросомаль-ная вакцина является эффективной и безопасной. Она обладает уникальным двойным механизмом действия: вызывает стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета. Для лиц с ослабленной иммунной системой это может быть важным дополнительным преимуществом липосомального препарата.
Хотя в большинстве исследований липо-сомы использовались для системной иммунизации, имеются работы, свидетельствующие об их успешном применении для вакцинации через слизистые желудочно-кишечного тракта (вакцина эшерихиозная, шигеллезная Флекснера) и верхних дыхательных путей [8].
Вакцинация при ряде инфекционных заболеваний является одним из наиболее эффективных профилактических мероприятий. успех вакцинации определяется качеством выпускаемых бактерийных и вирусных препаратов. В СшА проведены исследования по созданию оральных вакцин на основе липо-сом против шигеллы и патогенных E. coli, менингококковой вакцины, липосомальной гриппозной вакцины из гемагглютинина. В швейцарии разработаны поливалентные липосомальные вакцины против нескольких штаммов гриппа (сингапурский, пекинский, ямагата), гепатита А и В [7].
липидные везикулы химически инертны, универсальны, биосовместимы с природными мембранами клеток и биодеградируемы. В публикациях указывается на практическое отсутствие токсического и аллергического воздействия липосом на организм. Важной особенностью липидных везикул является их способность «адресно» доставлять лекарственные вещества в пораженные области, а также пролонгировать действие инкапсулированных лекарственных веществ и защищать содержимое липосом от воздействия биосред [1].
В литературе описаны различные методы получения липосом: выпаривание в обращенной фазе, ручное встряхивание, озвучивание, этанольная инжекция, экструзия, спонтанная везикуляция липидов, микро-флюидизация, сушка распылением, замораживание-оттаивание, гомогенизация при высоком давлении, диализ [7]. Разработаны способы получения магнитоуправляемых липосомальных форм препаратов [5].
Комбинация методов обращения фаз и замораживания-оттаивания использована для формирования липосом диглицеридного производного метотрексата [2]. Выпаривание в обращенной фазе и воздействие ультразвука были применены исследователями для инкапсулирования в липидные везикулы доксо-рубицина [3, 4]. 110
Везикулы, полученные разными методами, гетерогенны по размеру. Наиболее крупные липосомы образуются в результате использования способа ручного встряхивания. Обработанные ультразвуком липо-сомы однородны по размеру и очень мелкие (не более 15 нм). Метод обращения фаз обеспечивает максимальный процент включения лекарственного препарата во внутренний объем липосом. данный способ технологичен, позволяет включать в липосомы как гидрофильные, так и гидрофобные вещества. Известно, что этот метод дает возможность инкапсулировать до 80% гидрофильных веществ. Кроме того, он позволяет максимально избежать загрязнения липид-ных везикул посторонней микрофлорой, возможна частичная автоматизация процесса [12].
В настоящей работе предпринята попытка инкапсулирования в липосомы столбнячного анатоксина, что является перспективным для создания пероральной лекарственной формы этого анатоксина.
Цель работы — отработка способа получения липосомальной формы столбнячного анатоксина (АС-анатоксин) методом выпаривания в обращенной фазе и исследование стабильности и специфической активности полученной липосомальной дисперсии.
мАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве липидной основы использовали лецитин-стандарт производства зАО «Биолек» (г. харьков). для инкапсулирования применяли анатоксин столбнячный очищенный концентрированный жидкий (ФГуП «НПО «Микроген» Мз РФ «Пермское НПО «Биомед»). липосомы получали методом выпаривания в обращенной фазе. Использовалась пассивная технология инкапсулирования, предусматривающая одновременное
диспергирование лекарственного вещества и липида в водном буфере, при этом достигалось одновременное образование липосом с включением в них лекарственного вещества. Изучение стабильности проводили путем центрифугирования липосомальных дисперсий при скорости 1500 об/мин в течение 5 минут. Для определения специфической активности анатоксина и его липосо-мальной дисперсии использовали реакцию коагглютинации (РКОА) [10]. Учет результатов РКОА проводили по 4-крестной системе: ++++ — полная коагглютинация; +++ — хорошо выраженная коагглю-тинация;
++ — неполная коагглютинация; — — отсутствие коагглютинации.
Результаты и их обсуждение
По внешнему виду полученные липосомы столбнячного анатоксина представляют собой однородные молочно-белые эмульсии без признаков расслоения. Нами было отмечено, что «пустые» липосомальные дисперсии имеют аналогичный внешний вид. Сравнивали степень расслоения липосо-мальных дисперсий лецитин/анатоксин в следующих соотношениях: 1:1; 1:2; 1:3; 1:4; 1:5; 1:6; 1:7. Исследование стабильности липосом показало, что наименьшая степень расслоения отмечена для липосомаль-ных дисперсий с соотношением липид (ле-цитин)/анатоксин 1 : 1.
С помощью РКОА оценивали специфическую активность липосомальных дисперсий анатоксинов и надосадочных жидкостей, полученных в результате расслоения дисперсий, центрифугируя при скорости 3000 об/мин в течение 15 минут. Центрифугирование проводили с целью выявления в надосадочной жидкости анатоксина, не заключенного во внутренний объем липосом.
Компоненты липосомальной дисперсии были инертны по отношению к коагглютина-ционному столбнячному реагенту. В качестве положительного контроля РКОА использовали очищенный столбнячный анатоксин, в качестве отрицательного контроля — «пустую» липосомальную дисперсию.
По результатам РКОА, в надосадочной жидкости анатоксин отсутствовал, липосо-мальная дисперсия сохраняла специфическую активность. При данных условиях центрифугирования исследуемая дисперсия расслаивалась, но нарушения целостности липосом не наблюдалось, что свидетельствует об их достаточной механической прочности.
По индикации в РКОА не включившегося в липосомы анатоксина определяли специфическую активность липосомальной дисперсии. По результатам РКОА провели сравнение специфической активности липосо-мальных и нелипосомальных форм столбнячного анатоксина. С помощью РКОА в предварительных опытах было показано сохранение специфической активности липо-сомальных дисперсий анатоксина.
Специфичность полученных результатов титрования подтверждается отсутствием реакции в отрицательном контроле: «пустая» липосомальная дисперсия не образует коаг-глютинатов со столбнячным реагентом. В надосадочной жидкости не связанного с липосомами анатоксина не обнаружено.
выводы
Исходя из полученных данных можно предположить, что анатоксин при выбранном соотношении полностью связывался с липосомами, поскольку после центрифугирования полученной липосомальной дисперсии в надосадочной жидкости он не был
обнаружен. Вероятно, анатоксин находится внутри липосомы и на ее поверхности, так как исследуемая дисперсия образует четко выраженные коагглютинаты со специфическим реагентом.
Наши предположения подтверждаются данными литературы, согласно которым при получении липосомальных форм белковых соединений молекулы белка могут не только заключаться в липосомы, но и находиться на их поверхности. Исследователи также сообщают, что эти два механизма могут иметь место одновременно, т. е. часть вещества белковой природы может включиться в липид-ные везикулы, а часть — связаться с их поверхностью [6].
Таким образом, в проведенных экспериментах подобрано оптимальное соотношение липид (лецитин)/АС-анатоксин и получена стабильная липосомальная дисперсия с сохранением специфической активности столбнячного анатоксина при включении его в липосомы на основе лецитина.
бИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Андреева И. Н. Липосомальные лекарственные препараты: функциональные свойства и преимущества/И. Н. Андреева//Новая аптека.— 2004.— № 5.— С. 58—62.
2. диглицеридное производное метотрекса-та: синтез и цитостатическая активность в составе адресных липосом/Е. Л. Водовозо-ва, Г. П. Гаенко, Е. С. Бобрикова и др.//Хими-ко-фармацевтический журнал.— 2007.— Т. 41.— № 6.— С. 10—14.
3. Инкапсулирование доксорубицина в ли-посомы, содержащие фосфатидилэтанол. I. Физико-химическая характеристика и противоопухолевая активность жидкокристаллических липосом/М. Б. Жукова, М. А. Кисель, Б. Б. Кузмицкий и др.//Химико-фармацевтический журнал.— 2006.— № 1.— С. 31—33.
112
4. Инкапсулирование доксорубицина в ли-посомы, содержащие фосфатидилэтанол. II. Физико-химическая характеристика и противоопухолевая активность «твердых» липосом/С. В. Бабицкая, А. П. Власов,
B. И. Долгопалец и др.//Химико-фарма-цевтический журнал.— 2006.— № 2.—
C. 37—39.
5. Исмаилова Г. К Биотехнология получения магнитоуправляемых липосом/ Г. К. Исмаилова, В. И. Ефременко, А Г. Крегян//Химико-фармацевтический журнал.—2005.— Т. 39.— № 7.— С. 47—49.
6. Липосомы в биологических системах: Пер. с англ./Под ред. Г. Грегориадиса и А. Аллисона.— М.: Медицина, 1983.— 384 с.: ил.
7. липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ/А. Р. Каплун и др.//Вопросы медицинской химии.— 1999.— Т. 1.— http:// medi ru/pbmc/8890101.htm.
8. Матвиенко П. В. Липосомы — «скафандры» для лекарств/П. В. Матвиенко// Провизор.— 2004.— № 15//http://www. provisor.com.ua/ archive/2004/№ 15/art 25htm.
9. Пальцев М. А. Нанотехнологии в медицине и фармации/М. А. Пальцев//Реме-диум.—2008.— № 1.— С. 6—9.
10. Петровских В. П. Серологическая диагностика и дифференциация ботулини-ческих токсинов-анатоксинов типов А, В и Е: дис. ... канд. биол. наук.— Пермь, 1998.
11. Перспективы применения липосомаль-ных препаратов в медицинской практике/Я. Б. Бажутин//Terra medica.— 2003.— № 3.— С. 3—6.
12. Эффективность наружного применения новой магнитоуправляемой липосомаль-ной формы преднизолона при экспериментальном аллергическом дерматите/ Г. К. Исмаилова//химико-фармацевти-ческий журнал.— 2006.— Т. 40.— № 4.— С. 3—7.
E. A. Khvolis, V. N. Speranskaya
LIPOSOMAL FORM OF TETANUS ANATOXIN. METHODS OF OBTAINING AND ASSESSMENT
Data on liposomally incapsulated tetanus anatoxin obtained with the method of evaporation in reverse phase are presented. It is perspective for making its peroral drug form. As a result of investigation, optimal lipid (lecithin) anatoxin ratio intended to obtain a stable liposomal form was chosen. Specific activity of anatoxin included into liposomes was found to
be preserved. Coagglutination reaction was used to study specific activity and stability of liposome dispersions in storage.
Keywords: liposomes, lipid vesicles, tetanus anatoxin, evaporation in reverse phase.
Контактная информация: Хволис Елена Азиковна, канд. биол. наук, доцент кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Пермской государственной фармацевтической академии, 614000, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел. 8 (342) 282-58-42
Материал поступил в редакцию 03.03.2009
